Abstract
报告小鼠已被广泛用于观察目标基因的表达的定位。该协议的重点是建立一个新的转基因记者小鼠模型的战略。我们选择了可视化白介素(IL)22的基因表达,因为这种细胞因子具有在肠道内,在那里它有助于修理由炎症损伤组织的重要活动。记者系统提供优于识别产品在体内的其它方法相当大的优势。在IL-22的情况下,其他的研究已经首次分离自组织的细胞,然后再刺激在体外细胞中。 IL-22,这通常是分泌的,使用一种药物被困在细胞内,并用于细胞内染色来可视化它。本方法识别能够产生的IL-22的细胞,但并不确定它们是否在体内做。记者设计包括以这样的洼插入基因为荧光蛋白(tdTomato)插入IL-22的基因该荧光蛋白不能被分泌,因此ÿ保持截留在体内产生细胞内。荧光生产者可以然后在组织切片或通过流式细胞仪体外分析来可视化。对于记者的实际施工过程中包括重组工程包含了IL-22基因的细菌人工染色体。然后,该工程化的染色体被引入到小鼠基因组。在不同的小鼠组织中,包括脾,胸腺,淋巴结,淋巴集结,以及肠,通过流式细胞术分析中观察到稳态的IL-22报告表达。结肠炎诱导T细胞(CD4 + CD45RBhigh)转让,并可视化报告基因的表达。阳性T细胞首先出现在肠系膜淋巴结,然后将它们累加远端小肠和结肠组织的固有层中。相比于IL-22 EXPRES使用BAC的策略得到了良好的高保真记者表达锡永,并且它比敲入程序简单。
Introduction
报道基因的细胞类型特异性表达是识别细胞积极地表达于下稳态和摄动态组织中的靶是有用的。它也允许对这些细胞,这保持存活,研究其其它性质的纯化。报告小鼠已被用于在阐明为特定的细胞因子,转录因子,和调节元件的作用机制。先前策略1,2,3在很大程度上依赖于敲记者成在小鼠染色体中,耗时和昂贵的过程中的目标轨迹。因此,对于报告小鼠的生成一个更简单的方法是可取的。
细胞因子是一大类小,分泌的蛋白质/肽调节通过间信号的免疫反应的。白细胞介素22(IL-22)是许多细胞因子报道活动,包括屏障福nction,组织修复和炎症4。虽然IL-22最初被发现作为T细胞产物5,随后的报告证明在人类6和小鼠7和其他类中固有的淋巴细胞8及其在自然杀伤(NK)细胞中表达。尽管IL-22产生细胞的广泛的观察,可视化的IL-22以前需要离体刺激和透的污渍的抗体。因此,新的IL-22的报告小鼠。将研究IL-22的体内平衡和致病过程的功能的非常有用的工具。
在这里,我们开发了一种简化的转基因报告小鼠模型来观察的IL-22产生细胞在体内和体外 。使用BAC重组工程方法9,我们插入的tdTomato cDNA序列与保利的信号碎片进入IL-22 LOC我们和替换外显子1的其它非翻译区,外显子和调控元件没有扰动,因为我们希望尽可能模仿的IL-22的自然调节。记者插入部位扰乱信号序列,从而在生产细胞内的记者的积累,不同于IL-22本身,这是快速分泌。这种新的方法也可以应用到报告小鼠的产生用于其它分泌蛋白。
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Protocol
所有动物按照2011指南护理和Frederick国家实验室的实验动物委员会癌症研究使用中所述的实验程序获得适当的照顾。
1.通过代BAC重组工程IL-22-tdTomato记者小鼠
注:老鼠应该是无意识的,不响应对有害刺激的运动。消毒用70%乙醇手术区和消毒用玻璃珠灭菌所有外科手术工具。
- 使用碱性提取方法10,11提纯BAC DNA(RP23-401E11,克隆长度228391个基点)。通过RP23-401E11 5微克的SpeI消化表征BAC克隆以确认靶基因的正确的尺寸。注:BAC DNA被消化成14碎片。
- 将TdTomato报告基因插入PLD53SC-A-GFP-B穿梭载体的不是I /萨尔我的网站11和替换在同一个站点的绿色荧光蛋白基因。然后,使用BAC RP23-401E11为模板,扩增同源框(A和B)到第一翻译外显子IL-22(外显子1)通过PCR(95℃2分钟; 30 95℃30个循环秒,55℃30秒,和72℃30秒;和在72℃最终延伸10分钟)。在一个50μl的PCR反应体系中,添加50纳克的BAC DNA,0.5μl的引物(10μM),40微升的PCR SuperMix中高保真和8微升的H 2 O(1微升)
注:A和B框的引物如下:向前迈进了一箱:5'-牛逼GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG和反向:5'-CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC; B寄存器正向:5'-摹TTAATTAA CTGCCCGTCAACA和反向:5'-牛逼GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10。的限制性内切酶(ASC我和Pac I)的位点有下划线。 - 结扎升序我消化A的500纳克和500纳克的Pac I-消化的B- fragm的进入经济需求测试在16°C 50纳克PLD53SC-ATB(tdTomato)载体的1小时。
- 变换纯化PLD53SC-ATB载体导入BAC-感受态细胞11和培养他们在Luria-BERTANI(LB)琼脂氯霉素(20微克/ ml)和氨苄青霉素(30微克/ ml)的平板,在37℃。从通道/安培主平板挑两至三菌落共整合。
- 接种各菌落在1ml的LB补充有20微克/ ml氯霉素和孵化它们在37℃下1小时,225转。铺在LB-琼脂板100微升每种混合物的(10克蛋白胨140,5克酵母提取物12克琼脂,和1升水的; pH7.5)中补充有氯霉素和蔗糖的4-4.5%。过夜孵育培养在37℃。
- 挑选既大又小的殖民地,replate他们与氯霉素2 LB琼脂平皿上。然后,暴露的板具有或不具有UV光30秒,并挑选用于进一步分析该UV敏感菌落。
- 确定使用tdTomato / IL-22的引物杂用PCR修饰BAC DNA(正向:5'ACT TGT GCG ATC TCT GAT GGT;反向:5'TGT AAT CGG GGA TGT CGG C)。热循环条件如下:95℃2分钟; 95℃30个循环,30秒,56℃30秒,72℃30秒;并在72℃最后延伸10分钟。
- 确认由大制备BAC DNA 12的直接BAC测序的BAC的改性区域的顺序。
- 植入微量注射的受精卵进假孕的C57BL / 6c的小鼠当麻醉接受者小鼠的剂量0.25%三溴乙醇的进入腹膜腔。
- 线性化的IL-22-tdTomato BAC构建(10微克)消化用5微升限制性endonucleasePi-SceI位的在100μl的反应体系和microinject线性的BAC DNA到C57BL / 6雌性受精卵在原核期13。 SCRE烯通过使用标准方法从尾部活检分离的DNA的Southern印迹分析的转基因小鼠。
从脾脏,胸腺,淋巴结和淋巴集结2.单细胞制备方法
注:IL-22-tdTomato记者小鼠保持在美国国家癌症研究所(NCI,冯检基,MD)。安乐死方法符合安乐死最新AVMA指引。所有小鼠用CO 2吸入14安乐死。
- 在CO 2室安乐死的IL-22-tdTomato鼠标并把它放在一块干净的纱布。喷洒70%酒精消毒腹部皮肤,剖开。删除左翼健脾和胸骨后面的胸腺。
- 为了收获mesentericlymph节点(位于肠系膜组织)和淋巴集结(整个小肠的回肠区小lymphoidnodules),取珍珠白肠系膜淋巴结接近到t他用墙解剖先用细点锯齿提示钳,然后取下整个小肠和结肠排出体外的小肠。查找沿肠道扩展椭圆形的补丁(淋巴集结),并用剪刀剪他们。磨这些淋巴组织(淋巴结和淋巴集结)二磨砂载玻片之间单独成在PBS / 1%胎牛血清(FBS)的在冰上缓冲的单细胞悬浮液。
- 剁碎使用相同的方法的脾或胸腺组织如在步骤2.2。离心脾悬浮液在500 xg离心8分钟,4℃。 1毫升每脾的ACK裂解缓冲液加入到细胞沉淀。
- 拌匀,让他们站1分钟。 9毫升无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液添加到各样品中。 8分钟降速离心500 XG和4℃以除去红血细胞。
注意:不要添加ACK裂解缓冲胸腺细胞。 - 重悬所得的白细胞在5ml PBS中和p的通过100微米的细胞过滤屁股细胞。收集通过离心细胞沉淀在500 xg离心8分钟。
- 悬浮细胞在5ml RPMI培养基或FACS缓冲液中,并计算用0.4%台盼蓝染料/ PBS溶液中的活细胞。
3.内淋巴细胞和固有层细胞的分离从肠道
- 打开腹部皮肤如在步骤2.1,切小肠,从十二指肠(旁胃)至回肠(接近附录),和整个结肠,右肛门以上。删除多余的脂肪及肠系膜用组织钳。立即把肠子在冰冷的PBS。
- 寻找淋巴集结(小,粗结节)沿着小肠的远侧区域。取出使用镊子andopen肠道纵向用剪刀群众。彻底冲洗,用10ml冰冷的PBS的肠。
- 孵育组织在20ml预消化缓冲液(5mM EDTA的的和1mM二硫苏糖醇中Hank氏平衡盐溶液(HBSS)中)处理30分钟,在37℃下在摇床缓慢旋转(50rpm下)。每2孵育后,除去上皮细胞层,含有上皮内淋巴细胞(IELs),通过激烈涡旋(在12,000rpm 30秒),并通过一个100微米的细胞滤网通过所有组织中。
- 加入20ml新EDTA溶液添加到组织为第二次温育30分钟,在37℃。通过100微米的细胞滤网通过IEL馏分并与前级分汇集它们。保持其余肠片段在冰上在步骤3.9进行处理。
- 离心汇集IEL分数在800 XG在4℃下5分钟。用10ml的HBSS / 5%FBS的洗涤合并IEL馏分和自旋下来在800 xg离心5分钟,4℃。
- 悬浮细胞在8毫升44%的胶体二氧化硅介质15的并用5ml 67%的胶体二氧化硅介质包裹。离心44%/ 675.5%的细胞混合物梯度,在室温下20分钟,1500×g下。
- 收集从带IEL细胞在界面。首先,删除使用1-毫升吸管将上清液(大约5毫升)的顶层。然后,在胶态二氧化硅介质梯度相间收获IELs。
- 通过加入10ml RPMI培养基洗IELs。旋细胞向下在800 xg离心5分钟,4℃。重悬IELs在5ml RPMI对步骤3.15。
- 对于固有层淋巴细胞的隔离(LPLs),剁碎从步骤3.4肠组织碎片成使用剪刀(1毫米)小片和消化用10ml消化缓冲件(0.05克胶原酶,0.05g的DNA酶I的,并在37℃0.3克在RPMI / 5%FBS的分散酶II)的15-20分钟的。
