Abstract
Reporter мыши широко используются для наблюдения локализации экспрессии целевых генов. Этот протокол фокусируется на стратегии по созданию новой модели мыши трансгенный репортер. Мы выбрали для визуализации экспрессии гена интерлейкина (IL) 22, потому что этот цитокин имеет важные действия в кишечнике, где она способствует ремонт тканей, поврежденных воспалением. Reporter системы предлагают значительные преимущества по сравнению с другими методами идентификации продуктов в естественных условиях. В случае IL-22, другие исследования были впервые выделили клетки из тканей , а затем повторно стимулировали клетки в пробирке. IL-22, который обычно секретируется, был в ловушке внутри клеток с помощью препарата, и внутриклеточное окрашивание использовали для визуализации его. Этот метод идентифицирует клетки , способные продуцировать IL-22, но он не определяет , были ли они делают это в естественных условиях. Конструкция репортер включает вставку гена флуоресцентного белка (tdTomato) в ген IL-22 в таком промY , что флуоресцентный белок не может быть секретируется и , следовательно , остается в ловушке внутри клеток , продуцирующих в естественных условиях. Флуоресцентные производители могут быть визуализированы в срезах тканей или экс естественных условиях анализа с помощью проточной цитометрии. Сам процесс строительства для репортера включали recombineering бактериальную искусственную хромосому, которая содержала ген IL-22. Эта хромосома инженерии была затем введена в геном мыши. Гомеостатическое выражение репортер IL-22 наблюдалось в различных тканях мышей, в том числе селезенки, вилочковой железы, лимфатических узлов, патч бляшках, и кишечника, с помощью проточной цитометрии. Колит индуцируют Т-клеток (CD4 + CD45RBhigh) передачи, и выражение репортер визуализировали. Позитивные Т-клетки сначала присутствуют в брыжеечные лимфатические узлы, а затем они накапливаются в собственной пластинке слизистой оболочки дистального тонкой кишки и толстой кишки тканей. Стратегия, использующая BACs дал выражение репортер хорошо точность воспроизведения по сравнению с IL-22 ExpresSion, и это проще, чем нокаута в процедурах.
Introduction
Ячейка типа специфическая экспрессия репортерных генов полезно для идентификации клеток, активно выражающих цель в тканях под гомеостаза и возмущенных состояний. Она также позволяет для очистки этих клеток, которые остаются жизнеспособными, чтобы изучить их другие свойства. Репортер мышей были использованы в выяснении механизма действия для специфических цитокинов, факторов транскрипции и регуляторных элементов. Предыдущие стратегии 1, 2, 3 в основном полагались на стука репортера в локуса - мишени в хромосоме мыши, процедура отнимает много времени и дорого. Таким образом, более простой способ для генерации репортерных мышей желательно.
Цитокины представляют собой широкий класс небольших секретируемых белков / пептидов, которые регулируют иммунный ответ через межклеточное сигнализации. Интерлейкина 22 (IL-22) представляет собой цитокин со многими сообщили о деятельности, в том числе барьер фуnction, восстановление тканей и воспаление 4. Хотя IL-22 первоначально был обнаружен как Т-клеточного продукта 5, последующие доклады продемонстрировали свое выражение в естественных киллеров (NK) клеток в организме человека 6 и 7 мышей и в других классах врожденными лимфоцитов 8. Несмотря на обширные наблюдения IL-22-продуцирующие клетки, визуализации IL-22 , ранее необходимой стимуляции ех естественных условиях и проницаемости к образованию пятен с антителами. Таким образом, роман IL-22 мышей репортер был бы очень полезным инструментом для исследования функции IL-22 в гомеостатических и болезнетворных процессов.
