Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

التصور من الخلايا اللمفاوية معربا-22-IL عن طريق الفئران مراسل

Published: January 25, 2017 doi: 10.3791/54710
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular Immunoregulation, Cancer and Inflammation Program, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Abstract

وقد استخدمت الفئران مراسل نطاق واسع لمراقبة توطين التعبير عن الجينات المستهدفة. ويركز هذا البروتوكول على وضع استراتيجية لإنشاء نموذج جديد الماوس مراسل المعدلة وراثيا. لقد اخترنا لتصور انترلوكين التعبير الجيني (IL) 22 لأن هذا خلوى ديه الأنشطة الهامة في الأمعاء، حيث أنه يساهم في إصلاح الأنسجة التالفة من الالتهابات. أنظمة مراسل توفر مزايا كبيرة على غيرها من أساليب تحديد المنتجات في الجسم الحي. في حالة IL-22، وكانت دراسات أخرى معزولة أولا الخلايا من الأنسجة ومن ثم إعادة حفز-الخلايا في المختبر. IL-22، الذي يفرز بشكل طبيعي، كان محاصرا داخل الخلايا باستخدام المخدرات، وكان يستخدم تلطيخ الخلايا إلى تصور ذلك. ويحدد هذا الأسلوب خلايا قادرة على إنتاج IL-22، ولكنها لا تحدد ما إذا كانوا يفعلون ذلك في الجسم الحي. تصميم مراسل يشمل إدخال جين لبروتين فلوري (tdTomato) في الجين IL-22 في مثل هذا واذ أن بروتين فلوري لا يمكن أن يفرز وبالتالي لا يزال محاصرا داخل الخلايا المنتجة في الجسم الحي. ويمكن بعد ذلك المنتجين الفلورسنت أن تصور في أقسام الأنسجة أو خارج الجسم خلال تحليل التدفق الخلوي. وشملت عملية البناء الفعلية لمراسل recombineering كروموسوم اصطناعي البكتيرية التي تحتوي على الجينات IL-22. ثم تم عرض هذا الكروموسوم هندسيا في جينوم الفأر. وقد لوحظ التماثل الساكن IL-22 تعبير المراسل في أنسجة مختلفة الماوس، بما في ذلك الطحال والغدة الصعترية، والعقد اللمفاوية، والتصحيح باير ل، والأمعاء، من خلال تحليل التدفق الخلوي. وقد الناجم عن التهاب القولون عن طريق الخلايا التائية (CD4 + CD45RBhigh) نقل، وتصور التعبير مراسل. كانت خلايا T إيجابية الحالي لأول مرة في الغدد الليمفاوية المساريقي، وبعد ذلك تراكمت داخل الصفيحة المخصوصة الأمعاء والقولون الأنسجة الصغيرة البعيدة. الاستراتيجية باستخدام البكالوريا أعطى التعبير مراسل جيدة الدقة مقارنة IL-22 مورينداتاهيتيانونيسيون، وأنه هو أبسط من الإجراءات تدق في.

Introduction

نوع محدد خلية التعبير عن الجينات مراسل مفيد لتحديد الخلايا معربا بنشاط الهدف في الأنسجة تحت الدول التماثل الساكن وإرتباك. كما يسمح لتنقية هذه الخلايا، التي لا تزال قابلة للحياة، لدراسة خصائص الأخرى. وقد استخدمت الفئران مراسل في توضيح آلية عمل لالسيتوكينات محددة، عوامل النسخ، والعناصر التنظيمية. الاستراتيجيات السابقة 1، 2، 3 اعتمدت إلى حد كبير على ضرب مراسل في مكان الهدف في كروموسوم الماوس، وهو إجراء يستغرق وقتا طويلا ومكلفا. وهكذا، فإن أبسط طريقة لتوليد الفئران مراسل أمر مرغوب فيه.

السيتوكينات هي فئة واسعة من الصغيرة، وبروتينات يفرز / الببتيدات التي تنظم الاستجابات المناعية من خلال الإشارات بين الخلايا. انترلوكين 22 (IL-22) هو خلوى مع العديد ذكرت الأنشطة، بما في ذلك الحاجز فوnction، وإصلاح الأنسجة، والتهاب 4. وعلى الرغم من IL-22 اكتشفت في البداية كمنتج خلايا T 5، أظهرت تقارير لاحقة التعبير عنها في الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) في البشر والفئران 6 7 و في فصول أخرى من الخلايا الليمفاوية الفطرية 8. وعلى الرغم من مراقبة شاملة من الخلايا المنتجة-22-IL، تصور IL-22 مطلوبا من قبل التحفيز خارج الحي وpermeabilization إلى البقع مع الأجسام المضادة. ولذلك، فإن رواية IL-22 الفئران مراسل تكون أداة مفيدة جدا للتحقيق وظيفة IL-22 في عمليات التماثل الساكن والمسببة للأمراض.