- 通过70微米的细胞滤网过滤该混合物。流过的上清液中含有的释放LPL。
- 通过重复步骤3.9-3.10(通常完全消化肠片段,它们必须是重复3次)。每一次,集中包含LPLs上清。
- 收集通过离心将细胞在1500 xg离心和室温下5分钟和在RPMI / 5%FBS的悬浮颗粒。传递它们通过40微米的细胞滤网。
- 重悬细胞沉淀在10ml一个40:80胶体二氧化硅介质梯度的40%,级分和在一个15毫升管包裹5毫升80%的级分。
- 在1500 xg离心和室温15执行通过离心密度梯度分离20分钟。
- 收集LPLs,如在步骤3.7中描述。用10毫升的PBS洗一次并在1ml的PBS / 1%FBS的缓冲剂或RPMI培养基悬浮颗粒。
- 算用0.4%台盼蓝染料/ PBS溶液中的活细胞(既IELs和LPLs)。
4. IL-22 tdTomato在结肠炎的表达
- 以1×10制备浓度从IL-22 TdTomato小鼠单个脾细胞悬浮液<SUP> 7细胞在无菌PBS / ml的,如在步骤2.1-2.4中描述。
- 净化用小鼠的CD4细胞阴性分离方法10的CD4 + T细胞。用抗CD4-APC标记它们(克隆RM4-5,0.5微升/ 1×10 6个细胞在PBS / 1%FBS的缓冲液),抗CD45RB-FITC(克隆16A,0.5微升/ 1×10 6个细胞在PBS中/ 1%FBS的缓冲液)温育在4℃进行30分钟。
- 旋细胞下来,在500 xg离心5分钟,4℃。清洗细胞用2ml PBS / 1%FBS的缓冲液中,在1ml的PBS / 1%FBS的染色缓冲液重悬。
- 运行在流式细胞仪机16流标记的T细胞。门上的T细胞群体的细胞和排序的 CD4 + CD45RB 高双阳性细胞(在488nm和633nm的激光检测的波长)。
- 收获分选的细胞离心,在500 xg离心5分钟,4℃。重悬在无菌PBS缓冲液中的细胞沉淀以1×10 6个 6个 )插入腹膜ofeach RAG1 - / -受体小鼠。
- 在不同时间点牺牲CO 2条件下的受体小鼠。收获了肠系膜淋巴结和小肠和大肠,如步骤2.1和2.2描述。把每肠系膜淋巴结和切开肠(纸/肠/纸三明治)在4%低聚甲醛(PFA;在通风橱下处理)过夜以固定的组织。 18%的蔗糖替代PFA 16-24小时,然后冷冻组织切片进行。
- 使用低温恒温器机切割所述组织17,18,19。暖组织切片至室温约60分钟,并放置在丙酮,在室温下10分钟。干他们在室温下大约5分钟。
- FBS添加过量,用移液管将其删除,并在1添加抗RFP:200稀释在0.1%BSA / 1X PBS。孵育在37℃的抗体60分钟。
- 冲洗在1×PBS中的部分10分钟,相应的二抗(山羊抗兔568)适用于所述组织,稀释1:300在1%BSA / 1×PBS中,在室温下30分钟。
- 冲洗在1X PBS的幻灯片10分钟,擦干晾干,加盖玻片。
- 可视化所有样本下一致的照明荧光显微镜:使用40倍物镜(RFP激发滤光片540-580纳米)。
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Representative Results
鼠的IL-22报告基因使用重组工程修改细菌人工染色体携带IL-22的轨迹创建。 图1示出含有sacBII基因,正选择标记物,和氯霉素抗生素抗性基因11 pBACe3.6矢量的图。引入tdTomato到外显子1后,信号肽序列被打乱, 如图2。因此,tdTomato记者被困的IL-22表达细胞内,使它们的检测和隔离通过流式细胞术。纯合子小鼠购自创始人线育成并通过PCR筛选,他们并没有以实现具有遗传同一性的后代要求回交,如在通常的敲入策略是必要的。为了测试IL-22的记者的保真度,体外 -生成脾细胞TH22或中性条件下进行培养。 在体外以及表达,检测或者通过流式细胞仪或荧光显微镜。 在体内 , 如图4,在稳态条件下,不同的小鼠组织检测到的IL-22的报道。大多数tdTomato信号是在粘膜固有层(LP)的细胞从肠道,但不是在腋窝淋巴结(ALN),脾,或胸腺找到。为了显现在发炎组织的tdTomato记者,我们使用由转印记者的 CD4 + CD45RB 喜 T细胞的成RAG1诱导小鼠结肠炎模型- / -小鼠。 图5表明,记者们首次出现在肠系膜淋巴结,然后远端小肠和结肠组织的固有层内积累。两者合计,这对IL-22报告小鼠的产生新颖的方法是有效的和节省时间的。
图1:pBACe3.6载体的网站地图。 pBACe3.6特征在于含有氯霉素抗生素抗性和sacBII基因作为正选择标记。期间重组,期望的克隆是蔗糖抗性通过其表达sacBII基因并允许在含有蔗糖的培养基上生长,而负的BAC菌落蔗糖敏感。
图2:改性RP23-401E11 BAC克隆的示意图。一个tdTomato报道基因被引入到IL-22基因座,它包括在小鼠细菌人工染色体(BAC RP23-401E11)的IL-22和调控元件,使用重组工程技术。通过同源重组,IL-22中的信号肽的序列 BAC被打乱和外显子IL-22的1由tdTomato报告基因代替。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3:脾细胞IL-22鉴别记者在体外培养。从脾脏纯化CD4 + T细胞,然后用抗CD28刺激的;抗CD3(中性条件);或抗CD3,抗CD28,抗IFNƳ,抗IL4,IL-6,TGF-β,和6- Formylindolo(3,2-b)的咔唑(FICZ)5天。 (100微米底部的两个,比例尺)的IL-22-tdTomato通过流式细胞术(前两位)和荧光显微镜进行分析。在象限中的数字表示的CD45 +细胞的百分比。目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