Здесь мы разработали упрощенную модель трансгенной мыши репортер наблюдать за IL-22-продуцирующие клетки в естественных условиях и в пробирке. Используя метод BAC recombineering 9, мы вставили последовательность кДНК tdTomato с поли фрагменты сигнала в IL-22 LOCнас и заменили экзона 1. Другие нетранслируемые области, экзоны и регуляторные элементы не были возмущенной, так как мы хотели бы, чтобы имитировать естественную регуляцию IL-22 в максимально возможной степени. Сайт вставки репортер приводит к нарушению сигнальной последовательности, что приводит к накоплению репортера внутри клеток, продуцирующих, в отличие от IL-22 сам по себе, который быстро секретируется. Этот новый способ может быть также применен к порождению репортерных мышей для других секретируемых белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные получали надлежащую заботу в соответствии с экспериментальными процедурами, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных комитета Фредерика Национальной лаборатории по исследованию рака 2011.
1. Генерация IL-22-tdTomato Reporter мышей BAC Recombineering
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши должны быть в бессознательном состоянии и не двигаться в ответ на болевые раздражители. Стерилизовать хирургическую область с 70% этанола и стерилизовать все хирургические инструменты с использованием стеклянного шарика стерилизатор.
- Очищают BAC ДНК (RP23-401E11, длина клон 228391 БПС) с использованием щелочного метода экстракции 10, 11. Охарактеризовать клон BAC путем SpeI переваривания 5 мкг RP23-401E11, чтобы подтвердить правильный размер целевого гена. Примечание: ДНК БАК расщепляли на 14 фрагментов.
- Вставьте ген-репортер TdTomato в сайт Not I / Sal I вектора челночной PLD53SC-A-GFP-B11 и заменить ген GFP в том же самом месте. Затем, используя BAC RP23-401E11 в качестве шаблона, усиливать гомологии коробки (А и В) к первому переведенной экзоне Ил-22 (экзон 1) методом ПЦР (95 ° С 2 мин, 30 циклов при 95 ° С в течение 30 сек, 55 ° С в течение 30 сек и 72 ° С в течение 30 сек, и окончательное удлинение при 72 ° С в течение 10 мин). В 50 мкл реакционной системы ПЦР, добавить 50 нг (1 мкл) BAC ДНК, 0,5 мкл праймера (10 мкМ), 40 мкл ПЦР СУПЕРМИКС высокой точностью, и 8 мкл H 2 O.
Примечание: Праймеры для боксов А и В являются следующие: коробка Вперед: 5'- T GGCGCGCC GGAGCTGTGAAGAAAG и Реверс: CAGAGATCGCACAAGTGTCAAC 5'; B коробка Вперед: 5'- G TTAATTAA CTGCCCGTCAACA и Реверс: 5'- T GGCCGGCC TGAGCACCTGCTT CATC 10. Сайты ферментов рестрикции (Asc I и Pac I) подчеркнуты. - Перевязывать 500 нг Asc I-переваренной А и 500 нг Pac I-переваренной B ФрагмEnts в 50 нг PLD53SC-ATB (tdTomato) вектора при 16 ° С в течение 1 часа.
- Transform очищенный вектор PLD53SC-ATB в BAC-компетентные клетки 11 и культуры их на Лурии-Бертани (LB) Чашки с агаром с хлорамфениколом (20 мкг / мл) и ампициллином (30 мкг / мл) при 37 ° С. Выберите два-три колонии со-интеграции из основных пластин Ch / Amp.
- Инокулируйте каждой колонии в 1 мл LB, дополненной 20 мкг / мл хлорамфеникола, и инкубировать их в течение 1 часа при температуре 37 ° С и 225 оборотах в минуту. Спред по 100 мкл каждой смеси на LB-агаром (10 г пептона 140, 5 г дрожжевого экстракта, 12 г агара и 1 л воды, рН 7,5) с добавлением хлорамфеникола и 4-4,5% сахарозы. Инкубируйте культуру в течение ночи при температуре 37 ° С.
- Возьмите оба большие и маленькие колонии и replate их на двух LB-агар пластин с хлорамфениколом. Затем, выставить пластины с добавлением или без УФ-светом в течение 30 сек и забрать УФ-чувствительных колоний для дальнейшего анализа,
- Определение модифицированной ДНК BAC методом ПЦР с использованием tdTomato / IL-22 гетерозиготную праймера (вперед: 5 'ACT TGT GCG ATC TCT GAT ГГТ; Реверс: 5' TGT AAT CGG GGA CGG TGT C). Условия Термоциклеры следующим образом: 95 ° С в течение 2 мин; 30 циклов при 95 ° С в течение 30 сек, 56 ° C в течение 30 сек и при 72 ° С в течение 30 сек; и окончательное удлинение при 72 ° С в течение 10 мин.
- Confirm последовательность модифицированной области BAC путем прямого BAC последовательности большого преп BAC ДНК 12.
- Обезболить мышь получателя с дозой 0,25% tribromoethanol в брюшную полость при имплантации микроинъецировали зиготы в псевдо-беременных мышей / 6с C57BL.
- Линеаризацию ИЛ-22-tdTomato БАК сооружать (10 мкг) путем гидролиза с 5 мкл ограничительного endonucleasePi-SCEI в 100 мкл реакционной системы и microinject линеаризованной ДНК BAC в оплодотворенные яйца C57BL / 6 самок на пронуклеусов стадии 13. Screан трансгенных мышей с помощью Саузерн-блот-анализ ДНК, выделенной из хвостовых биопсий с использованием стандартных процедур.
2. Получение Одноклеточный из селезенку, тимус, лимфоузлы, и патч Пейера
Примечание: Мыши репортер IL-22-tdTomato поддерживались в Национальном институте рака (NCI, Frederick, MD). Метод эвтаназии соответствует самым последним АВМА Руководством по эвтаназии. Всех мышей умерщвляли с помощью CO 2 ингаляции 14.
- Эвтаназии Ил-22-tdTomato мышь в CO 2 камеры и поместить его на чистую площадку. Стерилизовать кожу живота путем распыления 70% спирта и разрезать его открытым. Удалить селезенку в левом фланге и тимус за грудиной.
- Для сбора mesentericlymph узлов (находится в брыжеечной ткани) и пейеровы бляшки (небольшие lymphoidnodules по всей подвздошной области тонкой кишки), возьмите жемчужно белый брыжеечной узлы, близких к #он стенки тонкой кишки с помощью пинцета рассекать с тонкой точкой зазубренными наконечниками, а затем удалить всю тонкую кишку и толстую кишку из тела. Найти расширенные овальные пятна (пейеровы бляшки) вдоль кишки и вырезать их ножницами. Измельчите эти лимфоидные ткани (лимфатических узлов и пейеровых бляшек) по отдельности между двумя матовыми горок в суспензию одной клетки в PBS / 1% фетальной телячьей сыворотки (FBS), буфер на льду.
- Фарш селезенки или тимуса ткани, используя тот же метод, что и в пункте 2.2. Центрифуга селезеночной суспензии в течение 8 мин при 500g и 4 ° C. Добавить 1 мл ACK лизирующего буфера на селезенке в клеточных гранул.
- Хорошо перемешайте и дайте им постоять в течение 1 мин. Добавить 9 мл стерильного фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) буфере для каждого образца. Спин вниз центрифугированием в течение 8 мин при 500g и 4 ° C, чтобы удалить эритроциты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте ACK лизирующего буфера в клетках тимуса. - Ресуспендируют в результате лейкоциты в 5 мл PBS и рпопки клетки через клеточный фильтр 100 мкм. Сбор гранул клеток путем центрифугирования при 500 мкг в течение 8 мин.
- Ресуспендируют клеток в 5 мл RPMI сред или буфера FACS и подсчета жизнеспособных клеток с использованием 0,4% трипанового синего красителя / раствор PBS.
