Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Kan - beyin bariyerini geçirgenliği FITC etiketli albümin nörodejeneratif hastalık, bir fare modeli intravenöz infüzyonu tarafından değerlendirilmesi

Published: November 8, 2017 doi: 10.3791/56389
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Centre for Neurogenetics and Rare Diseases, IRCCS Neuromed

ERRATUM NOTICE

Summary

Bu çalışmada, biz kan - beyin bariyerini nörodejeneratif koşullar altında çalışmasının değerlendirilmesi için kolay ve etkin bir yordam mevcut. Bizim hedefe ulaşmak için biz yüksek molekül ağırlıklı floresein isothiocyanate (FITC) etiketli infüzyon-albümin içine fare juguler ven ve onun kaçak beyin parankimi Floresans mikroskobu tarafından değerlendirilir.

Abstract

Kan - beyin bariyerini (BBB) bütünlük bozulma farklı nörolojik ve nörodejeneratif hastalıklar için ortak bir özelliktir. Ne kadar perişan BBB homeostazı ve beyin bozukluklarının Patogenez arasında etkileşim ihtiyacı daha fazla araştırma, geliştirme ve doğrulama doğru BBB değişiklikleri algılamak için güvenilir bir yordam çok önemli ve yararlı bir araç temsil eder potansiyel olarak hastalık öngördürücüsü için hedef ilerleme ve geliştirme tedavi stratejileri.

Burada, BBB sızıntı böyle, Huntington hastalığı, BBB geçirgenliği kusur tanımışlar açıkça tespit preklinik fare modeli meydana gelen bir nörodejeneratif durumunun değerlendirilmesi için kolay ve etkin bir yordam mevcut hastalık. Etiketli özellikle yüksek molekül ağırlıklı floresein isothiocyanate (FITC)-yalnızca ikinci bozulmuş olduğunda BBB çapraz yapabiliyor, albümin, akut infüzyon içine bir fare juguler ven ve vasküler veya parenkima ilçede dağıtımı o zaman Floresans mikroskobu tarafından belirlenir.

Beyin parankimi yeşil floresan-albümin birikimi anormal BBB geçirgenliği indeks olarak işlev görür ve görüntü J işleme yazılımı kullanarak quantitated zaman yeşil floresan yoğunluğu bildirilir.

Introduction

Merkezi sinir sistemi (MSS) içinde homeostazı uygun iletişim ve nöronal hücre işlevi için bir önkoşuldur. CNS parankimi sıkı çevre--dan endotel kan - beyin periferik kan ve beyin arasında arayüz gösteren ve çapraz-hadis1 Bu iki ilçe arasında çok önemli bir rol oynar bariyerini (BBB) tarafından saklanmış ,2. BBB bir kompleks olduğunu ve dinamik üç boyutlu yapısını esas olarak interselüler bileske kompleksleri - sıkı kavşak (TJs) - birbirine bağlı ve perisitlerden tarafından çevrili özel mikro-damar endotel hücreleri (ECs) oluşan nöron biten ve astrocyte ayak işlemleri1,2.

Fizyolojik koşullar altında sağlam BBB son derece düşük geçirgenliği içine ve dışına beyin besin ve diğer moleküller sıkı düzenleme sağlar ve MSS görülen değişimleri benzersiz bir koruma sağlar kompozisyon sinirsel aktivite etkisi kan ve potansiyel periferik karşı1,2,3hakaret.

BBB bütünlüğü ve onun gelişmiş geçirgenliği bozulma nörolojik çoğu için önemli bir özellik oluşturmak için uzun bilinmektedir ve Huntington hastalığı (HD)5,6, ancak de dahil olmak üzere4 nörodejeneratif hastalıklar , bu tür bir işlev bozukluğu sorumlu bir olgudur veya hastalık sırasında propagative bir olay hala belirsizdir. BBB arıza zamanlaması da zor kalır, ancak, bizim grup ve diğer kanıtlarla ortaya çıkan kesintiye BBB bütünlüğü bir geç olay oldukça erken bir adım6ama hastalık ilerleme,7 temsil etmiyor gösterir , uzun vadede sonuçlara yol açabilir 8.

