Fissazione dell'etanolo e colorazione DAPI: un metodo per visualizzare il DNA in C. elegans

Overview

Qui descriviamo una tecnica usata per visualizzare il DNA genomico in nematodi fissi e intatti. Il video include un protocollo di esempio per contare la cromatina negli ovociti C. elegans non fecondati.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Clarke et al, Manipolazione di Ploidy in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp.

I ceppi tetraploidi possono essere convalidati contando il numero di cromosomi nei loro ovociti non fecondati. La microscopia fluorescente può essere utilizzata per lo schermo per il numero di coppie cromosomiche in ovociti diploidi non fecondati (prima delle divisioni meiotiche), se il ceppo ha un marcatore fluorescente per i cromosomi. In assenza di marcatori cromosomici fluorescenti, i nematodi tetraploidi possono essere schermati fissando i nematodi e macchiando con un colorante al DNA; vedi sotto per un protocollo per il fissaggio dell'etanolo e la colorazione da 4′,6-diamidina-2′-fenilindolo diidrocloruro (DAPI).

Colorazione DAPI animale intero

NOTA: I ceppi tetraploidi che trasportano 12 coppie cromosomiche connesse possono essere convalidati mediante colorazione DAPI di questi animali e contando il numero di corpi DAPI nei suoi ovociti non fecondati.

1. Posizionare da 5 a 10 μL di tampone M9 su uno scivolo del microscopio, quindi trasferire 6 - 10 nematodi alla goccia.
2. Al microscopio sezionato, disegnare la maggior parte dell'M9 dalla goccia senza rimuovere i nematodi con un tessuto detergente privo di pelucchi. Quindi, aggiungere immediatamente una goccia di 10 μL del 90% di etanolo sui vermi. Lasciare asciugare completamente i vermi, ma per non più di un paio di secondi.
3. Non appena l'etanolo evapora (questo può essere visto come accade al microscopio di sezionazione), aggiungere altri 10 μL di 90% di etanolo sui vermi.
4. Ripetere il passaggio 3.1.3 altre tre volte.
5. Una volta che l'ultima goccia di etanolo è evaporata, aggiungere 6 μL di colorante DAPI o Hoechst alla concentrazione finale raccomandata nei mezzi di montaggio di scelta (ad esempio, una diluizione di 1:1.000 di una concentrazione di 2 ng/μL DAPI in M9). Per la conservazione a lungo termine delle diapositive, può essere utilizzato lo 0,5% di p-fenilenediammina sciolta in Tris-HCl da 20 mM, pH 8,8, nel glicerolo al 90% come soluzione antifade, anziché solo M9.
6. Coprire i vermi sullo scivolo con un coverslip e sigillare i bordi del copripavimenti con smalto per unghie. Segnare in un microscopio a fluorescenza (passaggio 3.1.7) almeno 10 min dopo aver aggiunto il coverslip. Le diapositive senza antifade possono essere conservate per alcuni giorni a 4 °C prima di segnare, ma la qualità della fluorescenza inizia a diminuire dopo alcuni giorni.
7. Usando un microscopio fluorescente con ingrandimento 100X, segnare il numero di singoli corpi DAPI (presumibilmente singole coppie cromosomiche) nell'ovocita non fecondata più matura, che è immediatamente adiacente alla spermateca e non è ancora entrato nella spermateca o nell'utero.
   1. Per segnare singoli corpi DAPI all'interno di un nucleo di ovocita, utilizzare la messa a fuoco fine del microscopio per spostarsi lentamente dalla parte superiore del nucleo degli ovocite al fondo durante il conteggio. Quindi, riconteggiare lo stesso nucleo mentre si sposta la messa a fuoco nelladirezione opposta( cioè , dal basso verso l'alto del nucleo) per confermare il numero contato di corpi DAPI.
8. Ottieni l'ovocita non fecondata più matura in ciascuna delle due gonadi in almeno dieci ermafroditi per ceppo Lon stabile. Gli ovociti di tipo selvatico hanno in media 6 corpi DAPI, 5 coppie di autosomi e la coppia cromosoma sessuale. La presenza di 12 corpi DAPI nell'ovocita dei ceppi stabili di Lon indica che gli animali in questo ceppo sono tetraploidi parziali (4 insiemi di autosomi, 3 cromosomi X) o completi (4 set di autosomi, 4 cromosomi X).
9. Calcolare il numero medio di corpi DAPI osservati da più (almeno 10) ovociti per ceppo. Alcune coppie cromosomiche si toccano o si toccano l'una sopra l'altra, quindi il numero di corpi DAPI in un ovocita è spesso inferiore al numero effettivo di coppie cromosomiche.
10. (Facoltativo) Convalidare ulteriormente ceppi di Lon stabili in cui il numero medio di corpi DAPI è 12 per verificare se sono tetraploidi pieni (4A, 4X) o parziali (4A, 3X) mediante colorazione immunofluorescenza contro proteine dell'asse cromosomico come htp-3. Questa colorazione distinguerà le coppie cromosomiche mostrando un modello cruciforme da singoli cromosomi non interconnessi presenti nel tetraploide parziale.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting Microscope	Motic Microscopy	SMZ171
Name	Company	Catalog Number	Comments
Staining
Hoechst 33258, Pentahydrate	Biotium	40045
DAPI	Biotium	40011
Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol Fixation
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP	Koptec, VWR	89125-166
Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Buffer
Sodium chloride, Biotechnology Grade	VWR	97061-278
Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade	VWR	97062-346
Sodium phosphate, monobasic dihydrate	Fisher Scientific	AC271750025