3. Выделение интраэпителиальной лимфоцитах и клетках собственной пластинки из кишок
- Откройте кожи живота, как на стадии 2.1, вырезать тонкую кишку, из двенадцатиперстной кишки (рядом с желудком) к подвздошной (близко к приложению), и всей толстой кишки, прямо над анусом. Снимите дополнительный жировой ткани и мезентериальные ткани с помощью пинцета. Поместите кишечник сразу в ледяной PBS.
- Посмотрите на пейеровы бляшки (малые, грубые узелки) вдоль дистальной части тонкой кишки. Удалить массы с помощью щипцов andopen кишечника продольное с помощью ножниц. Тщательно промыть кишечник с 10 мл охлажденного льдом PBS.
- Инкубируйте ткани в 20 мл предварительно сбраживания буфера (5 мМ ЭДТАи 1 мМ дитиотреитола в Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS)) в течение 30 мин при 37 ° С при медленном вращении (50 оборотов в минуту) в шейкере. После каждого из 2 инкубациями, удалите эпителиальный слой клеток, содержащий интраэпителиальной лимфоциты (IELS), интенсивным встряхиванием (30 сек при 12000 оборотах в минуту) и передать все ткани через сито 100 клеток мкм.
- Добавьте 20 мл нового раствора ЭДТА на ткань для второй инкубации в течение 30 мин при 37 ° С. Пропускают фракции ИЭЛ через клеточный фильтр 100 мкм и объединить их с предыдущими фракциями. Храните оставшиеся фрагменты кишечника на льду лечиться в шаге 3.9.
- Центрифуга объединенных фракций ИЭЛ при 800 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Вымойте объединенных фракций ИЭЛ с 10 мл HBSS / 5% FBS и закрутить их в течение 5 мин при 800 мкг и 4 ° С.
- Ресуспендируют клеток в 8 мл 44% коллоидного диоксида кремния , среды 15 и обложи их 5 мл 67% среды коллоидная двуокись кремния. Центрифуга 44% / 670,5% градиент смесь клеток в течение 20 мин при комнатной температуре, и 1500 х г.
- Собирают клетки ИЭЛ из группы на границе раздела. Во-первых, удалить верхний слой надосадочной жидкости (около 5 мл) с использованием 1 мл пипетки. Затем урожай IELS на межфазных коллоидной градиента кремнезема среды.
- Вымойте IELS добавлением 10 мл RPMI среды. Спин клетки в течение 5 мин при 800 х г и 4 ° С. Ресуспендируют IELS в 5 мл среды RPMI на этапе 3.15.
- Для выделения собственной пластинке слизистой оболочки лимфоцитами (LPLs), фарша фрагменты ткани кишечника с этапа 3.4 на маленькие кусочки с помощью ножниц (1 мм) и переварить куски с помощью 10 мл сбраживания буфера (0,05 г коллагеназы, 0,05 г DNAseI, и 0,3 г диспаза II в RPMI / 5% FBS) в течение 15-20 мин при температуре 37 ° С.
- Смесь фильтруют через сито 70 клеток мкм. Проточный супернатант содержит выпущенное LPL.
- Полностью переварить фрагменты кишечника, повторяя шаги 3.9-3.10 (как правило, они должны бытьповторяется 3 раза). Каждый раз, бассейн супернатанты, содержащие LPLs.
- Собирают клетки центрифугированием в течение 5 мин при 1500 х г и при комнатной температуре и ресуспендирования гранул в RPMI / 5% ЭБС. Пропустить их через сито 40 ячейки мкм.
- Ресуспендируют клеточный дебрис в 10 мл 40% фракции градиентной среды 40:80 коллоидная двуокись кремния и наложения их на 5 мл 80% -ной фракции в 15 мл пробирку.
- Выполните разделение в градиенте плотности путем центрифугирования в течение 20 мин при 1500 х г и комнатной температуре 15.
- Собирают LPLs, как описано в пункте 3.7. Промыть их один раз с 10 мл PBS и ресуспендируют гранул в 1 мл PBS / 1% FBS буфера или среды RPMI.
- Количество жизнеспособных клеток (как IELS и LPLs), используя 0,4% трипанового синего красителя / раствор PBS.
4. Экспрессия IL-22-tdTomato в колита
- Подготовка суспензии отдельных клеток селезенки от мышей, IL-22-TdTomato при концентрации 1 × 10 <SUP> 7 клеток / мл в стерильном PBS, как описано в пунктах 2.1-2.4.
- Очищают CD4 + Т - клеток с помощью мыши клеток CD4 метод изоляции 10 Отрицательный. Добавьте их с анти-CD4-APC (клон RM4-5, 0,5 мкл / 1 × 10 6 клеток в PBS / 1% FBS буфера) и анти-CD45RB-FITC (клон 16А, 0,5 мкл / 1 × 10 6 клеток в PBS / 1% FBS буфера) путем инкубации при 4 ° с в течение 30 мин.
- Спин клетки вниз в течение 5 мин при 500g и 4 ° C. Промывают клетки 2 мл PBS / 1% -ным буфером ФБС и ресуспендируют их в 1 мл PBS / 1% -ным буфером ФБС окрашивания.
- Запуск меченых Т - клеток на проточной цитометрии машины 16. Ворота клетки на популяции Т-клеток и сортировки CD4 + CD45RB высокие двойные-позитивные клетки (длина волны обнаружены при 488 нм и 633 нм лазеров).
- Урожай отсортированных клеток центрифугированием в течение 5 мин при 500g и 4 ° C. Ресуспендируют гранул клеток в стерильном буфере PBS при 1 × 10 6 6) в брюшину ofeach RAG1 - мыши - реципиента - /.
- Жертвоприношение мышей адресатами в СО 2 в различные моменты времени. Урожай брыжеечных лимфатических узлов и тонкого и толстого кишечника, как описано в пунктах 2.1 и 2.2. Положите каждый мезентериального лимфатического узла и вырезать открытый кишечник (бумага / кишечника / сэндвич бумаги) в 4% параформальдегида (PFA, ручка под вытяжкой) в течение ночи для фиксации тканей. Заменить PFA с 18% сахарозы в течение 16-24 ч, а затем заморозить ткани для секционирования.
- Используйте криостата машину , чтобы разрезать ткань 17, 18, 19. Нагреть срезах тканей до комнатной температуры в течение примерно 60 мин и помещают их в ацетоне в течение 10 мин при комнатной температуре. Высушите их при комнатной температуре в течение приблизительно 5 мин.
- Добавить FBS в избытке, удалить его с помощью пипетки, и добавить анти-RFP при разведении 1: 200 в 0,1% БСА / 1x PBS. Инкубируйте антитело при температуре 37 ° С в течение 60 мин.
- Промыть секции в 1X PBS в течение 10 мин и применять соответствующие вторичные антитела (козий анти-кроличий 568) к ткани, разводили 1: 300 в 1% БСА / 1X PBS, в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Промыть слайды в 1x PBS в течение 10 мин, протрите их сухой, и добавьте покровные.
- Визуализируйте все образцы с флуоресцентным микроскопом при последовательном освещении (RFP: фильтр возбуждения 540-580 нм) с использованием цели 40X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мышиным IL-22 репортер трансген был создан с использованием recombineering для изменения бактериальной искусственной хромосомы , несущей IL-22 локус. На рисунке 1 показана схема pBACe3.6 вектора , содержащего ген sacBII, маркер положительной селекции, и ген устойчивости к хлорамфениколу антибиотик 11. После введения tdTomato в экзоне 1, последовательность сигнального пептида , была нарушена, как показано на рисунке 2. Таким образом, tdTomato репортер был в ловушке внутри IL-22-экспрессирующих клеток, что позволяет их обнаружение и изоляцию с помощью проточной цитометрии. Гомозиготные мышей были выведены из основателей линий и подвергают скринингу с помощью ПЦР, и они не требуют беккросс для достижения потомства с генетической идентичности, как это требуется в обычном забивные стратегии. Чтобы проверить верность репортеров IL-22, в пробирке -порожденных спленоциты культивировали при Th22 или нейтральных условиях.