Bu düşünce tanımışlar yararlı hastalık ilerleme ve beyin hasarı tahmin ve alternatif ve daha hedefli müdahaleler yeteneğine sahip başarılı bir şekilde geliştirmek için stratejiler geliştirmek amacıyla ateş BBB arıza ortaya önemlidir Böyle bir bozulma klinik sonuçlarını Azaltıcı. Güvenilir görüntüleme BBB bozukluğu olduğunu, bu nedenle, deneysel araştırma ve beyin hastalıkları klinik yönetim büyük önem taşımaktadır.

Bu yazıda, biz bir başarılı ve basit bir HD fare modeli BBB geçirgenliği değerlendirilmesi için yüksek molekül ağırlıklı floresein isothiocyanate etiketli-albumin (FITC-albümin) kullanarak açıklayınız. Normalde bariyer, beyin parankimi geçemez FITC-albümin ekstravazasyonu BBB kaçak dizin olarak ölçüldü. Fareler ve diğer patolojik durumlar cerebrovasculature bozukluğu9,10tarafından karakterize kolayca uyarlanabilir bir tekniktir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

hayvanlar üzerinde tüm yordamları IRCCS Neuromed hayvan bakım inceleme Kurulu tarafından ve tarafından onaylanmış " Istituto Superiore di Sanità " (izni numarası: 1163/2015-PR) ve AB yönergesi 2010 kılavuzlarınıza uygun olarak / 63/EU hayvan deneyleri için.

1. juguler ven enjekte edilir FITC albümin çözüm hazırlanması

Not: tüm deneylerin taşınan dışarı bildirim (11 - haftalık) HD R6/2 fareler ve yaş ve cinsiyet eşlemeli vahşi-türü (WT) kontrol edildi littermates.

  1. Erime FITC-albümin toz (Tablo malzemeleri görmek) fosfat tamponlu tuz (PBS) 10 mg/ml.
    Not: en iyi sonucu almak için bu taze her etiketleme reaksiyon için hazırlanmalıdır.

2. Hazırlık sırasında kullanılan ameliyat olmak için ekipman

  1. (bkz: Malzemeler tablo) daha önce autoclaved cerrahi aletler yatıyordu.
  2. Alkol (% 70 etanol çözüm) ile cerrahi tezgah temiz. Cerrahi steril tek kullanımlık havlu örtüsü ile cerrahi alan (45 cm x 45 cm) hazırlamak ve çalışma stereomicroscope kadar ayarla.

3. Juguler ven içine FITC albümin infüzyonu için cerrahi müdahale

  1. kaydetmek fare vücut ağırlığı için anestezi.
  2. Anesthetize fare mayi enjeksiyonu (IP) ketamin (100 mg/kg) - xylazine (10 mg/kg) çözüm uygun bir doz ile.
  3. Monitör hayvan sedasyon hafif ayak çimdik tarafından çekilme refleks gibi Walantus vd. 11 , 12.
  4. bir yukarı yönde sırtüstü pozisyonda imzalat fareyi getirin ve dört ayak ve kuyruk cerrahi tezgah üzerinde yapışkan bant ile düzeltmek.
  5. Fare güvenli sonra tıraş ile boyun uygun cerrahi kenar boşluğu dikkatle tıraş (Tablo malzemeleri görmek) ve povidone-iyot çözüm ve % 70 etanol ile dezenfekte.
  6. Pamuk temizleme bezi ile maruz traş yüzey kuru.
  7. Yavaşça traş deriyi çekin ve hattı üzerinde Toraks midway başlayan ve altında boyun sadece uzanan bir 1,5 cm uzun boyuna kesi, neşter, midclavicular tarafından olun.
  8. Dikkatli bir şekilde dış juguler ven ortaya çıkarmak için mikroskobik gözlem (5 X büyütme) altında Forseps ile ayrı bağ dokusu germek.
  9. Sağ ve sol tarafındaki juguler ven 30½ G iğne FITC albümin çözüm infüzyonu için ekleme kolaylaştırmak için yeterli alan olun.
  10. Hayvan intravenöz enjekte (juguler ven yavaş yavaş (üzerinde 3 dk) 10 mL/kg FITC albümin 100 µL ile 30½ G iğne kullanarak düzgün).
  11. 15 dakika sonra fareyi işten çıkarma tarafından ötenazi, hızla yukarıda açıklanan 13 olarak kafatası beyin kaldırmak ve için önceden soğutulmuş isopentane 15 dk içinde en az 10 beyin hacmi x bırakın.
  12. Beyin önceden soğutulmuş bir tüpe donmuş isopentane taşımak ve histolojik kesit kadar-80 ° C dondurucu içine saklayın.