هنا، قمنا بتطوير نموذج مراسل الماوس المعدلة وراثيا مبسط لمراقبة الخلايا المنتجة للIL-22 في المجراة في المختبر. باستخدام طريقة BAC recombineering 9، نحن إدراج تسلسل tdTomato كدنا] مع بولي وشظايا إشارة إلى الموضع IL-22لنا واستبدال اكسون 1. لم أقلقت المناطق، الإكسونات، وعناصر تنظيمية أخرى غير مترجمة، لأننا نود أن تحاكي تنظيم الطبيعي للIL-22 قدر الإمكان. موقع الإدراج مراسل يعطل تسلسل إشارة، مما أدى إلى تراكم لمراسل داخل الخلايا المنتجة، على عكس IL-22 في حد ذاته، الذي يفرز بسرعة. ويمكن أيضا أن تطبق هذه الطريقة الجديدة للجيل من الفئران مراسل للبروتينات يفرز أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتلقى جميع الحيوانات الرعاية المناسبة وفقا للإجراءات التجريبية المحددة في دليل عام 2011 لرعاية واستخدام الحيوانات لجنة مختبر المختبر الوطني فريدريك لأبحاث السرطان.

1. جيل من الفئران مراسل IL-22-tdTomato التي كتبها BAC Recombineering

ملاحظة: يجب أن تكون الفئران فاقد الوعي ولا تتحرك استجابة لحافز الضارة. تعقيم المنطقة الجراحية مع 70٪ من الإيثانول وتعقيم جميع الأدوات الجراحية باستخدام معقم الزجاج حبة.

  1. تنقية BAC الحمض النووي (RP23-401E11، طول استنساخ 228391 بت في الثانية) باستخدام طريقة استخراج القلوية 10 و 11. تميز استنساخ BAC التي كتبها SpeI هضم 5 ميكروغرام من RP23-401E11 للتأكد من حجم الصحيح من الجين المستهدف. ملاحظة: تم هضمها وBAC الحمض النووي في 14 أجزاء.
  2. إدراج الجينات مراسل TdTomato في الموقع ليس I / سال الأول من ناقلات المكوك PLD53SC-A-GFP-B11 واستبدال الجين GFP في نفس الموقع. ثم، وذلك باستخدام BAC RP23-401E11 كقالب، تضخيم صناديق التماثل (A و B) لأول اكسون مترجمة من ايل 22 (اكسون 1) بواسطة PCR (95 ° C 2 دقيقة و 30 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، وتمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة). في 50 ميكرولتر نظام رد فعل PCR، إضافة 50 نانوغرام (1 ميكرولتر) من BAC الحمض النووي، و 0.5 ميكرولتر الاشعال (10 ميكرون)، 40 ميكرولتر من PCR SUPERMIX الدقة العالية، و 8 ميكرولتر من H 2 O.
    ملاحظة: الاشعال لمربعات A و B هي كما يلي: مربع إلى الأمام: 5'- تي GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG وعكس و: 5'- CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC. مربع B إلى الأمام: 5'- G TTAATTAA CTGCCCGTCAACA وعكس و: 5'- تي GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10. وأكد مواقع الانزيمات التقييد (تصاعدي الأول وباك الأول).
  3. Ligate 500 نانوغرام من هضمها I-تصاعدي وو 500 نانوغرام من fragm ب هضمها I-باكالوالدان إلى 50 نانوغرام من PLD53SC-ادارة النقل الجوي (tdTomato) ناقلات في 16 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  4. تحويل ناقلات PLD53SC-ادارة النقل الجوي النقي إلى خلايا BAC المختصة 11 و ثقافة لهم على لوريا، Bertani (LB) أجار لوحات مع الكلورامفينيكول (20 ميكروغرام / مل)، والأمبيسلين (30 ميكروغرام / مل) عند 37 درجة مئوية. اختيار 02:58 المستعمرات المشترك دمج من لوحات رئيسية الفصل / أمبير.
  5. تطعيم كل مستعمرة في 1 مل من LB تستكمل مع 20 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول واحتضان لهم لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية و 225 دورة في الدقيقة. نشر 100 ميكرولتر من كل الخليط على لوحة LB-أجار (10 غرام من ببتون 140، 5 غ من خلاصة الخميرة، و 12 غراما من أجار، و 1 لتر من الماء، ودرجة الحموضة 7.5) تستكمل مع الكلورامفينيكول و4-4،5٪ من السكروز. احتضان الثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  6. اختيار كل من المستعمرات الكبيرة والصغيرة وreplate لهم على لوحين LB أجار مع الكلورامفينيكول. ثم، تعرض لوحات مع أو من دون ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 ثانية، واختيار المستعمرات حساسة للأشعة فوق البنفسجية لمزيد من التحليل.
  7. تحديد الحمض النووي BAC تعديلها من قبل PCR باستخدام tdTomato / IL-22 التمهيدي متخالف (إلى الأمام: 5 'ACT TGT GCG ATC تكت جات GGT. عكسي: 5' TGT AAT CGG GGA TGT CGG C). شروط thermocycler على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. 30 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 56 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ وتمديدا نهائيا عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  8. تأكيد تسلسل منطقة معدلة من BAC بواسطة التسلسل BAC المباشر الإعدادية كبير BAC DNA 12.
  9. تخدير الماوس المتلقي مع جرعة من 0.25٪ ثلاثي بروم إيثانول في التجويف البريتوني عندما غرس بيضات ملقحة microinjected في C57BL الفئران / 6C شبه حاملا.
  10. خطي IL-22-tdTomato BAC بناء (10 ميكروغرام) عن طريق الهضم مع 5 ميكرولتر من تقييد endonucleasePi-SCEI في 100 ميكرولتر من نظام رد فعل وmicroinject الحمض النووي BAC خطي إلى البويضات المخصبة من C57BL / 6 الإناث في مرحلة pronuclear 13. أفلام اأون الفئران المعدلة وراثيا عن طريق تحليل لطخة الجنوبي من الحمض النووي معزولة عن خزعات ذيل باستخدام إجراءات القياسية.

إعداد 2. وحيد الخلية من الطحال والغدة الصعترية، الغدد الليمفاوية، والتصحيح باير ل

ملاحظة: تم الحفاظ IL-22-tdTomato الفئران مراسل في المعهد الوطني للسرطان (NCI، فريدريك، MD). يتوافق مع طريقة القتل الرحيم للمبادئ التوجيهية اخر احصاء الأخيرة على القتل الرحيم. الموت الرحيم كانت جميع الفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2 استنشاق 14.

  1. الموت ببطء وIL-22-tdTomato الماوس في غرفة CO 2 ووضعها على وسادة نظيفة. تعقيم الجلد البطن عن طريق رش الكحول 70٪ وخفض مفتوحا. إزالة الطحال في الجهة اليسرى والغدة الصعترية وراء القص.
  2. حصاد العقد mesentericlymph (الموجود في الأنسجة المساريقي) وبقع باير ل(lymphoidnodules الصغيرة في جميع أنحاء المنطقة الدقاق من الأمعاء الدقيقة)، واتخاذ لؤلؤي المساريقي الأبيض عن عقد بالقرب من رانه جدار الأمعاء الدقيقة باستخدام ملقط تشريح مع نصائح غرامة نقطة مسننة أولا ثم إزالة الأمعاء الدقيقة كله والقولون إلى خارج الجسم. العثور على بقع البيضاوي الموسعة (بقع باير ل) على طول القناة الهضمية وقطع منها مع مقص. طحن هذه الأنسجة اللمفاوية (العقد الليمفاوية وبقع باير ل) بشكل فردي بين شريحتين بلوري في تعليق وحيد الخلية في برنامج تلفزيوني / 1٪ مصل بقري جنيني (FBS) العازلة على الجليد.
  3. تخطر على الطحال أو أنسجة الغدة الصعترية باستخدام نفس الطريقة كما في الخطوة 2.2. الطرد المركزي تعليق الطحال لمدة 8 دقائق في 500 x ج و 4 درجات مئوية. إضافة 1 مل من ACK الناشر عازلة في الطحال إلى الكريات الخلية.
  4. تخلط جيدا والسماح لهم الوقوف لمدة 1 دقيقة. إضافة 9 مل من العازلة العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى كل عينة. تدور باستمرار بواسطة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 500 x ج و 4 درجات مئوية لإزالة خلايا الدم الحمراء.
    ملاحظة: لا تقم بإضافة ACK العازلة الناشر لخلايا الغدة الصعترية.
  5. Resuspend وكريات الدم البيضاء مما أسفر عن 5 مل من برنامج تلفزيوني وصالحمار الخلايا من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرون. جمع الكريات الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 8 دقائق.
  6. resuspend الخلايا في 5 مل من وسائل الاعلام RPMI أو FACS العازلة والاعتماد على خلايا قابلة للحياة باستخدام 0.4٪ التريبان صبغة زرقاء / حل برنامج تلفزيوني.