Рисунок 1: Карта сайта вектора pBACe3.6. pBACe3.6 характеризуется содержанием хлорамфениколу устойчивость к антибиотику и ген sacBII в качестве положительного-маркера селекции. В процессе рекомбинации, желаемые клоны являются сахароза-резистентный через их экспрессию гена sacBII и могут расти на содержащей сахарозу средах, в то время как негативные колонии BAC являются сахароза-чувствительными.
Рисунок 2: Схематическое изображение модифицированного клона RP23-401E11 BAC. Ген-репортер tdTomato был введен в Ил-22 локусе, который включает в себя IL-22 и регуляторные элементы в мышиной бактериальной искусственной хромосомы (BAC RP23-401E11), с использованием технологии recombineering. С помощью гомологичной рекомбинации, последовательность сигнального пептида интерлейкина-22 в БАК был нарушен и экзон 1 Ил-22 был заменен репортерным геном tdTomato. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Идентификация IL-22 репортеров в спленоцитов культивировали в пробирке. CD4 Т-клетки очищали из селезенки и затем стимулировали с помощью анти-CD28; анти-CD3 (нейтральное состояние); или анти-CD3, анти-CD28, анти-IFNƳ, анти-ИЛ-4, ИЛ-6, TGF-β, и 6-Formylindolo (3,2-б) карбазол (FICZ) в течение 5 дней. IL-22-tdTomato анализировали с помощью проточной цитометрии (два верхних) и флуоресцентной микроскопии (два нижних, Шкалы: 100 мкм). Числа в квадранте указывают на процент CD45 + клеток.целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Визуализация ИЛ-22-продуцирующих клеток в различных тканях мыши. Одноклеточные суспензии получали из селезенки, вилочковой железы, лимфатических узлов, кишечника (ИЭЛ и ЛП), а патч Пейера. Затем их поверхность окрашивали FITC-анти-CD3 и исследованы на экспрессию tdTomato. MLN: брыжеечных лимфатических узлов, AlN: лимфатический узел, ПП: патч Пейера, ИЭЛ: интраэпителиальной клетки, выделенные из тонкого кишечника, Л.П.: Propria клетки Lamina очищают от тонкой кишки. Числа в квадранте указывают на процент CD45 + клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Локализация IL-22 репортеров в ходе разработки переноса Т-клеточного колита. CD4CD45RBHigh Т-клетки из IL-22 мышей репортер переносили в RAG1 - / - мышей, а tdTomato сигналы были оценены с помощью иммуногистохимии в различных тканях в различные моменты времени в ходе развития колита. Стрелки указывают на IL-22-tdTomato сигналов. Шкала баров = 25 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IL-22 играет существенную роль в защите хозяина врожденной и ткани ремоделирования. IL-22-продуцирующие клетки были идентифицированы исключая виво с помощью внутриклеточного окрашивания. Тем не менее, она по- прежнему остается трудно отслеживать экспрессию IL-22 на месте, в нормальном рабочем состоянии или в воспалительных процессах . Этот протокол описывает новый метод для разработки ИЛ-22 - репортер модель мыши, которая позволяет нам локализовать репортерные клетки , экспрессирующие в естественных условиях. Кодирование TdTomato ген-репортер был вставлен в локус IL-22 на участке, который разрушает сигнальную последовательность. Эта стратегия приводит к репортеру оказаться в ловушке, производящей клетки, в отличие от IL-22, который быстро секретируется, что позволяет визуализировать производящей клетки. Инженерии IL-22-репортер содержался в большой концентрации алкоголя в крови, с целью сохранения регуляторных элементов, таким образом, присвоение верности выражения репортера, соответствующего тому, что ИЛ-22. Intestinal В тканях трансгенного млед отображается гомеостатические экспрессию репортера в CD4-Т-клеток и лимфоцитов, врожденными в собственной пластинке слизистой оболочки тонкой кишки. В индуцированного колита, CD4 T-клетки экспрессируют репортер в толстой кишке.