4. Histolojik kesit, beyin infüzyon FITC albümin ile

  1. beyin en iyi kesim sıcaklık (OCT) bileşik donmuş Embed cryostat kesit (bakınız Tablo reçetesi) öncesinde.
  2. Seri olarak beyin cryostat ile 20 µm kalınlığında bölüme, kesmek (bkz. Tablo malzemeler) ve mikroskop cam slaytlar mount.
  3. FITC-albümin/laminin belirli bir kullanarak ortak boyama gerçekleştirmek anti-laminin antikor (tablo malzemeleri görmek) daha önce açıklandığı gibi 6.
    1. Kısaca, gece boyunca birincil antikor anti-laminin (pAb 1: 1000) bölümlerle kuluçkaya ve uygun ikincil antikor Cy3 için Birleşik devam.
    2. Coverslip slaytlar ile montaj orta 4 içeren ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (emme tepe 360 = nm; emisyon tepe 460 = nm (Tablo malzemeleri görmek).
    3. Kuru gecede karanlıkta 4 ° C'de slayttan ayrılmasını.
    4. Gözlemlemek boyama floresan mikroskop altında floresan (Tablo malzemeleri görmek) her iki FITC ile donatılmış 20 X büyütme, (emme tepe 495 = nm; emisyon tepe 525 = nm) ve Cy3 filtreleri (emme pik = 550 nm; emisyon tepe 570 = nm).
      1. Hemen boyama sonra örnekleri görüntülemek için coverslip tırnak cilası kullanarak köşelerinde güvenli ve onları (4.3.3) yukarıda mikroskop altında incelemek.

5. Floresan mikroskop yukarı ayarı ve edinme renkli görüntüler

  1. aşağıdaki gibi Floresans mikroskobu hazırlayın.
    1. Floresan lamba açmak kullanmadan önce yaklaşık 10 dakika. Mikroskop, bağlı bilgisayar ve dijital kamerayı açın. Görüntü analiz yazılımı çalıştırmak (Tablo malzemeleri görmek).
    2. En uygun sinyal koleksiyon ve Uzaysal çözünürlük için uygun amaç kullanın ve uygun filtreleri seçin.
  2. Edinme renkli görüntüler
    1. görüntü analiz yazılımı [canlı] komutunu seçin (bkz. Tablo malzeme) ve her filtre için en uygun aydınlatma parametrelerini ayarlayın.
    2. Tek kanallı renkli görüntü çekmek ve ölçek çubuğu eklemek için [freeze] komutunu seçin (' düzenleme > yanmak ölçek ')
    3. Her görüntü kaydetmek ' .tiff ' biçimi.
    4. Birleştirme kanalları tek bir resim halinde seçerek ' dosya > kanalını Birleştir ' ve buraya kaydeder
    5. TIFF ' biçimi.
    6. Edinme en az dört 24 bit renk resimleri (2200 µm x 3400 µm) beyin dilim (slayt başına 6 bölümler) başına.

6. FITC albümin ekstravazasyonu değerlendirilmesi

  1. Floresan yoğunluğu tek her kanal için çözümleme serbestçe kullanılabilir ImageJ 14 , 15.
  2. FITC albümin toplam floresan sinyal şiddeti her resim başına toplam CY3-Laminin floresan yoğunluğu tarafından normal duruma getirmeye ve yeşil floresan yoğunluğu olarak damarları dışında albümin extravasated raporu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Uygun FITC albümin infüzyonu kan gelen yeşil Floresans izleme ekstravazasyonu BBB beyin parenchymawhen içine juguler ven sonuçlarında içine6ele geçirildi. Fizyolojik koşullar altında infüzyon floresan albümin dağılımı beyin kan damarlarının iç sınırlıdır ve çevreleyen Perivasküler alanı ve/veya beyin parankimi içinde sinyal yok algılanabilir (şekil 1A, Tarih Filmler üst). BBB nöro-patolojik şartlar altında güvenilir değil, tersine, FITC albümin diffüz Floresans desen Perivasküler alanlarda ve beyin parankimi (şekil 1A, Filmler üstünde belgili tanımlık dip) gösterir. Vasküler işaretçisiyle birlikte boyama, laminin, açıkça FITC albümin birikimi (şekil 1A) sitenin yerelleştirmek için kullanılır. Artan yeşil floresan yoğunluğu FITC-albümin, güvenliği aşılan BBB tarafından yayılan bir görüntü işleme yazılımı kullanarak değerlendirildi ( Tablo malzemelerigörmek) ve yeşil floresan yoğunluğu rapor (N = 3; 0.3112 vs 0.5765; ***, p 0.0004, = Unpaired T-testi) (şekil 1B). FITC albümin yoğunluğu yukarıda bildirildiği gibi normalleştirilmiş.

Figure 1
Şekil 1: BBB hasar bir işaretleyici olarak FITC albümin ekstravazasyonu. (A)temsilcisi Floresans Filmler altında yeşil flüoresan albümin fark dağılımını gösteren beyin cryosections, her iki fizyolojik (üst) ve patolojik koşulları (altta). Kırmızı boyama vasküler marker laminin temsil eder. Pozlama süreleri: DAPI 20 ms, FITC 500 ms, Tx kırmızı 60 Bayan ölçek çubuk 100 µm (birleştirme monografi) =. (B) bu grafik görüntüler FITC-albümin, yeşil floresan yoğunluğu bildirilen tarafından yayılan yeşil Floresans miktar (bkz. Adım 6.2), fizyolojik (sağlıklı BBB) ve patolojik koşullarında (güvenliği aşılan BBB). N = 3. Veri ± SD, demek gibi gösterilir *** p (Unpaired T-testi) 0.0004 =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz burada tarif teknik öncelikle beyin hastalığı koşullar altında BBB sızıntı tespit için yararlıdır. BBB disfonksiyon çeşitli nörolojik bozukluklar4ortak bir özelliği dikkat kazanıyor. Daha önce bu yaklaşım erken Akli dengesizlik BBB bütünlüğü, nadir nörodejeneratif hastalık HD6gibi bir fare modeli tanımlamak için kullanılır.

Bu yöntem doğru ve güvenilir sonuçlar sağlar yordam etkinliğini ve göreli basitliğine yararlanmak alır. Bu son derece hassas preklinik araştırma aracı temsil eder ve hız ve niteliksel BBB bozulma kesitli beyin dokusu içinde yeşil Floresans basit görselleştirme tarafından değerlendirirken sunduğu yakınlık için yararlıdır. Ancak, biyokimyasal ve moleküler analizi ile birleştirildiğinde, teknik vasküler endotel TJs yapısal ve işlevsel bütünlüğü hakkında niceliksel bilgileri sağlamada başarılı ve BBB korelasyon analizine izin verir bozulma ile beyin homeostazı.

Her ne kadar BBB ultrastructure hakkında herhangi bir bilgi sağlayamaz, burada açıklanan protokol yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu16, gibi diğer yöntemleri ile karşılaştırıldığında daha az pahalı ve zaman talep yordamlar neden olabilir 17. Ayrıca, uygulama kolaylığı ve tekrarlanabilirlik nedeniyle yordamı nörodejeneratif hastalık önceden klinik modelleri karakterize beyin damarlara ilerici lezyonlari izlemek için yararlı olabilir.

BBB bozulma Floresans temelli bir yaklaşım tarafından değerlendirilmesi, büyük bir güç ortak BBB işlevi ince değişiklikleri rolünü araştırmak için potansiyel ve nadir nörolojik bozukluklar ve sonunda doğrudan gerçek zamanlı olarak test etmek için etkisini yatıyor BBB etkileyen ilaçlar ya da kan veya beyin yuvası uygulandığında endojen molekülleri. Yordamı henüz insanlara çevrilemeyen rağmen endikasyonlar klinik pratikte gelecekte kullanılmak üzere yeni beyin tarayıcıları gelişimi için sağlamak için potansiyele sahiptir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Acknowledgments

Bu eser "Fondazione Neuromed" tarafından desteklenen ve sağlık "Ricerca Corrente" VM için İtalyanca Bakanlığı tarafından finanse edilen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate SIGMA A9771-100MG
pAb anti-Laminin Novus Biologicals NB300-144
CY3 anti-rabbit made in goat MILLIPORE AP132
SUPERFROST PLUS Thermo Scientific J1800AMNZ
Cover Slips 24 X 50 mm Thermo Scientific (DIAPATH) 61050
Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound Bio Optica 05-9801
VECTASHIELD Mounting Media VECTOR H-1500 Mounting media with DAPI
iNSu/Light Insulin Disposible Syringe RAYS Health & Safety INS1ML26G13
30G 1/2" BD Microlance 304000 Needle for Insulin disposible Syringe
Scalpel Handle F.S.T. 91003-12
#22 Disposable Scalpel blads F.S.T. 10022-00
Fine Iris scissors 10.5 cm F.S.T. 14094-11
Dumont Forceps #5745 45° 0.10 x 0.06 mm F.S.T. 11251-35
Graefe Forceps 10 cm F.S.T. 11051-10
Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm F.S.T. 11251-20
Medical patch Medicalis 34788
Sterile disposable towel drape Dispotech TVO50VE
Stereoscopic Microscope NIKON SMZ 745 T
Optic Illuminator LED light (C-FLED2) NIKON 1003167 Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope
Eclipse Ni-U Microscope Nikon 932162 Epifluorescence Microscope
Microscope digital Camera Nikon DS-Ri2 Microscope camera
Intenslight Nikon C-HGFI Microscope lamp
NIS-Elements 64 bit Nikon AR 4.40.00 Analysis Software
Electric Razor Gemei GM-3007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
  2. Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. Anatomy and physiology of the blood-brain barrier. Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).
  3. Moretti, R., et al. Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain. Front Neurosci. 9, 40 (2015).
  4. Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
  5. Drouin-Ouellet, J., et al. Cerebrovascular and blood-brain barrier impairments in Huntington's disease: Potential implications for its pathophysiology. Ann Neurol. 78 (2), 160-177 (2015).
  6. Di Pardo, A., et al. Impairment of blood-brain barrier is an early event in R6/2 mouse model of Huntington Disease. Sci Rep. 7, 41316 (2017).
  7. Lecler, A., Fournier, L., Diard-Detoeuf, C., Balvay, D. Blood-Brain Barrier Leakage in Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (3), 923-925 (2017).
  8. van de Haar, H. J., et al. Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease. Radiology. 282 (2), 615 (2017).
  9. Fernandez-Lopez, D., et al. Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat. J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).
  10. Yang, Y., Rosenberg, G. A. Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease. Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).
  11. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. (6), e239 (2007).
  12. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. (9), e404 (2007).
  13. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  14. McCloy, R. A., et al. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).
  15. Burgess, A., et al. Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).
  16. Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions. PLoS One. 8 (2), e56419 (2013).
  17. Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F. Electron microscopy of the blood-brain barrier in disease. Microsc Res Tech. 27 (6), 543-556 (1994).

Tags

Neuroscience sayı: 129 kan - beyin bariyerini (BBB) BBB geçirgenliği FITC albümin ateş intravenöz enjeksiyon fare modeli

Erratum

Formal Correction: Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease
Posted by JoVE Editors on 11/10/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. One of the author's names was corrected from:

Maglione Vittorio

to:

Vittorio Maglione

Kan - beyin bariyerini geçirgenliği FITC etiketli albümin nörodejeneratif hastalık, bir fare modeli intravenöz infüzyonu tarafından değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Di Pardo, A., Castaldo, S., Capocci, … More

Di Pardo, A., Castaldo, S., Capocci, L., Amico, E., Maglione, V. Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. J. Vis. Exp. (129), e56389, doi:10.3791/56389 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter