Summary
人类多能性干细胞（神经元分化hPSCs）的协议往往是费时的，并需要大量的细胞培养的技能。在这里，我们已经适应了小分子的分化过程，一个multititre板格式，可以简单，快速，高效的人类神经元的产生可控制的方式。
Abstract
现有的协议从人类多能干的细胞（hPSCs）的神经元的产生往往是繁琐的，因为它们是多步程序涉及的分离和扩增的神经前体细胞，细胞的终末分化之前。在这些耗时的方法相比，我们最近发现，从hPSCs，随后立即分化为功能性神经元相结合，抑制信号转导通路，TGFβ/SMAD2，BMP/SMAD1，和FGF / ERK，促进快速诱导神经外胚层。在这里，我们已经适应了我们的程序一种新型的multititre板的格式，以进一步提高其可重复性和吞吐量的应用程序中，使其符合。它包括四个天的神经外胚层形成在浮动球（胚状体），其次由进一步4天，分化成神经细胞的粘附条件下。本协议获得的大多数细胞是双极性感觉神经元。此外，高效的程序，是不需要特别的专业技能，是基于一个简单的化学介质，具有成本效益的小分子。由于这些特点，该过程可作为一个有用的平台，为进一步功能研究以及基于细胞的筛选采用，但需要的任何类型的人体感觉神经细胞或神经元。
Introduction
hPSCs，其特征在于，包括胚胎衍生的人胚胎干细胞（胚胎干细胞），诱导式多能性干细胞（人iPS细胞），是多能干细胞的，这意味着它们可以带来各种体外1-2细胞谱系。许多已分化的细胞类型，支持最新的来自人类胚胎干细胞，这些细胞的科研和基于细胞的筛选方法，提出了有价值的工具和细胞为基础的治疗方法有希望的概念。
人胚胎干细胞的神经元的分化协议通常是复杂和耗时的，因为它们通常是基于第一引导整体神经命运，然后通过手动隔离的神经祖细胞，分化成一个给定的神经元类型感兴趣的3-6和随后的终端。在某些方面，这种复杂性是不令人惊讶的和不可避免的，因为这种状态的最先进的定向分化协议，以逐步趋向模仿人类发展的早期，which是在本身极为复杂。另一方面，它可能会在部分也反映了我们缺乏了解潜在的分子过程，造成分化的协议还远远没有得到充分的优化。
的未分化的hPSCs转换成神经外胚层，佩拉等方面。发现，抑制BMP / SMAD1/5/8的信令增强了人类胚胎干细胞神经诱导7。此外，SMAD2 / 3信号的失活已被证明能促进神经外胚层形成8。因此，结合这两种途径的失活会导致更有效的神经诱导hPSCs 4,9。最近，我们已经表明，三分之一的信号转导通路，FGF / ERK，作为最早的步骤的神经外胚层承诺在人类胚胎干细胞强大的阻遏。相反，同时压制所有这三种途径导致近均匀的胚胎干细胞转化成神经外胚层在短短的四天10。随后，高效的终端分化为功能性神经元观察到八天之内。得到的神经元可能是感觉神经元的外周神经系统，这可能部分解释了他们的快速推导10。感觉神经元的维护中的缺陷被认为是某些人类疾病如家族性自律神经失调11的一个原因。对于这类疾病的建模基于hiPSC技术12，为进一步的功能特性，以及为应用的目的，不需要任何特定类型的神经元，这种分化过程可能存在一个有用的基础。
然而，我们最初采用差异化策略参与胚体形成的团块（EBS）从人类胚胎干细胞的殖民地10，这造成了相当程度的异质性EB尺寸，也出现了妥协神经元形成在某些行政长官效率LL线。此外，由于的异质性EB尺寸，能力，系统测试期间和之后的额外生长因子或小分子神经元形成的影响似乎有点混淆。
在这份报告中，我们调整了我们的前面的过程中等吞吐量兼容，被迫聚集为基础的新技术，将EBS的一个高度规模控制的方式，也显示在其他情况下13。随后，生成的类胚体在V形的96孔板的孔中，被转移到U形的超低附件96 - 孔板中，，发起神经外胚层形成悬浮液中。四天之后，胚体可以镀出，引起终末分化的神经元，在高效率和均匀性。或者，天-4类胚体分离成单个细胞，这样，这导致人类的神经元的低密度单层镀出。迄今获得的两个独立的相干结果甚巨，人类胚胎干细胞的线，HuES6和三氯化氮。
作为先决条件，成功的EB形成严格依赖于使用的是合成聚合物，聚乙烯醇（PVA），连同已知可促进胚胎干细胞的生存13-14的 ROCK抑制剂的Y-27632。其结果是，形成的类胚体的均匀性在96-V-板大幅提高相比，作为基于随机分裂技术的大规模培养的类胚体中的形成。因此，该系统提供了一种显着改善的平台神经外胚层形成悬浮培养，然后通过粘合条件下的高度控制的神经元形成。
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Protocol