图4:IL-22生产在不同的小鼠组织细胞可视化。单细胞悬浮液从脾脏,胸腺,淋巴结,肠(IEL和LP),和淋巴集结制备。然后,他们被表面染色用FITC-抗CD3和检查tdTomato表达。 MLN:肠系膜淋巴结,ALN:腋窝淋巴结,PP:淋巴集结,IEL:从小肠分离上皮细胞,LP:固有层细胞从小肠纯化。在象限中的数字表示的CD45 +细胞的百分比。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5:T细胞转移结肠炎的发育过程中的IL-22的记者定位。在不同时间点的不同组织结肠炎的发展过程中的小鼠,并且tdTomato信号进行了评价用免疫组织化学 - 从IL-22的报告小鼠CD4CD45RBHigh T细胞被转移到RAG1 - /。箭头指向IL-22 tdTomato信号。比例尺= 25微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
IL-22在先天宿主防御和组织重塑中起重要作用。 IL生产-22细胞已经鉴定体外通过细胞内染色。然而,它仍然是难以跟踪的IL-22表达的原位 ,无论是在正常状态还是在炎性病症。这个协议描述来开发的IL-22记者小鼠模型中,这使我们能够本地化记者表达细胞在体内的新方法。报告基因编码TdTomato在扰乱的信号序列的位点插入到IL-22的基因座。在报道这种策略的结果被截留在产生细胞,与IL-22的正迅速分泌,使产生细胞的可视化。该工程化的IL-22-记者含有大量BAC内与保留调控元件,从而赋予相应于IL-22的报道的表达的保真度的目的。转基因米肠组织冰显示在小肠的固有层中的CD4 T细胞和先天淋巴细胞稳态记者表达。在诱导的结肠炎,CD4 T细胞表达在结肠记者。
的IL-22的炎性肠疾病中的作用还不清楚。通过参与肠黏膜防御和组织再生,IL-22是能够引发生产既保护20,21的,22个 和促炎介质( 例如,IL-8)23,24。 T细胞驱动的结肠炎两种模型显示增加IL-22在结肠,包括TCRα - / -小鼠25,26和CD45RB 喜传输模型27。比较炎性肠道疾病模型,在肠道中IL-22的表达是在一个更高的Cr在溃疡性结肠炎21,24。这里的模型翁氏病modelthan,我们转移CD4CD45RBhi T细胞从报告小鼠成RAG1 - / -收件人和模仿克罗恩病的致病过程。我们发现,前述结肠炎,IL-22的记者在肠淋巴结(MLN)可视化。然后这些信号在MLN减弱并移动到肠,特别是远端小肠和结肠,结肠炎的发展。大多数tdTomato记者被肠道粘膜固有层粘膜内本地化。
一种不同类型的记者对IL-22的先前已描述的,在其中细胞被永久标记,使得它们和女儿继续表达报告,不管是不是IL-22的转录继续28。在我们的研究中,肠道先天淋巴细胞稳态条件下显着,并在结肠炎,T他记者在T细胞的局部从肠系膜淋巴结到肠组织。
在这个协议中描述的方法将适用于建立其他转基因报告小鼠,如IL-17,IL-25的,等等。然而,这是选择携带远侧调节元件,以确保报道基因表达的保真度合适BAC克隆至关重要的,因为转基因随机整合入小鼠基因组中。记者鼠标允许表达在体内,以及用于活细胞的纯化和表征的细胞的鉴定。我们使用tdTomato,一个格外明亮的红色荧光蛋白,作为荧光报告基因,使记者适合活体动物成像研究。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
Dnase I | Roche | 10104159001 | |
ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
References
- Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).
- Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo. PLoS One. 7, e39750 (2012).
- Kamanaka, M., et al. Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse. Immunity. 25, 941-952 (2006).
- Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22. Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).
- Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9. J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).
- Cella, M., et al. A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity. Nature. 457, 722-725 (2009).
- Sanos, S. L., et al. RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells. Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature. Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).
- Mazzucchelli, R. I., et al. Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice. PLoS One. 4, e7637 (2009).
- Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice. Front Immunol. 6, 662 (2015).
- Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).
- Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments. Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).
- Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of transgenic mice. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. Chapter 19, Unit 19 11 (2009).
- Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats. Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).
- Omata, Y., et al. Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation. Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).
- Kumar, N., Borth, N. Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories. Methods. 56, 366-374 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb.prot4991 (2008).
- Hilbe, W., et al. Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120. Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).
- Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry. Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).
- Wolk, K., et al. IL-22 increases the innate immunity of tissues. Immunity. 21, 241-254 (2004).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).
- Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, de, R, Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells. Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Andoh, A., et al. Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts. Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, 274-282 (1993).
- Powrie, F. Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).
- Ahlfors, H., et al. IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection. J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).