Summary
Pluripotent insan kök hücrelerinin nöronal farklılaşma (hPSCs) için Protokoller genellikle zaman alıcı ve önemli hücre kültürü becerileri gerektirir. Burada, kontrollü bir şekilde insan nöronlarının, basit, hızlı ve verimli üretimi sağlayan bir multititre plaka biçiminde küçük bir moleküldür tabanlı farklılaşma prosedürü adapte var.
Abstract
Insan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) gelen nöronların nesil için mevcut protokoller genellikle önceden terminal farklılaşma için nöral prekürsör hücrelerinin izolasyonu ve genişleme içeren çok adımlı prosedürler vardır bunda sıkıcı vardır. Bu zaman alıcı bir yaklaşım ile karşılaştırıldığında, son zamanlarda üç sinyalleme yolları, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, FGF ve / ERK, kombine inhibisyonu fonksiyonel nöron içine hemen fark ardından hPSCs gelen nöroektodermin hızlı bir indüksiyon teşvik olduğunu bulduk. Burada, biz daha da tekrarlanabilirlik geliştirmek ve orta hacimli uygulamalar ile uyumlu hale getirmek için, bir roman multititre plaka formatı bizim prosedürü adapte etmişlerdir. Yapışık koşullar altında nöronlara geri farklılaşma bir başka dört gün ardından yüzer küreler (embriyoid gövdeler), oluşum içinde nöroektodermin dört gün kapsamaktadır. Bu protokol ile elde Hücrelerin çoğu bipolar duyusal nöronlar görünmektedir. Ayrıca,prosedürü, yüksek verimli olup özellikle uzman beceri gerektirmez, ve maliyet-etkin küçük moleküllerin basit bir kimyasal yapısı orta dayanmaktadır. Bu özellikleri sayesinde, işlem daha fazla fonksiyonel inceleme için yararlı bir platform olarak hem de hücre-bazlı tarama insan duyu nöronlarının veya herhangi bir tür nöronlar gerektiren yaklaşımlar için de kullanılabilir.
Introduction
hPSCs, oluşan embriyo kökenli insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSCs), onlar vitro 1-2 çeşitli hücre soylarının ortaya çıkmasına neden olabilir pluripotent anlamı vardır. Çok sayıda farklı hücre tipleri bu hücrelerin bilimsel araştırma ve hücre tabanlı tarama yaklaşımlar için değerli araçlar sunmak, ve hücre tabanlı tedavi için ümit vaat fikrini destekleyen güncel hESC elde edilmiştir.
Genellikle ilgi 3-6 belirli bir nöron tipi içine nöral progenitörlerinin manuel izolasyon ve sonraki terminal farklılaşma ardından ilk uyaran genel nöral kaderi esas olarak hESC için nöronal farklılaşma protokoller genellikle karmaşık ve zaman alıcıdır. Bazı bağlamda, bu karmaşıklığı erken insan gelişimi, hangi mimik gibi state-of-the-art yönettiği farklılaşma mekanizmalarının aşamalı eğilimi göz önüne alındığında şaşırtıcı ve kaçınılmaz değildirh kendi içinde son derece karmaşık. Diğer yandan, kısmen de uzak tam olarak optimize edilmesini hala farklılaşma protokolleri ile sonuçlanan, altta yatan moleküler süreçleri anlama eksikliği bizim yansıtıyor olabilir.