3. عزل داخل الظهاري الخلايا اللمفاوية والصفيحة المخصوصة خلايا من أمعاء

  1. فتح جلد البطن كما في الخطوة 2.1، وقطع في الأمعاء الدقيقة، من العفج (بجانب المعدة) لالدقاق (بالقرب من التذييل)، والقولون كله، الحق فوق فتحة الشرج. إزالة الدهنية الزائدة وملقط الأنسجة باستخدام المساريقي. وضع الامعاء فورا في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني.
  2. ابحث عن بقع باير ل(صغيرة، العقيدات الخام) على طول المنطقة البعيدة من الأمعاء الدقيقة. إزالة الكتل باستخدام ملقط andopen الأمعاء بالطول باستخدام المقص. بدقة مسح الأمعاء مع 10 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني.
  3. احتضان الأنسجة في 20 مل من العازلة قبل الهضم (5 ملي EDTAو1 ملم dithiothreitol في هانك في محلول الملح المتوازن (HBSS)) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع دوران بطيء (50 دورة في الدقيقة) في شاكر. بعد كل من 2 حضانات، وإزالة طبقة الخلايا الظهارية، الذي يحتوي على الخلايا الليمفاوية داخل الظهاري (IELs)، قبل vortexing مكثفة (30 ثانية في 12000 دورة في الدقيقة) وتمرير جميع الأنسجة من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرون.
  4. إضافة 20 مل من محلول EDTA جديد إلى الأنسجة لحضانة الثانية لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تمرير كسور IEL من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرون وتجميع لهم الكسور السابقة. الحفاظ على شظايا الأمعاء المتبقية على الجليد في أن يعامل في الخطوة 3.9.
  5. أجهزة الطرد المركزي الكسور IEL مجمعة في 800 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. غسل كسور IEL المجمعة مع 10 مل من HBSS / 5٪ FBS وتدور عليهم لمدة 5 دقائق في 800 x ج و 4 درجات مئوية.
  6. resuspend الخلايا في 8 مل من المتوسط 44٪ السيليكا الغروية 15 وتغشيهما 5 مل من 67٪ متوسطة السيليكا الغروية. أجهزة الطرد المركزي ال 44٪ / 670.5٪ التدرج الخلية الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و1،500 ز س.
  7. جمع الخلايا IEL من الفرقة في واجهة. أولا، إزالة الطبقة العليا من طاف (حوالي 5 مل) باستخدام 1 مل ماصة. ثم، IELs الحصاد في الطور البيني من الغروية التدرج السيليكا المتوسطة.
  8. غسل IELs بإضافة 10 مل من RPMI المتوسطة. تدور الخلايا لمدة 5 دقائق في 800 x ج و 4 درجات مئوية. Resuspend وIELs في 5 مل من RPMI للخطوة 3.15.
  9. لعزل الخلايا الليمفاوية الصفيحة المخصوصة (LPLs)، واللحم المفروم شظايا الأنسجة الأمعاء من الخطوة 3.4 إلى قطع صغيرة باستخدام مقص (1 مم) وهضم القطع مع 10 مل من العازلة الهضم (0.05 غرام من كولاجيناز، 0.05 غرام من DNaseI، و 0.3 غرام من dispase الثاني في RPMI / 5٪ FBS) لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  10. تصفية الخليط من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرون. يحتوي طاف التدفق من خلال LPL الافراج عنهم.
  11. هضم تماما شظايا الأمعاء بتكرار الخطوات 3،9-3،10 (عادة، يجب أن تكونكرر 3 مرات). في كل مرة، تجمع في supernatants تحتوي على LPLs.
  12. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1500 x ج ودرجة حرارة الغرفة و resuspend الكريات في RPMI / 5٪ FBS. تمريرها من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرون.
  13. Resuspend والكريات خلية في 10 مل من 40٪ جزء من 40:80 السيليكا الغروية المتوسطة الانحدار وتغشيهما في 5 مل من 80٪ كسر في أنبوب 15 مل.
  14. أداء فصل كثافة التدرج بواسطة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 1500 x ج ودرجة حرارة الغرفة (15).
  15. جمع LPLs، كما هو موضح في الخطوة 3.7. غسلها مرة واحدة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني و resuspend الكريات في 1 مل من برنامج تلفزيوني / 1٪ FBS العازلة أو المتوسطة RPMI.
  16. عد خلايا قابلة للحياة (على حد سواء IELs وLPLs) باستخدام 0.4٪ التريبان صبغة زرقاء / حل برنامج تلفزيوني.

4. التعبير عن IL-22-tdTomato في التهاب القولون

  1. إعداد تعليق خلية الطحال واحدة من الفئران IL-22-TdTomato بتركيز 1 × 10 <سوب> 7 خلية / مل في برنامج تلفزيوني العقيمة، كما هو موضح في الخطوات 2،1-2،4.
  2. تنقية خلايا CD4 + T باستخدام الماوس CD4 خلية طريقة عزل سلبي 10. تسمية لهم مع مكافحة CD4-APC (استنساخ RM4-5، 0.5 ميكرولتر / 1 × 10 6 خلايا في برنامج تلفزيوني / 1٪ عازلة FBS) ومكافحة CD45RB-FITC (استنساخ 16A، 0.5 ميكرولتر / 1 × 10 6 خلايا في برنامج تلفزيوني / 1٪ عازلة FBS) من خلال حضانة في 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. تدور الخلايا لمدة 5 دقائق في 500 x ج و 4 درجات مئوية. غسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني / 1٪ عازلة FBS و resuspend لهم في 1 مل من / 1٪ عازلة FBS تلطيخ برنامج تلفزيوني.
  4. تشغيل خلايا T وصفت على التدفق الخلوي الجهاز 16. بوابة الخلايا على السكان تي الخلية ونوع CD4 + CD45RB خلايا مزدوجة إيجابية عالية (الطول الموجي الكشف على 488 نانومتر و 633 نانومتر ليزر).
  5. حصاد الخلايا مرتبة بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 x ج و 4 درجات مئوية. Resuspend والكريات الخلايا في العازلة في برنامج تلفزيوني العقيمة في 1 × 10 6 6) في الصفاق ofeach Rag1 - الماوس المتلقي - /.
  6. التضحية الفئران المتلقي تحت CO 2 في نقاط زمنية مختلفة. حصاد الغدد الليمفاوية المساريقي والأمعاء الصغيرة والكبيرة، كما هو موضح في الخطوات 2.1 و 2.2. وضع كل العقدة الليمفاوية المساريقي وقطع مفتوحة الأمعاء (ورقة / الأمعاء / ورقة ساندويتش) في 4٪ بارافورمالدهيد (منهاج العمل، التعامل تحت غطاء الدخان) بين عشية وضحاها لإصلاح الأنسجة. استبدال PFA مع 18٪ سكروز ل16-24 ساعة ومن ثم تجميد الأنسجة لباجتزاء.
  7. استخدام آلة ناظم البرد لقطع الأنسجة 17 و 18 و 19. تدفئة أقسام الأنسجة إلى درجة حرارة الغرفة لحوالي 60 دقيقة ووضعها في الأسيتون لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجفيفها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق تقريبا.
  8. إضافة FBS في الزائدة، إزالته بواسطة ماصة، وإضافة لمكافحة طلب تقديم العروض في 1: 200 التخفيف في 0.1٪ BSA / 1X PBS. احتضان الأجسام المضادة عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  9. شطف المقاطع في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة وتطبيق الضد الثانوية المقابلة (الماعز المضادة للأرنب 568) إلى الأنسجة، المخفف 1: 300 في 1٪ BSA / برنامج تلفزيوني 1X، لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  10. شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة، وتصفيتهم الجافة، وإضافة coverslips.
  11. تصور كل العينات مع المجهر الفلورسنت تحت إضاءة متناسقة (طلب تقديم العروض: الإثارة تصفية 540-580 نانومتر) باستخدام الهدف 40X.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم إنشاء الفئران IL-22 مراسل التحوير باستخدام recombineering لتعديل كروموسوم اصطناعي البكتيرية تحمل موضع IL-22. ويبين الشكل 1 رسم تخطيطي للناقلات pBACe3.6 التي تحتوي على الجين sacBII، علامة إيجابية للاختيار، والكلورامفينيكول المضادات الحيوية المقاومة الجين 11. بعد إدخال tdTomato في اكسون 1، تعطلت تسلسل إشارة الببتيد، كما هو مبين في الشكل 2. وهكذا، كان محاصرا مراسل tdTomato داخل الخلايا IL-22 معربا، وتمكين الكشف عنها وعزل التدفق الخلوي. كانت ولدت الفئران متماثل من خطوط مؤسس وفحص بواسطة PCR، وأنها لا تتطلب backcrossing من أجل تحقيق ذرية مع الهوية الوراثية، كما هو مطلوب في الاستراتيجية المعتادة تدق في. لاختبار الإخلاص للIL-22 صحفيين، وكانت في المختبر splenocytes -generated مثقف تحت Th22 أو شروط محايدة. > يوضح الشكل (3) أن IL-22-tdtomato وأعرب أيضا في خلايا Th22 في المختبر، الكشف إما عن طريق التدفق الخلوي أو بواسطة المجهر الفلورسنت. في الجسم الحي، كما هو مبين في الشكل (4)، تم الكشف عن مراسل IL-22 في أنسجة مختلفة الماوس تحت شرط التماثل الساكن. تم العثور على أكثر من إشارة tdTomato في خلايا الصفيحة المخصوصة (LP) من القناة الهضمية، ولكن ليس في العقدة الليمفاوية الإبطية (ن.)، والطحال، أو الغدة الصعترية. لتصور مراسل tdTomato في الأنسجة الملتهبة، استخدمنا نموذج الفأر التهاب القولون الناجم عن نقل مراسل CD4 + CD45Rb مرحبا خلايا T في Rag1 - / - الفئران. يوضح الشكل (5) أن الصحفيين كانوا أول الحاضرين في الغدد الليمفاوية المساريقي ثم تراكمت داخل الصفيحة المخصوصة الأمعاء والقولون الأنسجة الصغيرة البعيدة. معا، وهذه الطريقة رواية لتوليد IL-22 مراسل الفئران فعالة وموفرة للوقت.