1。的基质胶涂层钢板和媒体的制备
- 基质胶涂层钢板基底膜的制备已被发现是一个优选的基板胚体分化附件，也促进了有效的产物，从这些10个神经元。
- 解冻10毫升的Matrigel上冰过夜。
- 第二天，稀释果冻状的基底膜与两体积的冰冷的DMEM/F-12和准备的1毫升的等分试样，在预冷的15毫升锥形管，它可以被存储于-20℃下冷冻
- 决定一盘格式为神经细胞的分化。例如，作为一个起点，我们建议在12孔格式执行初始一轮的分化。预冷却4个12孔板中，在4℃下溶解冰冻Matrigel的一个等份通过加入9毫升预冷DMEM/F-12，然后通过移液向上和向下，直到所有的预稀释Matrigel的解冻并溶解。
- 然后的内容传送到一个新的50毫升试管中含有15毫升的DMEM/F-12冰（最后Matrigel的稀释：1:75）。然后，添加0.5毫升稀释的基质胶的预冷却的12孔板的各孔。用Parafilm包裹板，静置过夜。
- 第二天，转移板至4℃。涂覆后的板，可以被存储在使用前几个星期。
- 媒体
EB形成培养基（〜15毫升需要执行在一个96孔板中的分化- 见表1和图2中的计划）：
DMEM/F-12与0.4％的聚乙烯醇（PVA）
1个N2
1个B27
0.05％BSA
20毫微克/毫升FGF2
10μMY-27632
1个PenStrepGln
分化培养基（〜30毫升，随后需要执行在一个96 -孔板的分化神经元形成在一个基底膜涂层12孔板中，请参阅表1）：
DMEM/F-12
1个N2
0.05％BSA
0.5μMPD0325901
15μMSB431542
0.5μMDorsomorphin，
1个PenStrepGln
2。强制EB的形成
- 您的首选的无饲养层条件下成长hPSCs。我们使用MEF条件培养基对基质胶涂层的6孔培养板15。然而，其他文化系统，如自制或商业媒体也应该工作。在开始分化实验的时间，hPSCs应该子汇合生长活跃的。
- 机械去除自发分化的殖民地，在立体显微镜下用消毒过的塑料吸管头。
- 用剩余的未分化的殖民地，用PBS和摘要单细胞Accutase含有1X Y-27632。佩莱通过离心分离的单细胞在200×g离心2分钟，重新悬浮在少量体积的EB形成介质，并用血细胞计数板计数测定细胞滴度。
- 细胞的等分试样加入到其它EB形成介质导致在40000和80000之间的每毫升细胞滴度。
- 使用多通道移液管，每孔100μl转移到96V型底的板，从而在4000至8000每孔细胞。自旋96 - 孔板中在400×g离心1分钟的摆动离开板离心机在井的底部，以收集细胞，并转移到细胞培养孵化。胚体过夜，将形成在图1中所示。
3。神经外胚层感应
- 第二天（0天），收集的EB从96V盘下立体显微镜和转让，体积小到一个3.5厘米的细菌培养皿中2毫升的分化培养基。轻轻地搅动几秒钟的菜洗的EBS。
- 分化培养基中加入100μl的超低附着U型底的96 - 孔板每孔。在体视显微镜下洗涤菜到96U井的小卷，转让的EB（1 EB每次我们LL）。 96U板到4天，让神经外胚层形成的细胞培养孵化器。
4。神经元的形成
- 在第4天，在步骤3.1中制备的洗涤皿和另外取代DMEM/F-12预先温热基质胶涂层的分化培养基（1毫升，每孔）的12孔板中。
- EBS的电镀
- 收集的EB从96U板，洗这些以上，并仔细的种子，他们一成井的基质胶包被的12孔板（每孔约8 EBS）：EBS应均匀地分布在井允许不受干扰的产物，在接下来的日子里的神经元（参见图2中的“5天”的形象）。
- 未转让前的12孔板回孵化器，允许，胚体松散地连接在室温下10分钟左右。然后，小心地将12孔板细胞培养孵化器。神经细胞会生长出放射状的镀胚体在接下来的4天中，作为资助自置居所图2中的WN（“8天”的形象在右边）。
5。神经元形成的单层膜
- 作为一种替代方法的步骤的第4点），在该程序的第4天，收集到一个3.5厘米的分化培养基中含有2毫升细菌培养皿中的类胚体，然后将其转移类胚体在一个小体积的PBS含盘，然后到另一道菜Accutase。
- 让消化单细胞在200×g离心2分钟，离心，重新悬浮在分化培养基中的小体积，并用血细胞计数板计数测定细胞滴度。调整滴度1-2X10 6细胞分化培养基（无Y-27632），使用每毫升。
- 板细胞预先温热的基底膜涂层12孔板每孔（1毫升），并转移到细胞培养孵化。神经元形成作为单层之间观察到7至8天（ 图3C）。然而，应当指出，这单层变种的过程对细胞的生存和最合适的衬底是不充分的优化。
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Representative Results
在我们以前的报告中，胚体从hPSCs可能与许多其他，产生，简单的replating到常规的hPSCs分裂聚集在低附着的菜肴10。这通常会导致一个广泛分布的EB尺寸（ 图1C，上图）。由此而产生的另一个问题是保持在悬浮液中，类胚体彼此倾向于聚集，导致到一个更高的异质性EB体积。为了规避这些问题，因此，我们试图产生的EB电镀单hPSCs到低附着，井multititre板（ 图1A）。这导致在没有EB的形成和细胞死亡（ 图1B，右下）。施加一个已知的生存分子的hPSCs，Y-27632，得到类似的结果。同样地，施加的聚乙烯醇（PVA），先前已被证明提高EB形成胚胎干细胞16，倾向于以“聚集”的在底部的96V hPSCs井，但并没有导致EB形成。但是，如果Y-27632的PVA补充，我们能够很容易地产生胚体从人类胚胎干细胞的单细胞悬液，在已有化学定义的条件下（ 图1B）。为方便起见，可以严格控制EB大小此multititre板格式通过不同数量的细胞，每孔播种，相反，使用传统的技术（ 图1C，底部）。
然而，经进一步培养在96V板的EBS往往坚持井的底部。因此，在EB形成后的第二天，需要转移的EBS超低附件的96U板（ 图1A）。然后，在这种格式使用PD0325901（成纤维细胞生长因子/ ERK抑制剂），SB431542（TGFβ/SMAD2抑制剂）组成的一个小分子鸡尾酒诱导神经外胚层，和dorsomorphin（BMP/SMAD1抑制剂），如10。神经外胚层形成使用这种小分子鸡尾酒，胚体可以镀出给引起的神经元的任何格式，只要表面涂有基底膜（ 图2）。启动EB形成不同数量的细胞（ 图1C，下图），我们发现，胚体产生的约8000个细胞中往往会产生神经细胞的分化能力最好的。这是其特征在于，从镀胚体，减少坏死EB中心电镀后，感觉和泛神经的标记如BRN3A和III的β-微管蛋白（ 图2和图3A，B）的高表达的明显的神经元的副产物。整体神经细胞的分化效率相媲美的原程序（〜70％）（ 图3），这是适用于人类胚胎干细胞和人iPS细胞10。因此，我们采用两个独立的胚胎干细胞系，HuES6和三氯化氮，在多孔程序，而相关的变异细胞系中differentiatioŇ效率一般不能被排除在外。
HPSC源性神经元的一些应用需要，而不是镀胚体分化细胞单层。因此，我们还调查是否假定神经外胚层细胞球的协议在第4天（ 图2，中间）可以解离成单细胞使用Accutase;然后被镀作为单层。事实上，当镀敷，满分天-4神经外胚层细胞的单细胞，发音这些再接种细胞的神经元分化，获得约60％的效率（ 图3C）。
图1。 EB的形成过程。A）EB形成过程的示意图。前一天开始的differe ntiation的（d-1），人胚胎干细胞的悬浮液中含有几千个细胞每100μl接种到96V井，然后离心。胚体一朝一夕形成的，然后转移成超低附件96U井的进一步治疗。B）测试的影响，PVA和Y-27632 EB形成。 EB形成只能观察培养基中同时含有PVA和Y-27632（见箭头）。C）顶：胚体通过常规方法形成的大小通常是异构的。底胚体形成“自旋EB”技术，通过使用不同数量的输入单元格中描述A.，EB大小可以严格控制和高度统一的。 点击这里查看大图 。
35fig2highres.jpg“/>
图2。神经元形成的流程图。分化的（d-1）的开始的前一天，类胚体产生96V的板，使用所指示的EB形成介质。的EBS转移到96U板后，开始使用神经诱导分化培养基中。 4天以后，胚体被镀在基质胶涂层的孔中所需的多孔格式。代表形态示出的每一个步骤。右图显示了典型的镀胚体神经元的副产物 - 高细胞密度区域非常正确的是这些神经元往往生长在放射状的镀EB中心的一部分。另外，第4天，EBS可以分解成单个细胞和终末分化的单分子膜（文本和图3c的细节）。镀点击这里查看大图 。
图3。表征A）实时RT-PCR鉴定8天，批量培养的神经元的神经元。需要注意的是有区别的样品神经嵴和泛神经细胞标记基因控制细胞未分化较强烈上调。虽然开始有16,000细胞样本显示4000至8000之间的的最高神经元表达水平（注意对数的比例），EBS细胞证明是最有用的，根据形态学标准。B）大多数的镀胚体细胞生长的神经元染色阳性的β-微管蛋白（红色）和感觉神经元：标记BRN3A（绿色）。C）神经元形成单细胞后镀代替电镀胚体。的协议在第4天（ 图2），浮动胚体分离使用Accutase和接种单细胞的终末分化为单分子层。如左图所示，典型的神经元的形态，β-III微管蛋白的染色阳性的细胞被容易地获得，而细胞的存活似乎有些减少至EB电镀相比。右：免疫细胞化学为基础的量化神经元的收益率（N = 3个有代表性的部分分析+ / - SD）。 点击这里查看大图 。
| 基因名称 | 正向引物序列 | 牧师引物序列 |
| ACTB（家政基因） | TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG | ACATCTGCTGGAAGGTGGACA |
| RPL37A（家政基因） | GTGGTTCCTGCATGAAGACAGTG | TTCTGATGGCGGACTTTACCG |
| DCX | AGGGCTTTCTTGGGTCAGAGG | GCTGCGAATCTTCAGCACTCA |
| ISL1 | TTTATTGTCGGAAGACTTGCCACTT | TCAAAGACCACCGTACAACCTTTATCT |
| MAPT | TTACCCTGGGCACTGGCCTA | TCCTGCTCAACATGGCAAACTC |
| NEUROD1 | GACTGATTGCACCAGCCCTTC | CGGACGGTTCGTGTTTGAAAG |
| NEUROG1 | CAGAGACAAGGAGTGGGCTTCA | CTCCAGCCCTGTGCCTGAAT |
| SOX10 | TCCTTGCCAGCTCCCTCTTC | CAAGGGTTAGGGCCTGAGCA |
| SYT4 | GCCAATCTCACCACCCAAATG | CACACACCATGCTTCCTTCCA |
表2引物，用于RT-qPCR的。
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Discussion
大多数分化协议涉及EB形成从hPSCs，包括我们之前发表的过程10，是基于手动或作为骨料，这不可避免地导致异质性的EB大小的人类胚胎干细胞的酶辅助的收获。这一事实导致分化效率与某些细胞系中的可变性，从而使系统的分析困难的，特别是在一个中等的吞吐量规模。此外，人工清扫是劳动密集型的，这本身损害的可扩展性。
与此相反，这里描述的方法是根据对EB从单细胞的形成，这有利于细胞处理和样品之间的变化最小化。更重要的是，我们表明，启动协议与旋转EBS的整体分化成神经元的能力似乎并没有受到影响。此外，保持彼此分离通过使用96孔的悬挂板的各个胚体可防止吨下摆从汇总与另一个在悬浮液中， -其中介绍的常规方法10的又一缺点。其结果是，启动一个给定的实验所需要的输入hPSCs的量是低的，在一个约一以及的6孔板与盖玻片HPSC菌落是通常足以引发两个96孔板中的分化。最后，自旋电子束技术使EB尺寸的严格控制。根据我们的观察，神经元的标记物的表达水平倾向于增加在一定程度上与增加镀胚体（ 图3A）的大小。另一方面，过大的类胚体倾向于电镀后显示坏死中心。因此，作为一种妥协，我们发现，4000至8000细胞的EBS是一个合适的范围。
由于其高效率，简单，快速和成本效益，我们预期所描述的方法，是一个有用的平台，为功能性研究，疾病模型，需要人Sensory神经元，或中等吞吐量基于细胞的药理实验需要的任何类型的神经元。关于后者的应用程序，与自动分析如高含量成像的兼容性将是可取的。然而，这可能会受到损害的事实，即只不敷镀胚体的外周神经元可以分析。要绕过这个障碍，我们也试图通过分离胚体的协议的第4天，镀出单个细胞产生单分子层的神经元。事实上，在图3C中的数据表明，神经元形成在合理的效率约为60％。然而，我们观察到在这些条件下，在细胞存活减少，提示的协议，这种变化可进一步探讨和优化，例如，通过使用不同的附件基板。 （镀敷，满分天-4细胞在步骤5.2时没有添加Y-27632的电镀后，促进细胞的存活，但它也出现干涉瓦特因此，第i个随后的神经元分化，并应被删去。）此外，它也将是有趣的调查是否可以生成其他类型的神经元，此平台，通过改变介质的组合物中的协议的第二阶段。此外，关于从96V到96U形井，在第0天的类胚体的转移中，这将是可取的，制定的程序的基础上的多通道移液，最终实现所描述的方法的高通量的兼容性。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由马克斯·普朗克协会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
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