Nöroektodermin Pera, et al farklılaşmamış hPSCs dönüşüm ile ilgili olarak. BMP / SMAD1/5/8 sinyalizasyon bastırılması hESC 7 nöral indüksiyonu arttırdığını buldu. Ayrıca, Smad2 / 3 sinyal inaktivasyonu nöroektodermin oluşumunu teşvik etmek için 8 gösterilmiştir. Buna göre, bu iki yolun kombine inaktivasyonu hPSCs 4,9 arasında daha verimli sinir indüksiyonuna yol açma eğilimindedir. Daha yakın zamanlarda, biz üçüncü bir sinyal yolağı, FGF / ERK, hESC içinde nöroektodermal taahhüdü ilk adımları güçlü bir baskılayıcı olarak hizmet verdiğini göstermiştir. Tersine, tüm bu üç yollarının eş zamanlı baskı ile nöroektodermin içine hESC yakın homojen dönüşüm yol10 sadece dört gün içinde. Akabinde, fonksiyonel nöronlar içine yüksek verimli terminal farklılaşma sekiz gün içinde gözlenmiştir. Elde nöronlar kısmen onların hızlı derivasyon 10 açıklayabilir periferik sinir sistemi, duyu nöronlar olması olasılığı vardı. Duyusal nöron bakım Kusur gibi ailesel disotonomi 11 gibi bazı insan hastalıkları nedeni kabul edilir. Bu gibi başka fonksiyonel karakterizasyonu için hiPSC teknolojisi 12 dayalı hastalıklar, nöron de herhangi bir özel tür istenmediğinde uygulamalı amaçlı olarak modellenmesi için, bu işlem yararlı bir türev olarak mevcut olabilir.
Ancak, farklılaşma biz aslında hESC koloniler 10 kümeleri gelen embriyonik organları dahil oluşumu (EBS) istihdam stratejisi ve bu EB boyutları ile ilgili heterojenlik oldukça derecesi sonuçlandı, ve ayrıca bazı ce nöron oluşumunu verimliliğini tehlikeye çıktıll hatları. Ayrıca, EB boyutlarda heterojenliği nedeniyle, sistematik nöron oluşumu sırasında ve sonrasında ek büyüme faktörleri veya küçük moleküllerin etkilerini test etme olanağı biraz şaşırmış göründü.
Bu yazıda, aynı zamanda diğer bağlamlarda 13'te gösterilen, son derece boyutu-kontrollü bir şekilde EBS oluşturmak için bir orta throughput uyumlu, zorla kümeleme tabanlı tekniği bizim önceki yordamı uyarlanmıştır. Daha sonra, süspansiyon EBS olarak nöroektodermin oluşumunu başlatmak üzere, 96-oyuklu plakalar V-şekilli U şeklinde kuyuları ultra-düşük bağlanma plakaları 96-aktarılmıştır oluşturulur. Dört gün sonra, EBS yüksek verim ve homojenliği de ölümcül diferansiye nöronların doğuran üzerinden kaplanmış olabilir. Alternatif olarak, gün-4 EBS tek hücre halinde ayrılmış ve insan nöronların düşük yoğunluklu mono tabakaları ile sonuçlanan, örneğin dışarı kaplama. Koherent sonuçlar şimdiye kadar iki bağımsız de elde edilmiştirrived hESC hatları, HuES6 ve NCL3.
Bir ön koşul olarak, başarılı EB oluşum birlikte HESC hayatta kalma 13-14 teşvik etmek için bilinen KAYA inhibitörü Y-27632 ile birlikte, bir sentetik polimer, polivinil alkol (PVA) kullanımı üzerinde sıkı bir şekilde bağlı olduğu anlaşılmıştır. Sonuç olarak, EBS homojenliği 96-V-plakaları içinde oluşan büyük ölçüde rasgele bölme tekniklerine dayalı kütle kültürler olarak EBS oluşumu göre geliştirilmiştir. Bu sistem, bu nedenle yapışkan koşullar altında yüksek kontrollü nöron oluşumu, ardından süspansiyon kültürü içinde nöroektodermin oluşumu için önemli ölçüde geliştirilmiş bir platform sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Matrigel kaplı plakalar ve Medya hazırlanması
- Matrigel kaplı plakalar Matrigel hazırlanması EBS farklılaşan tutturulması için tercih edilen bir alt tabaka olduğu bulunmuştur ve aynı zamanda bu 10 nöronların etkili fazla büyüme teşvik edilmiştir.
- Buz üzerinde gecede Matrigel Çözülmeye 10 ml.