ضمن الصفحات = "1"> شكل 1
الشكل 1: خريطة الموقع من ناقلات pBACe3.6. يتميز pBACe3.6 التي تحتوي على الكلورامفينيكول المقاومة للمضادات الحيوية والجينات sacBII كعلامة إيجابية للاختيار. خلال إعادة التركيب، استنساخ المطلوبة هي مقاومة للالسكروز من خلال لهم التعبير عن الجينات sacBII ويسمح لتنمو على وسائل الإعلام التي تحتوي على السكروز، في حين أن المستعمرات BAC السلبية هي السكروز حساسة.

الشكل 2
الشكل 2: عرض تخطيطي للاستنساخ RP23-401E11 BAC تعديلها. وقد تم إدخال الجين مراسل tdTomato في موضع ايل-22، التي تضم IL-22 و التنظيمية العناصر في الفئران بكتيريا الكروموسوم الاصطناعي (BAC RP23-401E11)، وذلك باستخدام تكنولوجيا recombineering. من خلال إعادة التركيب مثلي، وتسلسل الببتيد إشارة ايل 22 في تعطلت BAC وحل محله اكسون 1 من ايل 22 بواسطة الجينات مراسل tdTomato. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: تحديد IL-22 للصحفيين في splenocytes مثقف في المختبر. وتنقيته خلايا CD4 T من الطحال وثم حفز مع anti-CD28. مكافحة CD3 (حالة محايدة)؛ أو مكافحة CD3، ومكافحة CD28، ومكافحة IFNƳ، ومكافحة IL4، IL-6، TGF-β، و 6 Formylindolo (3،2-ب) carbazole (FICZ) لمدة 5 أيام. تم تحليل IL-22-tdTomato التدفق الخلوي (اثنين من كبار) والمجهر الفلورسنت (أسفل اثنين، شريط مقياس: 100 ميكرون). الأرقام في الأرباع تشير النسبة المئوية للخلايا CD45 +. الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل (4): تصور IL-22-إنتاج الخلايا في أنسجة مختلفة الماوس. أعدت وحيدة الخلية تعليق من الطحال والغدة الصعترية، والعقد الليمفاوية والأمعاء (IEL وليرة لبنانية)، والتصحيح باير ل. وبعد ذلك السطح الملون وأنهم مع FITC المضادة للCD3 وفحصها للتعبير tdTomato. MLN: العقدة الليمفاوية المساريقي، ألن: الإبطين العقدة الليمفاوية، PP: التصحيح باير، وIEL: خلايا داخل الظهاري معزولة من الأمعاء الدقيقة، ليرة لبنانية: خلايا الصفيحة المخصوصة تنقيته من الأمعاء الدقيقة. الأرقام في الأرباع تشير النسبة المئوية للخلايا CD45 +. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

هين الصفحات = "1"> الرقم 5
الرقم 5: توطين IL-22 صحفيين خلال تطوير نقل خلايا T التهاب القولون. تم نقل CD4CD45RBHigh الخلايا التائية من IL-22 الفئران مراسل في Rag1 - / - الفئران، وكانت تقيم إشارات tdTomato المناعية في الأنسجة المختلفة في نقاط زمنية مختلفة خلال تطوير التهاب القولون. تشير الأسهم إلى إشارات IL-22-tdTomato. الحانات النطاق = 25 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

IL-22 يلعب دورا أساسيا في الفطري دفاع المضيف والأنسجة التجديد. وقد تم تحديد IL إنتاج 22 الخلايا خارج الجسم عن طريق تلطيخ الخلايا. ومع ذلك، فإنه لا يزال من الصعب تتبع التعبير IL-22 في الموقع، سواء في الحالة العادية أو في حالات الالتهابات. يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة لتطوير IL-22 مراسل نموذج الفأر، والتي تمكننا من حصر الخلايا، معربا عن مراسل في الجسم الحي. تم إدراج الترميز TdTomato مراسل الجين في موضع IL-22 في الموقع الذي يعطل تسلسل إشارة. هذه النتائج الاستراتيجية في مراسل الوقوع في الخلية المنتجة، على عكس IL-22 الذي يفرز بسرعة، مما يمكن التصور من الخلايا المنتجة. وقد ورد في هندستها IL-22-مراسل ضمن BAC كبير، وذلك بهدف الحفاظ على العناصر التنظيمية، وبالتالي منح الإخلاص التعبير لمراسل المقابل الى ان من IL-22. الأنسجة المعوية م المعدلة وراثياعرض الجليد التعبير مراسل التماثل الساكن في خلايا CD4 T والخلايا الليمفاوية الفطرية في الصفيحة المخصوصة من الأمعاء الدقيقة. في التهاب القولون الناجم، أعربت خلايا CD4 T مراسل في القولون.

وقد كان دور IL-22 في مرض التهاب الأمعاء واضح. من خلال المشاركة في الدفاع المخاطية والأنسجة تجديد الأمعاء، IL-22 غير قادر على انتزاع إنتاج كل من واقية 20، 21، 22 وسطاء proinflammatory (على سبيل المثال، IL-8) 23، 24. وأظهرت نموذجين من T التهاب القولون يحركها خلية الزيادات في IL-22 في القولون، بما في ذلك TCR α - / - الفئران 25 و 26 و نقل نموذج CD45RB مرحبا 27. مقارنة نماذج التهابات أمراض الأمعاء، وكان التعبير IL-22 في الأمعاء العالي في الكرومmodelthan المرض أوهن في نموذج من التهاب القولون التقرحي 21 و 24. هنا، ونحن لنقل خلايا CD4CD45RBhi تي من الفئران مراسل في Rag1 - / - المتلقين وتحاكي عملية المسببة للأمراض من مرض كرون. لقد وجدنا أن تسبق التهاب القولون، تم تصور IL-22 للصحفيين في الأمعاء تصريف الغدد الليمفاوية (مليون). ثم تضاءل الإشارات في MLN ونقلها إلى الأمعاء، وخاصة الأمعاء والكولونات الصغيرة البعيدة، مع تطور التهاب القولون. كانت محلية معظم المراسلين tdTomato داخل الغشاء المخاطي الصفيحة المخصوصة الأمعاء.

