Summary
بروتوكولات لتمايز الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) وغالبا ما تكون وقتا طويلا وتتطلب مهارات كبيرة ثقافة الخلية. هنا، تكيفنا صغيرة الداخلي القائم على التمايز جزيء إلى تنسيق وحة multititre، مما يسمح للجيل بسيطة وسريعة، وفعالة من الخلايا العصبية الإنسان في الطريقة التي تسيطر عليها.
Abstract
البروتوكولات القائمة لتوليد الخلايا العصبية البشرية من الخلايا الجذعية المحفزة (hPSCs) وغالبا ما تكون مملة في أن تكون إجراءات متعددة الخطوات التي تنطوي على العزل والتوسع في الخلايا العصبية السلائف، قبل التمايز النهائي. بالمقارنة مع هذه النهج تستغرق وقتا طويلا، وجدنا مؤخرا أن تثبيط مجتمعة من ثلاثة مسارات الإشارات، TGFβ/SMAD2، BMP/SMAD1، وجمعية جيل المستقبل / ERK، ويعزز الحث السريع في الأديم الظاهر العصبي من hPSCs، تليها تمايز الخلايا العصبية فوري في وظيفية. هنا، تكيفنا إجراءاتنا إلى تنسيق رواية وحة multititre، لزيادة تعزيز وتكرار لجعلها متوافقة مع منتصف الإنتاجية التطبيقات. وهي تتألف من أربع أيام من تشكيل الأديم الظاهر العصبي في مجالات العائمة (الهيئات مضغي الشكل)، تليها أربعة أيام مزيد من التمايز في الخلايا العصبية في ظل ظروف ملتصقة. معظم الخلايا التي تم الحصول عليها مع هذا البروتوكول ويبدو أن الخلايا العصبية الحسية الثنائي القطب. وعلاوة على ذلك،هذا الإجراء هو ذات كفاءة عالية، لا تتطلب مهارات خاصة الخبراء، ويستند إلى وسيلة بسيطة محددة الصفات كيميائيا مع فعالة من حيث التكلفة جزيئات صغيرة. بسبب هذه الميزات، قد الإجراء بمثابة منصة مفيدة لتحقيق مزيد الفنية وكذلك لخلية القاعدة التي تتطلب فحص الخلايا العصبية الحسية يقترب الإنسان أو الخلايا العصبية من أي نوع.
Introduction
hPSCs، تضم الجنين المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (hiPSCs)، هي معنى المحفزة التي يمكن أن تؤدي إلى خلية مختلف الأنساب في المختبر 1-2. وقد استمدت العديد من أنواع الخلايا المتمايزة من hESCs حتى الآن، مما يدعم فكرة أن هذه الخلايا تقديم أدوات قيمة للبحث العلمي والنهج القائم على الفحص الخلية، وتبشر الخلايا المستندة إلى التداوي.
بروتوكولات تمايز الخلايا العصبية لوعادة ما تكون معقدة hESCs ومضيعة للوقت وتعتمد في كثير من الأحيان على مصير عموما لأول حمل العصبية، تليها عزلة دليل من الأسلاف العصبية، والتمايز النهائي لاحقة إلى نوع معين من الخلايا العصبية الفائدة 3-6. في بعض الصدد، هذا التعقيد ليس من المستغرب وحتمية بالنظر إلى أن مثل هذه الدولة من بين الفن بروتوكولات توجيه التمايز التدريجي تميل إلى تقليد التنمية البشرية في وقت مبكر، حركتيح هو في حد ذاته في غاية التعقيد. من ناحية أخرى، قد يكون في جزء تعكس أيضا افتقارنا إلى فهم العمليات الجزيئية الكامنة، مما أدى إلى تمايز البروتوكولات التي لا تزال بعيدة عن الأمثل تماما.
فيما يتعلق بتحويل hPSCs غير متمايزة في الأديم الظاهر العصبي، بيرا وآخرون. وجدت أن قمع BMP / SMAD1/5/8 الإشارات العصبية من تحريض يعزز hESCs 7. وعلاوة على ذلك، فقد تبين من تعطيل SMAD2 / 3 إشارات لتعزيز تشكيل الأديم الظاهر العصبي 8. وبناء عليه، تعطيل الجمع بين هذه المسارات من 2 يميل إلى أن يؤدي إلى تحريض العصبية أكثر كفاءة من hPSCs 4،9. وفي الآونة الأخيرة، وقد أظهرت لنا أن مسار الإشارات الثالث، FGF / ERK، بمثابة كاظمة قوية من أقرب الخطوات التزام عصبي في hESCs. وعلى العكس، القمع المتزامن لجميع المسارات الثلاثة هذه تؤدي إلى شبه متجانسة تحويل hESCs في الأديم الظاهر العصبي معفي الأيام الأربعة فقط 10. بعد ذلك، لوحظ كفاءة عالية التمايز إلى خلايا عصبية طرفية وظيفية في غضون ثمانية أيام. وكانت الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها من المرجح أن تكون الخلايا العصبية الحسية في الجهاز العصبي المحيطي، والتي قد تساهم جزئيا في تفسير اشتقاقها السريع 10. ويعتبر وجود عيوب في الصيانة الخلايا العصبية الحسية سببا للاضطرابات بشرية معينة مثل خلل الوظائف المستقلة العائلية 11. لنمذجة هذه الأمراض يعتمد على التكنولوجيا hiPSC 12، لتوصيف وظيفي أخرى، وكذلك لأغراض تطبيق لا تتطلب أي نوع معين من الخلايا العصبية، قد يكون هذا الإجراء التمايز تقديم أساسا مفيدا.
ومع ذلك، أدت استراتيجية التمايز استخدمناها في الأصل تشكيل الهيئات المعنية الجنينية (EBS) من كتل من المستعمرات hESC 10، وهذا في درجة لا بأس به من عدم التجانس فيما يتعلق بأحجام EB، وأيضا ظهرت لتقديم تنازلات الخلايا العصبية في بعض الكفاءة تشكيل مليرة لبنانية خطوط. وعلاوة على ذلك، ونظرا لعدم التجانس في أحجام EB، يبدو أن القدرة على اختبار منهجية آثار عوامل النمو إضافية أو جزيئات صغيرة أثناء وبعد تشكيل الخلايا العصبية ليكون مرتبك بعض الشيء.
في هذا التقرير، وتكييفها ونحن لدينا الإجراء السابق إلى وسيلة الإنتاجية المتوافقة مع تقنية التجميع على أساس أجبروا على توليد EBS بطريقة حجم تسيطر عليها إلى حد كبير، كما هو مبين أيضا في سياقات أخرى 13. وبعد ذلك، EBS ولدت في الخامس على شكل لوحات الآبار 96-جيدا ونقل إلى مرفق منخفضة للغاية على شكل U 96-وحات جيدة، لبدء تشكيل الأديم الظاهر العصبي في التعليق. بعد أربعة أيام، يمكن أن يصفح عن EBS من الخلايا العصبية مما يؤدي إلى التمييز في شفائهم عالية الكفاءة والتجانس. بدلا من ذلك، كانت يوم EBS-4 فصلها إلى خلايا واحد ومطلي من هذا النحو، مما أدى إلى انخفاض الكثافة monolayers من الخلايا العصبية البشرية. وبالتالي النتائج التي تم الحصول عليها حتى الآن متماسكة مع دي مستقل 2خطوط hESC rived، وHuES6 NCL3.
كشرط مسبق، كانت ناجحة تشكيل EB تعتمد بشكل صارم على استخدام البوليمر الاصطناعية، وبولي فينيل الكحول (PVA)، جنبا إلى جنب مع مثبط ROCK Y-27632 المعروفة لتعزيز بقاء hESC 13-14. وتعززت بشكل كبير نتيجة لذلك، تجانس EBS التي تشكلت في 96-V-لوحات مقارنة تشكيل EBS، لأن الحضارات الشامل على أساس تقنيات تقسيم عشوائي. هذا النظام يوفر بالتالي منصة تحسنت بشكل ملحوظ عن تشكيل الأديم الظاهر العصبي في الثقافة التعليق، تليها تشكيل الخلايا العصبية تسيطر عليها في ظل ظروف غاية ملتصقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد Matrigel المغلفة لوحات وسائل الإعلام
- وقد وجد إعداد لوحات Matrigel Matrigel المغلفة لتكون ركيزة المفضل لمرفق التفرقة EBS وتعزز أيضا ثمرة كفاءة الخلايا العصبية من هذه 10.
- تحسن 10 مل من Matrigel بين عشية وضحاها على الجليد.
- اليوم التالي، تمييع الهلام مثل Matrigel مع مجلدين من الجليد الباردة DMEM/F-12 وإعداد مأخوذة من 1 مل مل في أنابيب prechilled المخروطية ال 15 التي يمكن تخزينها في -20 درجة تجمد C.
- البت شكل لوحة للتمايز الخلايا العصبية. على سبيل المثال، كنقطة انطلاق، نوصي لإجراء الجولة الأولى من تمايز في شكل 12-أيضا. قبل باردة 4 12-وحات جيدة في C. ° 4 حل 1 قسامة من Matrigel المجمدة عن طريق إضافة 9 مل من قبل المبردة DMEM/F-12 تليها pipetting صعودا وهبوطا حتى كل Matrigel prediluted وإذابة والمنحل.
- ثمونقل المحتويات إلى أنبوب جديد 50 مل تحتوي على 15 مل من DMEM/F-12 على الجليد (النهائي Matrigel التخفيف: 1:75). ثم، إضافة 0.5 مل من المخفف Matrigel إلى كل بئر من لوحات 12-جيدا قبل المبردة. لوحات التفاف مع Parafilm واسمحوا الوقوف بين عشية وضحاها في RT.
- اليوم التالي، نقل إلى لوحات C. ° 4 ويمكن تخزين لوحات مغلفة لعدة أسابيع قبل الاستخدام.
- وسائل الإعلام
EB المتوسطة تشكيل (~ 15 مل اللازمة لأداء التمايز في لوحة واحدة 96-جيدا - انظر الجدول (1) ومخطط في الشكل 2):
DMEM/F-12 مع 0.4٪ (PVA)
1X N2
1X B27
0.05٪ BSA
20 نانوغرام / مل FGF2
10 ميكرومتر Y-27632
1X PenStrepGln
متوسطة التمايز (~ 30 مل اللازمة لأداء التمايز في لوحة واحدة 96-حسنا، تليها تشكيل الخلايا العصبية في لوحة واحدة 12-Matrigel المغلفة جيدا، انظر الجدول 1):
DMEM/F-12
1X N2
0.05٪ BSA
0.5 ميكرومتر PD0325901
SB431542 ميكرومتر 15
0.5 ميكرومتر Dorsomorphin
1X PenStrepGln
2. اضطر EB تشكيل
- تنمو في ظل ظروف hPSCs الخاص المغذية خالية المفضل. نستخدم MEF مكيفة المتوسطة على لوحات 6 Matrigel المغلفة جيدا 15. ومع ذلك، ينبغي لنظم أخرى مثل الثقافة أو تجارية محلية الصنع وسائل الإعلام تعريف العمل أيضا. في وقت بدء تجربة التمايز، يجب أن يكون hPSCs شبه متموجة وبنشاط متزايد.
- إزالة المستعمرات ميكانيكيا بشكل عفوي متباينة باستخدام ماصة معقمة تلميح البلاستيك تحت المجهر ستيريو.
- غسل المستعمرات غير متمايزة المتبقية باستخدام PBS، وهضم للخلايا التي تحتوي على واحد باستخدام Accutase 1X Y-27632. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي واحد في 200 x ج لمدة 2 دقيقة، resuspend في وحدة تخزين صغيرة من تشكيل EB المتوسطة وتحديد عيار الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
- إضافة إلى قسامة من الخلاياتشكيل EB المتبقية المتوسطة أن يؤدي إلى ما بين 40،000 عيار و 80،000 خلية لكل مل.
- باستخدام ماصة الأقنية، نقل 100 ميكرولتر لكل بئر لوحة 96V القاع، مما أدى إلى 8،000 في 4،000 خلايا لكل بئر. تدور بشكل جيد 96-وحة لوحة أجهزة الطرد المركزي في أرجوحة المغادرة في 400 x ج لمدة 1 دقيقة لجمع الخلايا في أسفل الآبار، ونقل إلى الخلية الحاضنة الثقافة. سوف تشكل EBS بين عشية وضحاها، كما هو مبين في الشكل 1.
3. الأديم الظاهر العصبي الحث
- اليوم التالي (يوم 0)، وجمع من EBS وحة 96V تحت المجهر ستيريو، ونقل في وحدة تخزين صغيرة في طبق البكتيرية التي تحتوي على 3.5 سم 2 مل من المتوسط التمايز. تستنهض الهمم بلطف طبق لعدة ثوان لغسل EBS.
- إضافة 100 ميكرولتر من تمايز المتوسطة لكل بئر من أسفل-U-البالغة الانخفاض المرفقات 96-وحة جيدا. تحت stereomicroscope، EBS نقل كميات صغيرة في طبق الغسيل من 96U في الآبار (واحد لكل EB نحنليرة لبنانية). لوحة 96U مكان في الخلية الحاضنة الثقافة لمدة 4 أيام للسماح بتشكيل الأديم الظاهر العصبي.
4. الخلايا العصبية تشكيل
- في يوم 4، إعداد طبق الغسيل كما في الخطوة 3.1 و استبدال بالإضافة إلى ذلك DMEM/F-12 في لوحة قبل تحسنت 12-Matrigel المغلفة جيدا بواسطة متوسطة التمايز (1 مل لكل بئر).
- الطلاء من EBS
- جمع EBS من لوحة 96U، وغسل هذه البذور على النحو الوارد أعلاه، وبعناية واحدا تلو الآخر في بئر من لوحة 12-Matrigel المغلفة جيدا (حوالي 8 EBS لكل بئر): يجب EBS موزعة بالتساوي داخل الآبار للسماح ثمرة من دون عائق الخلايا العصبية خلال الأيام القليلة المقبلة (انظر "اليوم 5" الصورة في الشكل 2).
- قبل نقل الجزء الخلفي لوحة 12-جيدا في الحاضنة، والسماح لEBS إرفاق فضفاضة لحوالي 10 دقيقة في RT. ثم، بعناية نقل 12-وحة جيدا إلى الخلية الحاضنة الثقافة. سوف تنمو الخلايا العصبية الخروج من EBS مطلي بطريقة شعاعي داخل 4 أيام القادمة، كما SHOWN في الشكل 2 ("يوم 8" الصورة على اليمين).
5. الخلايا العصبية وتشكيل Monolayers
- كبديل للخطوات النقطة 4)، في يوم 4 من هذا الإجراء، جمع EBS في طبق البكتيرية التي تحتوي على 3.5 سم 2 مل من المتوسط التمايز، ثم نقل EBS في حجم صغير لطبق PBS المحتوية على، ومن ثم إلى طبق آخر يحتوي على Accutase.
- السماح لخلايا الهضم واحدة، الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 2 دقيقة، resuspend في وحدة تخزين صغيرة من متوسطة التمايز وتحديد عيار الخلايا باستخدام عدادة الكريات. ضبط عيار إلى الخلايا 6 1-2X10 لكل مل باستخدام المتوسطة التمايز (بدون Y-27632).
- لوحة الخلايا في مرحلة ما قبل حرارة 12-وحة Matrigel المغلفة جيدا (1 مل لكل بئر)، ونقل إلى الخلية الحاضنة الثقافة. ولوحظ تشكيل الخلايا العصبية كما monolayers بين 7 أيام إلى 8 (الشكل 3C). وتجدر الإشارة، مع ذلك، أن هذا البديل أحادي الطبقة منلم يتم إجراء الأمثل تماما فيما يتعلق بقاء الخلية والركيزة أكثر ملائمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في تقريرنا السابق، وذلك تمشيا مع العديد من الآخرين، يمكن أن تتولد من EBS hPSCs ببساطة عن طريق replating المجاميع على تقسيم الروتيني للhPSCs في المرفقات أطباق منخفضة 10. هذه النتائج عادة في توزيع واسعة من الأحجام EB الناتجة (الشكل 1C، أعلى). مشكلة أخرى تنتج عن ذلك هو أن تحتفظ في التعليق EBS تميل إلى تجميع مع بعضها البعض، مما يؤدي إلى عدم تجانس أكبر من الأحجام EB. للتحايل على هذه المشاكل، لذلك حاولنا لتوليد EBS من الطلاء hPSCs واحد في المرفقات الآبار منخفضة لوحات multititre (الشكل 1A). أدى ذلك إلى تشكيل أي EB وموت الخلايا (1B الشكل، أسفل اليمين). تطبيق جزيء بقاء المعروف hPSCs، أعطى Y-27632، نتائج مماثلة. وبالمثل، تميل تطبيق الكحول البولي فينيل (PVA) الذي سبق أظهرت لتعزيز تشكيل EB hESCs من 16، إلى "جمع" في hPSCs في الجزء السفلي من 96Vلم الآبار ولكن لا تؤدي إلى تشكيل EB. ومع ذلك، إذا الجمع بين Y-27632 مع مكملات PVA، كنا قادرين على توليد بسهولة من EBS وحيدة الخلية تعليق من hESCs، في ظل ظروف محددة الصفات كيميائيا (1B الشكل). مريح، يمكن أن أحجام EB في هذا الشكل لوحة multititre لرقابة مشددة من قبل البذر أعداد مختلفة من الخلايا لكل بئر، وعلى النقيض من استخدام التقنيات التقليدية (الشكل 1C، أسفل).
على حضانة أخرى في لوحات 96V، ومع ذلك، تميل إلى التمسك EBS الجزء السفلي من الآبار. لذلك، في اليوم بعد تشكيل EB، كان مطلوب منها نقل EBS لوحات المرفقات البالغة الانخفاض 96U (الشكل 1A). ثم هو فعل الأديم الظاهر العصبي في هذا الشكل باستخدام جزيء صغير كوكتيل تتألف من PD0325901 (FGF / ERK المانع)، SB431542 (TGFβ/SMAD2 المانع)، وdorsomorphin (BMP/SMAD1 المانع)، كما هو موضح 10. بعد تشكيل الأديم الظاهر العصبياستخدام هذا الكوكتيل جزيء صغير، يمكن مطلي على EBS من أن تثير الخلايا العصبية على أي شكل، شريطة أن تكون السطوح المغلفة مع Matrigel، (الشكل 2). من خلال البدء بتشكيل EB مع أعداد مختلفة من الخلايا (الشكل 1C، أسفل)، وجدنا أن EBS المتولدة من الخلايا حوالي 8000 من شأنه ان يؤدي أفضل قدرة الخلايا العصبية تمايز. ويتميز هذا الامتداد من الخلايا العصبية وضوحا من EBS مطلي، وانخفاض المراكز EB نخرية بعد الطلاء، والتعبير عالية من علامات حسية والقومية العصبية، مثل BRN3A وβ-III تويولين (أرقام 2 و 3A، B). مجمل الكفاءات تمايز الخلايا العصبية يبدو أن تكون قابلة للمقارنة إلى الإجراء الأصلي (~ 70٪) (الشكل 3)، والتي كانت سارية المفعول لكلا hESCs وhiPSCs 10. لدينا حتى الآن يعملون خطين hESC مستقلة، وHuES6 NCL3، في إجراء multiwell، في حين تقلب خط تعتمد على التمايز في الخلاياعموما يمكن ن الكفاءة لا يمكن استبعاده.
والعديد من التطبيقات من الخلايا العصبية المشتقة من hPSC تتطلب monolayers من الخلايا التمييزية، بدلا من EBS مطلي. ولذلك التحقيق أيضا عما إذا كانت الخلية المفترضة المجالات عصبي في يوم 4 من البروتوكول (الشكل 2، وسط) يمكن أن تنفصل إلى خلايا واحدة باستخدام Accutase؛ لثم يتم مطلي على النحو monolayers. في الواقع، بناء على الطلاء من الخلايا واحدة من الخلايا عصبي يوم-4، وضوحا تمايز الخلايا العصبية من هذه الخلايا يتم الحصول replated في الكفاءة ما يقرب من 60٪ (الشكل 3C).
الشكل 1. EB الإجراء التشكيل. تخطيطي) من إجراء تشكيل EB. قبل يوم واحد من بدء اح والمصنف ntiation (د-1)، تعليق hESCs تحتوي على عدة آلاف من الخلايا لكل 100 ميكرولتر في آبار 96V، تليها الطرد المركزي. شكلت EBS بين عشية وضحاها يتم نقل بعد ذلك إلى مرفق الآبار منخفضة للغاية 96U لمزيد من العلاج. B) اختبار آثار PVA وY-27632 على تشكيل EB. لا يمكن إلا أن EB تشكيل لوحظ في المتوسط تحتوي على كل PVA وY-27632 (انظر رأس السهم) C) أعلى: EBS شكلت بالوسائل التقليدية وعادة ما تكون غير متجانسة في الحجم. القاع: EBS شكلت مع تقنية "تدور EB" صورت في A. باستخدام أعداد مختلفة من الخلايا المدخلات، ويمكن التحكم بأحجام EB بإحكام وكانت موحدة إلى حد كبير. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
35fig2highres.jpg "/>
الشكل 2. الخلايا العصبية الرسم البياني التشكيل. قبل يوم من بدء التمايز (د-1)، يتم إنشاء EBS في لوحات باستخدام 96V تشكيل EB المشار المتوسط. عند نقله من لوحات EBS إلى 96U، يبدأ الاستقراء العصبية باستخدام التمايز المتوسطة. 4 أيام في وقت لاحق، ومطلي EBS في Matrigel الآبار المغلفة لشكل multiwell المطلوب. وتظهر الأشكال التضاريسية ممثل عن كل خطوة. الصورة على اليمين يظهر الامتداد العصبية نموذجية من EBS مطلي - كثافة عالية الخلية المنطقة على الحق جدا هو جزء من مركز EB مطلي من الخلايا العصبية التي تميل إلى النمو على نحو شعاعي. بدلا من ذلك، في يوم 4، EBS يمكن أن تنفصل إلى خلايا واحد ومطلي بها لالتمايز النهائي وmonolayers (النص والشكل 3C للحصول على التفاصيل). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 3. توصيف الخلايا العصبية. A) في الوقت الحقيقي RT-PCR توصيف اليوم 8 الثقافات العصبية بكميات كبيرة. لاحظ أنه في عينات متباينة قمة العصبية والجينات علامة عموم العصبية كانت upregulated بقوة بالمقارنة مع خلايا غير متمايزة السيطرة. على الرغم من عينات الخلايا بدأت مع 16000 أظهرت أعلى مستويات التعبير العصبية (لاحظ زيادة وغاريتمي)، EBS أثبتت بين 4،000 إلى 8،000 الخلايا الأكثر فائدة على أساس معايير شكلية. B) أكثر من الخلايا المتزايد من الخلايا العصبية هي EBS مطلي تلطيخ إيجابية للبيتا III تويولين (أحمر) الخلايا العصبية الحسية وعلامة BRN3A (الخضراء). C) الخلايا العصبية التي تشكلت بعد الطلاء خلية واحدة بدلا من الطلاء EBS. في يوم 4 من البروتوكول (الشكل 2)، كانت EBS العائمة فصلها باستخدام Accutase والمصنف على النحو الخلايا واحدة لثم التفريق عضال كما monolayers. وكما هو موضح على اليسار، الحصول بسهولة على الخلايا العصبية مع مورفولوجيا النموذجية التي ملطخة إيجابية بالنسبة لبيتا-III تويولين، في حين بقاء الخلية على ما يبدو إلى حد ما انخفض بالمقارنة مع الطلاء EB. الحق: كيمياء سيتولوجية مناعية على أساس العائد الكمي للالعصبية (ن = 3 أقسام ممثل تحليل + / - SD). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
| اسم الجين | FWD التمهيدي تسلسل | مراجعة تسلسل التمهيدي |
| ACTB (التدبير المنزلي الجينات) | TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG | ACATCTGCTGGAAGGTGGACA |
| RPL37A (التدبير المنزلي الجينات) | GTGGTTCCTGCATGAAGACAGTG | TTCTGATGGCGGACTTTACCG |
| DCX | AGGGCTTTCTTGGGTCAGAGG | GCTGCGAATCTTCAGCACTCA |
| ISL1 | TTTATTGTCGGAAGACTTGCCACTT | TCAAAGACCACCGTACAACCTTTATCT |
| MAPT | TTACCCTGGGCACTGGCCTA | TCCTGCTCAACATGGCAAACTC |
| NEUROD1 | GACTGATTGCACCAGCCCTTC | CGGACGGTTCGTGTTTGAAAG |
| NEUROG1 | CAGAGACAAGGAGTGGGCTTCA | CTCCAGCCCTGTGCCTGAAT |
| SOX10 | TCCTTGCCAGCTCCCTCTTC | CAAGGGTTAGGGCCTGAGCA |
| SYT4 | GCCAATCTCACCACCCAAATG | CACACACCATGCTTCCTTCCA |
الجدول 2. الاشعال تستخدم لRT-qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتستند معظم البروتوكولات التي تنطوي على تمييز تشكيل EB من hPSCs، بما في ذلك إجراء نشرت سابقا لدينا 10، على الخط أو بمساعدة إنزيم حصاد hESCs والمجاميع، الأمر الذي يؤدي حتما إلى عدم التجانس في أحجام EB. هذه الحقيقة يؤدي إلى التباين في كفاءة تمايز مع بعض خطوط الخلايا، مما يجعل من الصعب تحليل منهجي، لا سيما على نطاق والإنتاجية المتوسطة. وعلاوة على ذلك، الدليل هو تشريح كثيفة العمالة والتي في حد ذاته يضر تطويره.
في المقابل، تقوم الطريقة الموضحة هنا على تكوين الخلايا واحدة من EB، مما يسهل التعامل مع الخلايا ويقلل من التباين بين العينات. الأهم من ذلك، علينا أن نظهر أن القدرة الإجمالية التمايز إلى خلايا عصبية لا يبدو أن تتأثر الشروع في بروتوكول مع EBS زيادة ونقصان. وعلاوة على ذلك، والحفاظ على EBS الفردية فصلها عن بعضها البعض عن طريق استخدام لوحات التعليق 96-T يمنع جيداتنحنح من تجميع مع بعضها البعض في نظام التعليق - الذي يعرض آخر العيب من الإجراء التقليدية 10. ونتيجة لذلك، فإن كمية المدخلات hPSCs اللازمة لبدء تجربة معينة منخفضة في آن واحد تقريبا جيدا 6 جيدا مع لوحة المستعمرات hPSC subconfluent وعادة ما يكفي للبدء في المفاضلة لوحات 96-جيدا اثنين. وأخيرا، فإن تقنية EB تدور تمكن رقابة مشددة على أحجام EB. وفقا لملاحظاتنا، ومستويات التعبير عن علامات العصبية تميل إلى زيادة إلى حد ما مع أحجام متزايدة من EBS مطلي (الشكل 3A). من ناحية أخرى، EBS كبيرة جدا تميل إلى عرض مراكز نخرية بعد الطلاء. وبالتالي، كحل وسط، وجدنا EBS من 4،000 إلى 8،000 الخلايا لتكون مجموعة مناسبة.
نظرا لكفاءتها العالية، بساطة، السرعة، والفعالية من حيث التكلفة، فإننا نتوقع الطريقة الموضحة لتكون منبرا مفيدا للدراسات الفنية، التي تتطلب النمذجة للأمراض البشرية لياليensory الخلايا العصبية، أو متوسطة الإنتاجية المستندة إلى الخلايا المقايسات الدوائية تتطلب الخلايا العصبية من أي نوع. فيما يتعلق بتطبيق هذه الأخيرة، فإن التوافق مع التحليل الآلي مثل عالية المحتوى التصوير يكون من المرغوب فيه. هذا، ومع ذلك، قد يكون خطر بسبب حقيقة أنه يمكن تحليل الخلايا العصبية فقط تعدى في محيط EBS مطلي. للتحايل على هذه العقبة، ونحن أيضا حاول أن تولد monolayers الخلايا العصبية بسبب الانفصال EBS في يوم 4 من البروتوكول والطلاء خارج الخلايا واحدة. والواقع أن البيانات في الشكل 3C تشير إلى أن الخلايا العصبية في تشكيل كفاءة معقولة من حوالي 60٪. ومع ذلك، لاحظنا انخفاضا في بقاء الخلية في ظل هذه الظروف، مما يوحي بأن هذا الاختلاف قد يكون من البروتوكول مواصلة استكشاف والأمثل، على سبيل المثال باستخدام الركيزة المرفقات مختلفة. (لم إضافة Y-27632 على الطلاء على خلايا-4 اليوم في الخطوة 5.2 تعزيز بقاء الخلية بعد الطلاء ولكن يبدو أيضا أن يتدخل ثولذلك ينبغي التفريق إيث العصبية اللاحقة ويمكن حذفها.) وعلاوة على ذلك، سيكون من المثير للاهتمام أيضا للتحقيق في ما إذا كان يمكن أن تتولد أنواع أخرى من الخلايا العصبية مع هذا النظام الأساسي، من خلال تغيير التركيبة المتوسطة في المرحلة الثانية من البروتوكول. وعلاوة على ذلك، فيما يتعلق بنقل EBS من 96V إلى 96U على شكل آبار في اليوم 0، سيكون من المرغوب فيه وضع الداخلي على أساس pipetting متعددة، في نهاية المطاف لتحقيق الإنتاجية العالية من التوافق على طريقة وصفها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جمعية ماكس بلانك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
- Pera, M. F., et al. Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin. J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity. Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).
- Greber, B., et al. FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells. EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).
- Anderson, S. L., et al. Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene. Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