- Ertesi gün, buz DMEM/F-12 iki ciltlik jöle benzeri Matrigel sulandırmak ve -20 ° C'de dondurularak saklanmalıdır olabilir önceden soğutulmuş 15 ml konik tüpler içinde 1 ml alikotları hazırlamak
- Nöronal farklılaşma için bir tabak biçimi üzerinde karar verin. Örneğin, bir başlangıç noktası olarak, bir 12-kuyu biçiminde farklılaşma ilk turda yapılmasını önermekteyiz. 4 ° C'de ön-serin dört adet 12 oyuklu plakalar Her prediluted Matrigel çözülmüş ve çözünene kadar yukarı ve aşağı pipetleme ardından önceden soğutulmuş DMEM/F-12 9 ml ilave edilerek dondurulmuş Matrigel bir kısım eritilir.
- O zaman, Buz (nihai Matrigel seyreltme: 1:75) üzerinde DMEM/F-12 15 ml içeren 50 ml'lik yeni bir tüp içine içeriği aktarın. Daha sonra, önceden soğutulmuş 12 oyuklu plakalar, her bir kuyucuğa Matrigel seyreltilmiş 0.5 ml eklenir. Parafilm ile plakaları sarın ve gece oda sıcaklığında bekletin.
- Ertesi gün, 4 ° C'ye plakaları aktarmak Kaplamalı plakalar kullanılmadan önce birkaç hafta saklanabilir.
- Medya
EB formasyonu orta (bir 96-plaka farklılaşma gerçekleştirmek için gerekli ~ 15 ml - Şekil 2 Tablo 1 ve şemaya bakınız):
DMEM/F-12 0.4 ile% alkol (PVA)
1x N2
1x B27
% 0.05 BSA
20 ng / ml FGF2
10 uM Y-27632
1x PenStrepGln
Farklılaşma, orta (bir 96-plaka farklılaşma gerçekleştirmek için gerekli ~ 30 ml, tek Matrigel kaplı 12-plaka nöron oluşumunu takip bkz. Tablo 1):
DMEM/F-12
1x N2
% 0.05 BSA
0.5 uM PD0325901
15 uM SB431542
0.5 uM Dorsomorphin
1x PenStrepGln
2. Zorla EB Oluşumu
- Tercih besleyici serbest koşullarda hPSCs büyütün. Biz Matrigel kaplı 6-kuyucuğu 15 MEF-klimalı ortamda kullanabilirsiniz. Ancak, ev yapımı ya da ticari tanımlanan medya gibi diğer kültür sistemleri de çalışması gerekir. Farklılaşma deney başlangıç zamanda, hPSCs alt birleşik ve aktif büyüyen olmalıdır.
- Mekanik bir stereo mikroskop altında steril plastik pipet kullanarak kendiliğinden ayırt koloniler çıkarın.
- 1X Y-27632 içeren Accutase kullanarak tek hücreler PBS ve özet kullanarak kalan indiferansiye koloniler yıkayın. EB oluşum ve bir orta hematocytometer kullanarak hücre titre belirlemek küçük bir hacim içinde tekrar süspansiyon 2 dakika için 200 x g'de santrifüj ile pelet tek bir hücre.
- Hücrelerin bir kısım ekleml başına 40.000 ve 80.000 hücreler arasında titre sonuçlanması kalan EB formasyonu orta.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak, kuyu başına 4.000 ila 8.000 hücreleri sonuçlanan bir 96V-alt plaka kuyu başına 100 ul aktarın. 1 dakika boyunca 400 xg'de bir salıncak-plakası santrifüj Spin 96-plaka kuyu dibinde hücreleri toplamak, ve hücre kültürü inkübatör aktarmak. Şekil 1 'de gösterildiği gibi EBS, bir gecede oluşturacaktır.
3. Nöroektodermin İndüksiyon
- Ertesi gün (0. gün), farklılaşma, orta 2 ml içeren 3,5 cm bakteriyel çanak içine küçük bir hacimde bir stereo mikroskop ve transfer altında 96V plaka EBS toplamak. Yavaşça EBS yıkamak için birkaç saniye için çanak ajitasyon.