وهناك نوع آخر من مراسل IL-22 وقد وصفت في وقت سابق، والتي يتم وضع علامة الخلايا بشكل دائم بحيث أنها وبناتهم الاستمرار في التعبير عن المراسل، سواء نسخ من IL-22 أو لا استمر 28. كما هو الحال في الدراسة، الأمعاء الخلايا الليمفاوية الفطرية لدينا وتميزت في ظل ظروف التماثل الساكن، والتهاب القولون، روكان مترجم انه مراسل في الخلايا التائية من الغدد الليمفاوية المساريقي للأنسجة الأمعاء.

إن الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول تكون قابلة للتطبيق لإنشاء الفئران مراسل التحوير الأخرى، مثل IL-17 و IL-25، وهلم جرا. ومع ذلك، لا بد من اختيار الحيوانات المستنسخة BAC مناسبة تحمل العناصر التنظيمية البعيدة لضمان الدقة في التعبير مراسل الجينات، حيث يتم دمج الجينات المحورة عشوائيا في جينوم الفأر. الماوس مراسل يسمح لتحديد الخلايا معربا في الجسم الحي، وكذلك لتنقية وتوصيف الخلايا الحية. كنا tdTomato، وهو أحمر بروتين فلوري مشرق للغاية، كما جين مراسل فلوري لجعل مراسل مناسبة للدراسات التصوير الحيوانات الحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RP23-401E11 BAC Thermo Fisher Scientific RPCI23.C Need gene ID: 50929
NucleoBond BAC 100 Takara Clontech 740579
PCR SuperMix High Fidelity Thermo Fisher Scientific 10790020
PI-SceI New England Biolabs R0696S
SpeI New England Biolabs R0133S
LB Broth Thermo Fisher Scientific 10855-001 1 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride 
Anti-mouse CD3 eBioscience 11-0031
Anti-mouse CD4 eBioscience 17-0041
Anti-mouse CD45 Thermo Fisher Scientific MCD4530
Anti-mouse CD45RB eBioscience 11-0455
Anti-mouse RFP Abcam Ab62341
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14175145 KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose
Dnase I Roche 10104159001
ACK lysing buffer Thermo Fisher Scientific A1049201
Percoll GE healthcare life sciences 17-0891-01
Collagenase D Roche 11088858001
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
IX70 inverted fluorescence microscope Olympus Ask for quote
Nikon Eclipse 80i microscope Nikon Ask for quote
Dynal shaker Electron Microscopy Science 61050-10
FACSAria BD Bioscience Ask for quote
LSRII SORP/flow cytometry Becton, Dickinson and Company  Ask for quote

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).
  2. Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo. PLoS One. 7, e39750 (2012).
  3. Kamanaka, M., et al. Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse. Immunity. 25, 941-952 (2006).
  4. Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22. Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).
  5. Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9. J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).
  6. Cella, M., et al. A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity. Nature. 457, 722-725 (2009).
  7. Sanos, S. L., et al. RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells. Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).
  8. Spits, H., et al. Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature. Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).
  9. Mazzucchelli, R. I., et al. Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice. PLoS One. 4, e7637 (2009).
  10. Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice. Front Immunol. 6, 662 (2015).
  11. Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).
  12. Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments. Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).
  13. Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of transgenic mice. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. Chapter 19, Unit 19 11 (2009).
  14. Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats. Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).
  15. Omata, Y., et al. Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation. Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).
  16. Kumar, N., Borth, N. Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories. Methods. 56, 366-374 (2012).
  17. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb.prot4991 (2008).
  18. Hilbe, W., et al. Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120. Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).
  19. Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry. Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).
  20. Wolk, K., et al. IL-22 increases the innate immunity of tissues. Immunity. 21, 241-254 (2004).
  21. Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).
  22. Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, de, R, Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells. Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).
  23. Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
  24. Andoh, A., et al. Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts. Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).
  25. Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).
  26. Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, 274-282 (1993).
  27. Powrie, F. Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).
  28. Ahlfors, H., et al. IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection. J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).

Tags

علم المناعة، العدد 119، IL-22، الفئران مراسل والتعبير، وخلايا لمفاوية الفطرية، التدفق الخلوي، المناعية، مرض التهاب الأمعاء.
التصور من الخلايا اللمفاوية معربا-22-IL عن طريق الفئران مراسل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shen, W., Li, W., Hixon, J. A.,… More

Shen, W., Li, W., Hixon, J. A., Andrews, C., Durum, S. K. Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice. J. Vis. Exp. (119), e54710, doi:10.3791/54710 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter