Summary
Os protocolos para a diferenciação neuronal de células pluripotentes estaminais humanas (hPSCs) são muitas vezes demorado e requer habilidades substanciais cultura de células. Aqui, nós adaptamos um procedimento de diferenciação pequena molécula baseada em um formato de placa de multititre, permitindo a geração de simples, rápido e eficiente de neurônios humanos de uma maneira controlada.
Abstract
Os protocolos existentes para a produção de neurónios de células pluripotentes humanas estaminais (hPSCs) são muitas vezes entediantes em que se trate de processos com vários passos, envolvendo o isolamento e expansão de células precursoras neurais, antes da diferenciação terminal. Em comparação com estas abordagens demorados, que têm encontrado recentemente que a inibição combinada de três vias de sinalização, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 e FGF / ERK, promove a rápida indução de neuroectoderme de hPSCs, seguido de imediato de diferenciação em neurónios funcionais. Aqui, nós adaptamos o nosso procedimento para um formato de romance placa multititre, para aumentar ainda mais a sua reprodutibilidade e para torná-lo compatível com o meio-throughput de aplicativos. Ele compreende quatro dias de formação neuroectoderme em esferas flutuantes (corpos embrióides), seguido por mais quatro dias de diferenciação em neurónios em condições de aderência. A maioria das células obtidas com este protocolo parecem ser os neurônios sensoriais bipolares. Além disso,o processo é altamente eficiente, não requer conhecimentos especializados particulares, e baseia-se em um meio simples quimicamente definido, com boa relação custo-eficiência moléculas pequenas. Devido a estas características, o procedimento pode servir como uma plataforma útil para investigação funcional adicional, bem como para a célula baseada em triagem aproxima exigindo humanos neurónios sensoriais ou neurónios de qualquer tipo.
Introduction
hPSCs, compreendendo embrião derivado de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e as células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs), são pluripotentes sentido de que eles podem dar origem a linhagens de células diferentes in vitro 1-2. Vários tipos de células diferenciadas foram derivados de hESCs até à data, apoiar a noção de que essas células apresentam ferramentas valiosas para a pesquisa científica e as abordagens baseadas em células de triagem, e uma promessa para a célula-base terapêutica.
Protocolos para a diferenciação neuronal hESCs são geralmente complexo e demorado uma vez que são muitas vezes baseados na primeira indução destino global neural, seguido por isolamento manual das células progenitoras neurais, e subsequente diferenciação terminal em um tipo de dado de interesse neurónio 3-6. Em alguns respeito, essa complexidade não é surpreendente e inevitável, dado que tal estado-da-arte protocolos de diferenciação direcionadas tendem a imitar gradual desenvolvimento humano precoce, which é em si extremamente complexo. Por outro lado, pode, em parte, também reflectem a falta de compreensão dos processos moleculares subjacentes, o que resulta em protocolos de diferenciação que ainda estão longe de ser totalmente otimizado.
No que se refere à conversão de hPSCs indiferenciadas em neuroectoderme, Pera et al. descobriu que a supressão de BMP / SMAD1/5/8 sinalização aumenta a indução neural de hESCs 7. Além disso, a inactivação de Smad2 / 3 de sinalização tem sido mostrado para promover a formação de neuroectoderme 8. Por conseguinte, a inactivação combinado destas duas vias tende a levar a mais eficiente de indução neural hPSCs 4,9. Mais recentemente, têm demonstrado que a via de sinalização do terceiro, FGF / ERK, serve como um repressor forte dos primeiros passos de compromisso neuroectodérmica em hESCs. Inversamente, a repressão simultânea de todos estes três vias levam a quase homogénea conversão de hESCs em neuroectoderme comem apenas quatro dias 10. Posteriormente, a diferenciação terminal altamente eficiente em neurônios funcionais foi observado no prazo de oito dias. Os neurônios obtidos eram susceptíveis de ser neurónios sensoriais do sistema nervoso periférico, o que pode, em parte, explicar a sua derivação rápida 10. Defeitos na manutenção neurônio sensorial é considerada uma causa de certas doenças humanas, tais como disautonomia familiar 11. Para a modelagem de tais doenças baseadas em tecnologia hiPSC 12, para a caracterização funcional adicional, bem como para fins de aplicação não exigem qualquer tipo específico de neurónios, este processo de diferenciação podem apresentar uma base útil.
No entanto, a estratégia de diferenciação que originalmente empregado envolvido formação de corpos embrionárias (EBS) de touceiras de colônias CTEh 10, e isso resultou em um bom grau de heterogeneidade em relação a tamanhos EB, e também apareceu para comprometer neurônio eficiência de formação em algumas celinhas ll. Por outro lado, devido à heterogeneidade nos tamanhos EB, a capacidade para testar sistematicamente os efeitos de factores de crescimento adicionais ou pequenas moléculas, durante e depois da formação de neurónios parecia ser um pouco confusa.
Neste relatório, nós adaptamos o nosso procedimento anterior para um meio de rendimento compatível, forçado técnica de agregação baseado gerar EBs de uma forma altamente tamanho controlado, como também mostrado em outros contextos 13. Subsequentemente, o EBs gerada em forma de V poços de placas de 96 poços foram transferidas para fixação em forma de U de ultra-baixo de 96 poços, para iniciar a formação de neuroectoderme em suspensão. Quatro dias mais tarde, o EBs pode ser plaqueada para fora dando origem a neurónios terminalmente diferenciadas em alto rendimento e homogeneidade. Alternativamente, 4 dias de EBs foram dissociadas em células isoladas e plaqueadas como tal, o que resultou em baixa densidade monocamadas de neurônios humanos. Os resultados foram coerentes até agora obtida com os dois independentemente deRIVED linhas CTEh, HuES6 e NCl3.
Como pré-requisito, a formação de EB sucesso era estritamente dependente da utilização de um polímero sintético, álcool polivinílico (PVA), em conjunto com o inibidor ROCHA Y-27632 conhecido para promover a sobrevivência hESC 13-14. Como resultado, a homogeneidade da EBs formado em 96-V-placas foi substancialmente melhorada em comparação com a formação de EBs como culturas em massa com base em técnicas de separação aleatórios. Este sistema proporciona assim uma plataforma significativamente melhorada para a formação de neuroectoderme em cultura em suspensão, seguindo-se a formação de neurónios em condições altamente controlado aderentes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação de Matrigel revestidos Pratos e Mídia
- Preparação de Matrigel revestido Matrigel placas foi encontrado para ser um substrato preferido para a ligação de diferenciação EBs e também promove o crescimento eficiente dos neurónios a partir destes 10.
- Ml degelo 10 de Matrigel durante a noite em gelo.
- No dia seguinte, diluir a Matrigel gelatinosa com dois volumes de gelado DMEM/F-12 e preparar alíquotas de 1 ml em 15 ml previamente arrefecido de tubos cónicos que podem ser armazenados congelados a -20 ° C.
- Decidir sobre um formato de placa para a diferenciação neuronal. Por exemplo, como ponto de partida, recomendamos realizar uma rodada inicial de diferenciação em um formato de 12 poços. Pré-cool quatro placas de 12 poços a 4 ° C. Dissolver uma alíquota de Matrigel congelada através da adição de 9 ml de pré-resfriada DMEM/F-12 seguido por pipetagem para cima e para baixo até que todo o pré-diluído Matrigel foi descongelado e dissolvido.
- Depois, Transferir o conteúdo para um tubo de 50 ml novo, contendo 15 ml de DMEM/F-12 em gelo (Matrigel diluição final: 1:75). Em seguida, adicionar 0,5 mL de Matrigel diluído a cada poço das pré-arrefecidos placas de 12 poços. Enrole placas com Parafilm e deixe descansar em temperatura ambiente durante a noite.
- No dia seguinte, placas de transferir a 4 ° C. Placas revestidas podem ser armazenadas durante várias semanas antes de usar.
- Mídia
EB meio de formação (~ 15 ml necessário para realizar a diferenciação de uma placa de 96 cavidades - ver Quadro 1 e esquema da Figura 2):
DMEM/F-12 com 0,4% (PVA)
1x N2
1x B27
0,05% de BSA
20 ng / ml FGF2
10 uM Y-27632
1x PenStrepGln
Meio de diferenciação (~ 30 ml necessário para realizar a diferenciação de uma placa de 96 poços, seguindo-se a formação de um neurónio Matrigel revestido placa de 12 poços, ver Quadro 1):
DMEM/F-12
1x N2
0,05% de BSA
0,5 uM PD0325901
15 SB431542 fiM
0,5 mM Dorsomorphin
1x PenStrepGln
2. Formação EB forçado
- HPSCs crescer sob seus preferidos alimentador sem condições. Usamos MEF meio condicionado em Matrigel revestidas placas de 6 poços 15. No entanto, sistemas de cultura, tais como caseiros ou comerciais de mídia definidos também deve funcionar. No momento de iniciar a experiência, diferenciação hPSCs deve ser sub-confluente e em crescimento activo.
- Remover mecanicamente espontaneamente colônias diferenciadas com uma ponta de pipeta estéril de plástico sob um microscópio estéreo.
- Lavar restantes colónias indiferenciadas utilizando PBS, e as células individuais de digest utilizando Accutase contendo 1X Y-27632. Células individuais pelotas por centrifugação a 200 xg durante 2 min, ressuspender em um pequeno volume de meio de formação de EB e determinar titre célula usando um hematocytometer.
- Adicionar uma parte alíquota de células parao meio de formação restantes EB para resultar em um título entre 40.000 e 80.000 células por ml.
- Utilizando uma pipeta de canais múltiplos, transferir 100 ul por poço de uma placa de fundo 96V, resultando em 4.000 a 8.000 células por poço. Placa de 96 poços de centrifugação numa centrífuga de placa swing-out a 400 xg durante 1 min para recolher as células no fundo dos poços, e transferir para a cultura de células de incubadora. EBs irá formar durante a noite, como mostrado na Figura 1.
3. Indução neuroectoderma
- No dia seguinte (dia 0), a partir de chapa de recolher EBs 96V sob um microscópio estéreo e transferência para um pequeno volume numa placa de 3,5 centímetros bacteriana contendo 2 ml de meio de diferenciação. Agite suavemente o prato por vários segundos para lavar a EBS.
- Adicionam-se 100 ul de meio por poço a diferenciação de um ultra-low-fixação fundo em U de 96 poços da placa. Sob estereomicroscópio, transferência EBs em pequenos volumes a partir da lavagem do prato para o 96U-poços (um EB por nósll). Colocar a placa de cultura de células em 96U incubadora durante 4 dias, para permitir a formação de neuroectoderme.
4. Formação neurônio
- No dia 4, preparar um prato de lavagem como descrito no passo 3.1 e, adicionalmente, substitua DMEM/F-12 num pré-aquecido Matrigel revestido placa de 12 poços por meio de diferenciação (1 ml por poço).
- Chapeamento de EBs
- Recolha de EBs placa 96U, lavar estas sementes como acima, e cuidadosamente uma por uma nos poços do Matrigel revestido placa de 12 poços (cerca de 8 EBs por poço): EBs deve ser igualmente distribuído dentro dos poços para permitir outgrowth imperturbada do neurônios ao longo dos próximos dias (ver "dia 5" imagem na Figura 2).
- Antes da transferência da parte de trás da placa de 12 poços na incubadora, permitir EBs para anexar livremente por cerca de 10 min à temperatura ambiente. Em seguida, transferir cuidadosamente placa de 12 poços para cultura de células de incubadora. Neurónios vai crescer para fora da EBs chapeado de um modo radial dentro dos 4 dias seguintes, tal como shown na Figura 2 ("dia 8" imagem à direita).
5. Neurônio Formação como monocamadas
- Como uma alternativa para os passos do ponto 4), no dia 4 do procedimento, recolher EBs em um prato de 3,5 centímetros bacteriana contendo 2 ml de meio de diferenciação, em seguida, transferir EBs em um pequeno volume para um prato de PBS contendo, em seguida, em outro prato contendo Accutase.
- Deixe digerir a células individuais, centrifugar a 200 xg durante 2 minutos, ressuspender em um pequeno volume de meio de diferenciação e determinar titre célula usando um hematocytometer. Ajustar a título de 1-2x10 6 células por ml em meio de cultura de diferenciação (sem Y-27632).
- Células da placa para fora na pré-aquecido Matrigel revestido placa de 12 poços (1 mL por cavidade), e transferência para a incubadora de cultura de células. Formação Neuron como monocamadas foram observadas entre os dias 7-8 (Figura 3C). Deve notar-se, contudo, que esta variante de monocamadao processo não está completamente optimizada no que se refere à sobrevivência das células e substrato mais adequado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Em nosso relatório anterior, em linha com muitos outros, a partir de EBs hPSCs poderiam ser gerados pela simples repique agregados, com a divisão de rotina de hPSCs em fixação de baixa pratos 10. Isso geralmente resulta em uma ampla distribuição de tamanhos EB resultantes (Figura 1C, superior). Outro problema resultante da presente é a de que EBs mantidas em suspensão tendem a agregar uma com a outra, conduzindo a uma ainda maior heterogeneidade de tamanhos de EB. Para contornar esses problemas, portanto, tentou gerar EBs através do plaqueamento hPSCs simples em anexo baixa poços de placas multititre (Figura 1A). Isto resultou na formação de não EB e da morte celular (Figura 1B, em baixo à direita). A aplicação de uma molécula conhecida por hPSCs sobrevivência, Y-27632, deu resultados semelhantes. Da mesma forma, o álcool polivinílico a aplicação (PVA), que tem sido mostrado previamente para aumentar a formação de EB hESCs 16, tende a "recolher" os hPSCs na parte inferior do 96V-Poços, mas não levou à formação de EB. No entanto, se a combinação Y-27632 com a suplementação de PVA, fomos capazes de gerar facilmente EBs partir de uma única célula suspensões de hESCs, sob condições definidas quimicamente (Figura 1B). Convenientemente, os tamanhos EB neste formato de placa multititre poderia ser rigorosamente controladas semeando diferentes números de células por poço, em contraste com a utilização de técnicas convencionais (Figura 1C, em baixo).
Após outra incubação nas placas de 96V, contudo, a tendência de EBs aderir ao fundo dos poços. Portanto, no dia após a formação da EB, que foi obrigada a transferir o EBs para placas ultra-baixas de fixação 96U (Figura 1A). Neuroectoderme é então induzida neste formato utilizando um cocktail de pequena molécula que consiste em PD0325901 (FGF / ERK inibidor), SB431542 (TGFβ/SMAD2 inibidor) e dorsomorphin (BMP/SMAD1 inibidor), tal como descrito 10. Após a formação da neuroectodermeusando este cocktail molécula pequena, a EBS pode ser plaqueada para dar origem a neurónios em qualquer formato, desde que as superfícies estão revestidas com Matrigel, (Figura 2). , Iniciando a formação de EB com números diferentes de células (Figura 1C, parte inferior), verificou-se que EBs gerado a partir de cerca de 8000 células tendem a produzir a melhor capacidade de diferenciação neuronal. Este é caracterizado por acentuadas excrescências neuronais do EBs chapeado, reduzido centros EB necróticas após o plaqueamento, e alta expressão de marcadores sensoriais e pan-neuronal, tais como BRN3A e β-tubulina III (Figuras 2 e 3A, B). As eficiências globais de diferenciação neuronais parece ser comparável ao processo original (~ 70%) (Figura 3), o qual foi aplicado tanto ao hESCs e hiPSCs 10. Temos, assim, muito empregadas duas linhas independentes, CTEh HuES6 NCl3 e, no processo de múltiplas cavidades, enquanto que a variabilidade de linha de células dependente de differentiatioeficiências n geralmente não podem ser descartadas.
Várias aplicações da HPSC derivados de neurónios que requerem monocamadas de células diferenciadas, em vez de EBs chapeado. Por isso, também investigamos se putativos esferas celulares neuroectodérmicas no dia 4 do protocolo (Figura 2, meio) pode ser dissociado em células individuais utilizando Accutase, para então ser plaqueadas em monocamadas. Com efeito, após plaqueamento de células individuais para fora de células-dia 4 neuroectodérmicos, pronunciada diferenciação neuronal das células obtém-se novamente plaqueadas a eficiência de aproximadamente 60% (Figura 3C).
Figura 1. EB procedimento de formação. Esquema A) do processo de formação de EB. Um dia antes do início do differe ntiation (d-1), uma suspensão de hESCs contendo vários milhares de células por 100 uL é semeadas em poços 96V, seguido de centrifugação. EBs formado durante a noite são então transferidas para poços de ultra-baixas de fixação 96U para tratamento posterior. B) Testar os efeitos do PVA e Y-27632 sobre a formação de EB. Formação EB só poderia ser observada em meio contendo os PVA e Y-27632 (ver ponta de seta) C) superior:. EBs formados por meios convencionais são geralmente de tamanho heterogéneo. Conclusão: EB formado com a técnica de "spin EB" descrito em A. Ao usar diferentes números de células de entrada, tamanhos EB pode ser rigidamente controlado e foram altamente uniforme. Clique aqui para ver maior figura .
35fig2highres.jpg "/>
Figura 2. Neuron fluxograma formação. Um dia antes do início da diferenciação (d-1), EBs são gerados em placas de 96V, utilizando o meio de formação indicada EB. Após a transferência do EBs 96U em placas, a indução neural é iniciada utilizando um meio de diferenciação. 4 dias mais tarde, as EBs são plaqueadas em poços revestidos com Matrigel de um formato de múltiplas cavidades desejada. Morfologias representativos são mostrados para cada passo. A imagem à direita mostra típicas conseqüências neuronais da EBS banhado - a área de alta densidade de células no próprio direito é parte do centro EB banhado a partir do qual os neurônios tendem a crescer de forma radial. Como alternativa, no dia 4, EBS pode ser dissociado em células individuais e semeadas para diferenciação terminal como monocamadas (texto e figura 3C para mais detalhes). Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. Caracterização dos neurónios. A) em tempo real de RT-PCR a caracterização do dia 8 a granel culturas neuronais. Note-se que nas amostras diferenciadas crista neural e genes marcadores pan-neuronais foram fortemente regulada positivamente em comparação com células de controlo não diferenciadas. Embora amostras iniciadas com 16.000 células apresentaram os maiores níveis de expressão neuronais (observe a escala logarítmica), EBS entre 4.000 a 8.000 células se mostrou mais útil baseada em critérios morfológicos. B) A maioria das células crescem fora da EB banhado são neurônios de coloração positiva para o beta- III tubulina (vermelho) eo neurônio sensorial marcador BRN3A (verde). C) Neurônios formada após o plaqueamento única célula em vez de chapeamento EBs. No dia 4 do protocolo (Figura 2), EBs flutuante foram dissociadas utilizando Accutase e semearam-se como células individuais para depois diferenciar terminalmente como monocamadas. Como mostrado no lado esquerdo, as células com morfologia neuronal típico que corados positivo para beta-tubulina III foram facilmente obtidos, enquanto que a sobrevivência das células parece ser um tanto reduzida em relação ao plaqueamento EB. Direita: Imunocitoquímica baseada em quantificação de rendimento neuronal (n = 3 secções representativas analisadas + / - SD). Clique aqui para ver maior figura .
| Nome do gene | Ata sequência iniciadora | Rev sequência iniciadora |
| ACTB (arrumação gene) | TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG | ACATCTGCTGGAAGGTGGACA |
| RPL37A (arrumação gene) | GTGGTTCCTGCATGAAGACAGTG | TTCTGATGGCGGACTTTACCG |
| DCX | AGGGCTTTCTTGGGTCAGAGG | GCTGCGAATCTTCAGCACTCA |
| ISL1 | TTTATTGTCGGAAGACTTGCCACTT | TCAAAGACCACCGTACAACCTTTATCT |
| MAPT | TTACCCTGGGCACTGGCCTA | TCCTGCTCAACATGGCAAACTC |
| NEUROD1 | GACTGATTGCACCAGCCCTTC | CGGACGGTTCGTGTTTGAAAG |
| NEUROG1 | CAGAGACAAGGAGTGGGCTTCA | CTCCAGCCCTGTGCCTGAAT |
| SOX10 | TCCTTGCCAGCTCCCTCTTC | CAAGGGTTAGGGCCTGAGCA |
| SYT4 | GCCAATCTCACCACCCAAATG | CACACACCATGCTTCCTTCCA |
Primers Tabela 2. Usado para RT-qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A maioria dos protocolos de diferenciação que envolvem a formação de EB hPSCs, incluindo o nosso procedimento publicado anteriormente 10, baseiam-se manual ou enzima-assisted colheita de hESCs como agregados, o que conduz inevitavelmente a heterogeneidade nos tamanhos de EB. Este fato leva à variabilidade na eficiência de diferenciação com algumas linhas de células, tornando análises sistemáticas difícil, em particular, em uma escala rendimento médio. Além disso, o esvaziamento manual é de trabalho intensivo que, por si só compromete escalabilidade.
Em contraste, o método aqui descrito baseia-se na formação de EB partir de células individuais, o que facilita a manipulação de células e minimiza a variação entre as amostras. Importante, vamos mostrar que a capacidade de diferenciação global em neurônios não parece ser afetada por iniciar o protocolo com spin EBs. Além disso, mantendo o EBs individuais separadas umas das outras por meio da utilização de placas de 96 poços de suspensão impede tbainha de agregação de um com o outro, em suspensão - que apresenta ainda uma outra desvantagem do processo convencional 10. Como resultado, a quantidade de hPSCs entrada necessários para iniciar uma dada experiência é baixa em que cerca de um poço de placa de 6 poços com colónias subconfluentes HPSC é geralmente suficiente para iniciar a diferenciação em duas placas de 96 poços. Finalmente, a técnica EB rotação permite o controlo apertado sobre os tamanhos EB. De acordo com as nossas observações, os níveis de expressão de marcadores neuronais tendem a aumentar, até certo ponto com tamanhos crescentes de EBs chapeado (Figura 3A). Por outro lado, as EBs demasiado grandes tendem a exibir centros necróticos após o plaqueamento. Assim, como um compromisso, encontramos EBs de 4.000 a 8.000 células para ser uma gama adequada.
Devido a sua alta eficiência, simplicidade, velocidade e custo-efetividade, nós antecipamos o método descrito para ser uma plataforma útil para estudos funcionais, modelagem de doença exigindo humano sensory neurónios, ou de meio de rendimento com base em células ensaios farmacológicos que requerem neurónios de qualquer tipo. No que diz respeito a esta última aplicação, a compatibilidade com a análise automatizada, tais como o conteúdo de imagem de alto seria desejável. Isto, contudo, pode ser comprometida pelo facto de apenas os neurónios outgrowing na periferia do EBs chapeado pudesse ser analisado. Para contornar esse obstáculo, nós também tentou gerar monocamadas de neurônios por dissociar EBs no dia 4 do protocolo e chapeamento células individuais. De facto, os dados da Figura 3C sugerem que os neurónios formada na eficiência razoável de cerca de 60%. No entanto, observou-se um decréscimo na sobrevivência de células sob estas condições, o que sugere que esta variação do protocolo pode ser ainda mais explorado e optimizado, por exemplo, utilizando um substrato de ligação diferente. (A adição de Y-27632 após plaqueamento para as células do dia-4 na etapa 5,2 fiz promover a sobrevivência de células após o plaqueamento, mas também parece interferir wdiferenciação neuronal subsequente i-ésimo e deve, portanto, ser omitida.) Além disso, também será interessante investigar se outros tipos de neurónios podem ser gerados com esta plataforma, através da variação da composição do meio, na segunda fase do protocolo. Além disso, no que diz respeito à transferência do EBs de 96V em 96U em forma de cavidades no dia 0, seria desejável elaborar um procedimento baseado na pipetagem multicanal, para finalmente alcançar a compatibilidade de alto rendimento do método descrito.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Sociedade Max Planck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
- Pera, M. F., et al. Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin. J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity. Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).
- Greber, B., et al. FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells. EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).
- Anderson, S. L., et al. Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene. Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