- 100 farklılaşma orta ul başına iyi bir ultra-düşük-eki U-alt 96-plaka ekleyin. Stereomikroskopta altında, 96U-kuyulara bulaşık gelen küçük hacimli transferi EBS (biz başına bir EBll). Nöroektodermin oluşumuna izin vermek için 4 gün boyunca hücre kültürü inkübatör içine yerleştirin 96U plakası.
4. Nöron Oluşumu
- 4. günde, adım 3.1 'deki gibi bir bulaşık hazırlamak ve ayrıca farklılaşması orta (kuyu başına 1 ml) önceden ısıtılmış Matrigel kaplı 12-plaka içinde DMEM/F-12 değiştirin.
- EBS Kaplama
- 96U plaka EBS toplayın, bu yukarıdaki gibi ve dikkatle tohum yıkayın onları Matrigel kaplı 12-plaka kuyu içine bir (kuyu başına yaklaşık 8 EBS) tek: EBS eşit rahatsız edilmeden sonucudur izin kuyu içinde dağıtılmış olmalıdır önümüzdeki günlerde nöronlar (Şekil 2 "Günde 5" resme bakın).
- Kuvöz içine 12-plaka geri devir işleminden önce, EBS gevşek RT yaklaşık 10 dakika eklemenize izin verir. Daha sonra, hücre kültürü kuluçka makinesi ile 12-kuyucuklu levha dikkatli bir şekilde aktarılır. Nöronlar Sho olarak, bir sonraki 4 gün içinde, bir radyal bir şekilde dışarı kaplama EBS büyüyecekŞekil 2'de wn ("günlük 8" sağdaki resim).
5. Monolayers olarak Nöron Oluşumu
- Noktası 4 adım alternatif olarak), prosedürün 4. günde, farklılaşma, orta 2 ml içeren 3,5 cm bakteriyel yemeğin içine EBS toplamak, sonra sonra içine bir PBS içeren çanak küçük bir hacimde EBS aktarabilir ve Accutase içeren başka bir yemek.
- Farklılaşma orta küçük bir hacim içinde tekrar süspansiyon tek hücreler, 2 dakika için 200 x g'da santrifüj, ile sindirmek ve bir hematocytometer kullanarak hücre titre belirlesin. Farklılaşma, orta (Y-27632 olmadan) kullanarak ml başına 1-2x10 6 hücre için titre ayarlayın.
- Önceden ısıtılmış Matrigel kaplı 12 oyuklu plaka (çukur başına 1 mi) çözündürüldü, ve hücre kültürü kuluçka makinesi için transfer Levha hücreleri. Mono tabakalar olarak Neuron oluşum günde 7-8 (Şekil 3C) arasında gözlenmiştir. Bununla birlikte, belirtilmelidir ki, bu tek tabaka varyantprosedürün tam hücre sağkalım ve en uygun substrat açısından optimize edilmemiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir önceki raporda, pek çok diğerleri ile uyumlu, hPSCs gelen EBS düşük eki yemekler 10 içine hPSCs rutin bölüştürülmesi sırasında agrega replating basitçe oluşturulmuş olabilir. Çıkan EB boyutları (Şekil 1C, üst) geniş bir dağılım Bu genellikle sonuçları. Bu kaynaklanan bir başka sorun süspansiyon muhafaza EBS EB boyutlarda da yüksek heterojenite giden, birbirleri ile agrega eğiliminde olmasıdır. Bu sorunları aşmak için, biz bu nedenle multititre plakaların düşük eki kuyu (Şekil 1A) içine tek hPSCs kaplama ile EBS üretmek için çalıştı. Bu, EB oluşumu ve hücre ölümü (Şekil 1B, sağ alt) ile sonuçlanmıştır. HPSCs için bilinen bir yaşam molekülü uygulanması, Y-27632, benzer sonuçlar verdi. Benzer şekilde, önceden hESC 16 EB oluşumunu arttırmak için gösterilmiştir uygulanarak polivinil alkol (PVA), 96V altındaki hPSCs "toplamak" eğilimi-Kuyu ancak EB oluşumuna yol açmamıştır. Ancak, PVA takviyesi ile Y-27632 birleştirerek, biz kolayca kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında hESC tek hücre süspansiyonları, (Şekil 1B) den EBS oluşturmak başardık. Uygun, bu multititre plaka biçiminde EB boyutları sıkıca geleneksel teknikler (Şekil 1C, alt) kullanılarak aksine, hücre başına da farklı sayıda tohumlu tarafından kontrol edilebilir.
96V plakaları de inkübasyon sırasında ancak, EBS kuyuların alt ayrılmamak eğilimindeydi. Bu nedenle, EB oluşumundan sonra günde, bu ultra-düşük eki 96U plakaları (Şekil 1A) EBS aktarmak için gerekli oldu. Nöroektodermin sonra PD0325901 (FGF / ERK inhibitörü), SB431542 (TGFβ/SMAD2 inhibitörü) oluşan küçük bir molekül kokteyl ile bu biçimde oluşturulan ve dorsomorphin (BMP/SMAD1 inhibitörü), 10 olarak tanımlanmaktadır. Takiben nöroektodermin oluşumu(Şekil 2), bu küçük molekül kokteyli kullanarak, EBS yüzeyleri Matrigel ile kaplanmış olması kaydıyla, herhangi bir biçimde ilgili nöronlar doğuran dışarı kaplama yapılabilir. Farklı hücre sayıları (Şekil 1C, alt) ile EB oluşumunu başlatarak, biz EBS iyi nöronal farklılaşma kapasitesi elde etmek eğilimindedir 8000 hücrelerinin etrafında oluşturulan bulundu. Bu durum, kaplama sonrası nekrotik EB merkezleri azaltılmış kaplama EBS, ve bu BRN3A ve β-III tübülin (Şekiller 2 ve 3A, B) gibi duyusal ve pan-nöronal belirteçlerin yüksek ifade itibaren belirgin nöronal çıkıntılar ile karakterize edilir. Genel nöronal farklılaşma verimlilikleri hESC ve hiPSCs 10 hem uygulanabilecek olan özgün yordamı (~% 70) (Şekil 3) ile kıyaslanabilir olduğu görülmektedir. Biz bugüne kadar multiwell prosedürü iki bağımsız hESC hatları, HuES6 ve NCL3, istihdam var differentiatio hücre hattı bağlı değişkenliği isen verimleri genellikle göz ardı edilemez.
HPSC türetilmiş sinir hücrelerinin çeşitli uygulamalar yerine kaplama EBS farklılaşmış hücre mono tabakaları gerektirir. Bu nedenle de protokol günde 4 (Şekil 2, orta) de olası nöroektodermal hücre küre Accutase kullanarak tek hücrelere ayrılmış olup olamayacağını araştırdık; sonra mono tabakaları olarak kaplanmış olması. Nitekim, gün-4 nöroektodermal hücrelerin tek hücreleri kaplama üzerine, nöronal bu replated hücrelerin farklılaşma yaklaşık% 60 verimlilik (Şekil 3C) elde edilir telaffuz.
Şekil 1. EB oluşum yöntemi. EB oluşum prosedür A) şematik. Differe başlanmadan önce bir gün ntiation (d-1), 100 ul başına birkaç bin hücreleri içeren hESC bir süspansiyon santrifüjleme ile, ardından 96V kuyu içine ekilmiş edilir. EBS sonra ileri tedavi için ultra-düşük eki 96U kuyulara aktarılır gecede kurdu. B) EB oluşumu üzerine PVA ve Y-27632 etkilerini test. EB oluşumu yalnızca PVA ve Y-27632 (ok başı bakın) hem de içeren orta gözlenen olabilir C) Üst:. Geleneksel yöntemlerle oluşturulan EBS genellikle boyutu heterojendir. Taban: EBS girişi farklı hücre sayıları kullanarak A. tasvir "sıkma EB" tekniği ile oluşturulan, EB boyutlarda sıkıca kontrol edilebilir ve son derece düzgün idi. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
35fig2highres.jpg "/>
Şekil 2. Neuron oluşum akış şeması. Bir gün farklılaşmanın başlaması (d-1) önce, EBS belirtilen EB oluşum ortam kullanılarak 96V plaka üretilir. 96U tabak içine EBS devrini takiben nöral indüksiyon farklılaşma ortamı kullanılarak başlatılır. 4 gün sonra, EBS istenilen multiwell biçimi Matrigel-kuyucuklar içinde kaplanır. Örnek morfolojileri her adım için gösterilmiştir. Sağdaki resimde kaplama EBS tipik nöronal çıkıntılar gösterir - üzerine yüksek hücre yoğunluğu alanı çok doğru nöronlar radyal şekilde dışarı büyürler hangi kaplama EB merkezinin bir parçasıdır. Alternatif olarak, 4. günde, EBS tek hücrelere ayrılmış olabilir ve mono tabakaları (metin ve ayrıntılar için 3C Şekil). Gibi terminal farklılaşma için dışarı kaplama büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. Nöronların Karakterizasyonu. Günün A) Real-Time RT-PCR karakterizasyonu 8 toplu nöronal kültürlerin. Farklılaştırılmış örneklerinde nöral krest ve pan-nöronal marker genleri farklılaşmamış kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında güçlü upregüle olduğunu unutmayın. 16.000 hücreleri ile başlatılan örnekleri yüksek nöronal ekspresyon düzeyleri (logaritmik ölçekleme dikkat edin), EBS gösterdi rağmen 8.000 4.000 arasındaki hücrelerin morfolojik kriterlere göre en yararlı olduğunu kanıtladı. B) kaplamalı EBS dışarı büyüyen çoğu hücreleri için pozitif boyanan nöronlar vardır beta- III tubulin (kırmızı) ve duyusal nöron işaretleyici BRN3A (yeşil). C) Nöronlar tek hücre kaplama yerine EBS kaplama sonrası oluşan. Protokolün 4. günde (Şekil 2), Kayan EBS Accutase kullanılarak ayrılmış ve daha sonra ölümcül monolayers olarak ayırt etmek için tek bir hücre olarak seribaşı idi. Hücre canlılığı gibi EB kaplama ile karşılaştırıldığında biraz azalmış olduğu ortaya çıktı ise de sol tarafta gösterilen, beta-III tubulin için pozitif boyandı bu tipik nöronal morfolojiye sahip hücreleri kolayca elde edildi. Sağ: nöronal verim İmmünositokimya tabanlı miktarının (n + / analiz = 3 temsili bölümleri - SD). büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
| Gen adı | F primer sekans | Rev primer dizisi |
| ACTB (temizlik geni) | TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG | ACATCTGCTGGAAGGTGGACA |
| RPL37A (temizlik geni) | GTGGTTCCTGCATGAAGACAGTG | TTCTGATGGCGGACTTTACCG |
| DCX | AGGGCTTTCTTGGGTCAGAGG | GCTGCGAATCTTCAGCACTCA |
| ISL1 | TTTATTGTCGGAAGACTTGCCACTT | TCAAAGACCACCGTACAACCTTTATCT |
| MAPT | TTACCCTGGGCACTGGCCTA | TCCTGCTCAACATGGCAAACTC |
| NEUROD1 | GACTGATTGCACCAGCCCTTC | CGGACGGTTCGTGTTTGAAAG |
| NEUROG1 | CAGAGACAAGGAGTGGGCTTCA | CTCCAGCCCTGTGCCTGAAT |
| SOX10 | TCCTTGCCAGCTCCCTCTTC | CAAGGGTTAGGGCCTGAGCA |
| SYT4 | GCCAATCTCACCACCCAAATG | CACACACCATGCTTCCTTCCA |
Tablo 2'de. Primerler RT-qPCR için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bizim önceden yayınlanmış prosedürü dahil olmak üzere 10 hPSCs, gelen EB oluşumunu gerektirmeyen En farklılaşma protokolleri manuel veya kaçınılmaz EB boyutlarda heterojenite neden agrega gibi hESC enzim destekli hasat dayanmaktadır. Bu durum, bu şekilde üretilen bir orta boyutta, özellikle de sistematik analiz zor hale getirir bazı hücre çizgilerinden ile farklılaşması verim olarak değişkenlik yol açar. Ayrıca, manuel diseksiyon kendisi tarafından ölçeklenebilirlik ödün hangi emek yoğundur.
Buna karşılık, burada tarif edilen yöntem örnekleri arasında hücre işleme en aza indirir ve değişkenlik kolaylaştıran tekli hücrelerden EB oluşum dayanmaktadır. Önemlisi, biz nöron içine genel farklılaşma kapasitesi sıkma EBS ile protokol başlatarak etkilenmektedir olmadığını göstermektedir. Ayrıca, tutma 96 oyuklu plakalar kullanılarak süspansiyon vasıtasıyla birbirinden ayrılır bireysel EBS t önler10 geleneksel prosedür yine bir başka dezavantajı sunulur - süspansiyon olarak birbirleri ile araya gelen kenar. Sonuç olarak, verilen bir deneyi başlatmak için gerekli giriş hPSCs miktarı subconfluent hPSC koloniler 6-kuyulu plakanın da genellikle yaklaşık olarak bir, iki 96 oyuklu plakalar içinde farklılaşması başlatmak için yeterli olduğu düşüktür. Son olarak, spin EB tekniği EB boyutları üzerinde sıkı kontrol sağlar. Bizim gözlemlerimize göre, nöronal belirteçlerin ekspresyon düzeyleri kaplama EBS (Şekil 3A) artan boyutları ile bir dereceye kadar artış eğilimindedir. Öte yandan, çok büyük EBS sonra kaplama nekrotik merkezlerini göstermek için eğilimindedir. Bu nedenle, bir uzlaşma yolu olarak, biz 4.000 8.000 hücrelerin EBS uygun bir aralık olarak bulundu.
Yüksek verimlilik nedeniyle, basitlik, hız ve maliyet-etkililik, biz açıklanan yöntem fonksiyonel çalışmalar için yararlı bir platform olmak tahmin, hastalık modelleme insan lar gerektirenensory nöronlar, veya herhangi bir tür nöronlar gerektiren orta üretilen hücre-bazlı farmakolojik ölçülür. İkinci uygulama ile ilgili olarak, bu tür yüksek içerik olarak otomatik bir görüntü analizi ile uyumluluğu arzu edilmektedir. Bununla birlikte, bu kaplama EBS periferal tek outgrowing nöronlar olarak analiz edilmesi gerçeğiyle bozulabilir. Bu engeli aşmak için, biz de protokol 4. günde EBS rarak tek hücreleri kaplama ile nöronların monolayers oluşturmak için çalıştı. Gerçekten de, Şekil 3C ve veri nöronların yaklaşık olarak% 60 arasında makul bir verim oluşmuş olduğunu göstermektedir. Ancak, protokolün bu varyasyonun daha farklı bir eki substrat kullanılarak örneğin, araştırdı ve optimize olabilir düşündüren, bu şartlar altında hücre canlılığı bir düşüş gözlenmiştir. (Adım 5.2 gün-4 hücreleri kaplama üzerine Y-27632 ilavesi Kaplama sonrası hücre canlılığı teşvik yaptım ama o da w müdahale göründüITH sonraki nöronal farklılaşma ve bu nedenle ihmal edilmelidir.) Ayrıca, aynı zamanda protokol ikinci aşamada orta kompozisyonu değiştirilerek, nöronların diğer türleri bu platform ile oluşturulmuş olabilir olup olmadığını araştırmak ilginç olacaktır. Ayrıca, 0. günde 96U-şekilli kuyu içine 96V dan EBS transferi ile ilgili olarak, sonuçta açıklanan yönteme yüksek verim uyumluluğu sağlamak için, çok kanallı bir pipet kullanımı göre usul hazırlamak için arzu edilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Max Planck Topluluğu tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
- Pera, M. F., et al. Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin. J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity. Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).
- Greber, B., et al. FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells. EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).
- Anderson, S. L., et al. Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene. Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