Роль IL-22 при воспалительном заболевании кишечника было неясно. Участвуя в кишечном защита слизистых оболочек и регенерации тканей, ИЛ-22 способен индуцировать продукцию как защитного 20, 21, 22 и провоспалительных медиаторов (например, ИЛ-8) , 23, 24. Две модели Т - клеток приводом колитом показали увеличение в IL-22 в толстой кишке, в том числе и TCR & alpha ; - / - мышей 25, 26 и модели передаточной CD45RB привет 27. Сравнивая модели воспалительных заболеваний кишечника, экспрессия IL-22 в кишечнике была выше в Crmodelthan болезнь OHN в модели язвенного колита 21, 24 .Здесь, мы передаем CD4CD45RBhi Т - клеток у мышей репортер в RAG1 - / - реципиентов и имитировать патогенную процесс болезни Крона. Мы обнаружили, что, предшествующего колита, IL-22, репортеры были визуализированы в кишечных дренирующих лимфатических узлов (MLN). Сигналы затем уменьшились в MLN и перемещается в кишечник, особенно дистальном отделе тонкой кишки и двоеточием, с развитием колита. Большинство репортеров tdTomato были локализованы внутри слизистой оболочки собственной пластинки кишечника.
Другой тип репортера IL-22 был описан ранее, в котором клетки постоянно отмечены таким образом, что они и их дочери продолжают выражать репортер, или нет транскрипция IL-22 продолжалось 28. Как и в нашем исследовании кишечника врожденных лимфоцитов были отмечены при гомеостатических условиях, а также при колитах, тон репортер был локализован в Т-клетках из брыжеечных лимфатических узлов в ткани кишечника.
Процедуры, описанные в данном протоколе будут применяться для создания других мышей трансген репортер, такие как IL-17, IL-25, и так далее. Тем не менее, очень важно выбрать подходящие ВАС-клонов, несущих дистальных регуляторные элементы, чтобы гарантировать точность воспроизведения экспрессии гена-репортера, так как трансгены случайным образом интегрированы в геном мыши. Репортер мыши позволяет для идентификации клеток , экспрессирующих в естественных условиях, а также для очистки и характеристики живых клеток. Мы использовали tdTomato, исключительно ярко-красный флуоресцентный белок, в качестве флуоресцентного гена-репортера, чтобы репортер подходит для исследований изображений живых животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1 L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
References
- Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).
- Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo. PLoS One. 7, e39750 (2012).
- Kamanaka, M., et al. Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse. Immunity. 25, 941-952 (2006).
- Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22. Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).
- Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9. J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).
- Cella, M., et al. A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity. Nature. 457, 722-725 (2009).
- Sanos, S. L., et al. RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells. Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature. Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).
- Mazzucchelli, R. I., et al. Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice. PLoS One. 4, e7637 (2009).
- Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice. Front Immunol. 6, 662 (2015).
- Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).
- Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments. Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).
- Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of transgenic mice. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. Chapter 19, Unit 19 11 (2009).
- Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats. Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).
- Omata, Y., et al. Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation. Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).
- Kumar, N., Borth, N. Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories. Methods. 56, 366-374 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb.prot4991 (2008).
- Hilbe, W., et al. Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120. Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).
- Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry. Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).
- Wolk, K., et al. IL-22 increases the innate immunity of tissues. Immunity. 21, 241-254 (2004).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).
- Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, de, R, Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells. Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Andoh, A., et al. Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts. Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, 274-282 (1993).
- Powrie, F. Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).
- Ahlfors, H., et al. IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection. J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).
