Summary
Protocolos para la diferenciación neuronal de las células madre humanas pluripotentes (hPSCs) son a menudo mucho tiempo y requieren considerables conocimientos de cultivo de células. Aquí, hemos adaptado una molécula pequeña de un procedimiento basado en una diferenciación a un formato de placa de multititre, que permite la generación sencilla, rápida, y eficiente de las neuronas humanas de una manera controlada.
Abstract
Los protocolos existentes para la generación de neuronas a partir de células madre pluripotentes (hPSCs) suele ser tedioso, ya que son procedimientos de múltiples etapas que implica el aislamiento y la expansión de las células precursoras neurales, antes de la diferenciación terminal. En comparación con estos métodos consumen mucho tiempo, recientemente se ha encontrado que la inhibición combinada de tres vías de señalización, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, FGF y / ERK, promueve la rápida inducción de la neuroectodermo de hPSCs, seguido de inmediato diferenciación en neuronas funcionales. Aquí, hemos adaptado nuestro procedimiento para un formato de placa novela multititre, para mejorar aún más su reproducibilidad y para que sea compatible con mediados de rendimiento de las aplicaciones. Se compone de cuatro días de formación neuroectodermo en esferas flotantes (cuerpos embrioides), seguido por un período de cuatro días de diferenciación en neuronas en condiciones adherentes. La mayoría de las células obtenidas con este protocolo parecen ser las neuronas sensoriales bipolares. Por otra parte,el procedimiento es altamente eficaz, no requiere habilidades particulares de expertos, y se basa en un simple medio químicamente definido con rentables moléculas pequeñas. Debido a estas características, el procedimiento puede servir como una plataforma útil para la investigación funcional adicional, así como para el cribado basado en células humanas se aproxima requiere neuronas sensoriales o neuronas de cualquier tipo.
Introduction
hPSCs, que comprende embrión derivado de células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs), son pluripotentes sentido de que pueden dar lugar a diversos linajes celulares in vitro 1-2. Numerosos tipos de células diferenciadas se han derivado de hESCs hasta la fecha, apoyando la idea de que estas células presentan valiosas herramientas para la investigación científica y basados en células enfoques de cribado, y mantienen la promesa para células basadas en la terapéutica.
Protocolos de diferenciación neuronal para hESCs son generalmente complejas y requiere mucho tiempo, ya que a menudo se basan en la inducción de primera general destino neural, seguido de aislamiento manual de los progenitores neuronales, y la diferenciación terminal posterior en un tipo de neurona dada de interés 3-6. En algunos respecto, esta complejidad no es sorprendente e inevitable dado que tal estado-de-la-arte dirigido protocolos de diferenciación por etapas tienden a imitar el desarrollo temprano humano, which es en sí mismo muy complejo. Por otra parte, puede, en parte, también reflejan la falta de entendimiento de los procesos moleculares subyacentes, lo que resulta en protocolos de diferenciación que aún están lejos de ser totalmente optimizado.
Con respecto a la conversión de hPSCs indiferenciadas en neuroectodermo, Pera et al. encontraron que la supresión de BMP / SMAD1/5/8 señalización aumenta la inducción neural de hESCs 7. Además, la inactivación de Smad2 / 3 de señalización se ha demostrado para promover la formación neuroectodermo 8. Por consiguiente, la inactivación combinada de estas dos vías tiende a conducir a la inducción neural más eficiente de hPSCs 4,9. Más recientemente, se ha demostrado que una tercera vía de señalización, FGF / ERK, sirve como un represor fuerte de los primeros pasos de compromiso neuroectodérmico en hESCs. Por el contrario, la represión simultánea de estos tres caminos conducen a casi homogéneo conversión de hESCs en neuroectodermo conen tan sólo cuatro días 10. Posteriormente, la diferenciación terminal altamente eficiente en neuronas funcionales se observó dentro de ocho días. Las neuronas obtenidas fueron probablemente las neuronas sensoriales del sistema nervioso periférico, lo que puede explicar en parte su derivación rápida 10. Errores de mantenimiento neurona sensorial se considera una causa de ciertos trastornos humanos, tales como la disautonomía familiar 11. Para el modelado de dichas enfermedades basadas en la tecnología hiPSC 12, para la caracterización funcional adicional, así como para fines aplicados no requieren ningún tipo particular de neuronas, este procedimiento de diferenciación puede presentar una base útil.
Sin embargo, la estrategia de diferenciación de lo que originalmente se empleó la formación de los cuerpos involucrados embrionarias (EBS) de grupos de 10 colonias hESC, y esto dio lugar a un buen grado de heterogeneidad en cuanto a tamaños de EB, y también parecía poner en peligro la eficiencia de formación de neuronas en algunas celíneas ll. Además, debido a la heterogeneidad en los tamaños EB, la capacidad para probar sistemáticamente los efectos de factores de crecimiento adicionales o moléculas pequeñas durante y después de la formación de neuronas parecían ser algo confundido.
En este informe, hemos adaptado nuestro procedimiento anterior para un rendimiento medio-compatible, forzado agregación basado en la técnica para generar EBS en un tamaño muy controlado de manera que también se observan en otros contextos 13. Posteriormente, el EBS generada en forma de V pocillos de placas de 96 pocillos se transfirieron a en forma de U ultra-bajo fijación placas 96-pocillos, para iniciar la formación neuroectodermo en suspensión. Cuatro días más tarde, el EBS se podría sembraron dar lugar a neuronas terminalmente diferenciadas con alta eficiencia y homogeneidad. Alternativamente, día-4 EBS se disocia en células individuales y se colocaron como tal, lo que resultó en monocapas de baja densidad de neuronas humanas. Resultados fueron coherentes con los obtenidos hasta el momento dos de forma independientelíneas de células madre, Rived HuES6 y NCl3.
Como un requisito previo, la formación de EB éxito era estrictamente dependiente de la utilización de un polímero sintético, alcohol de polivinilo (PVA), junto con inhibidor de la ROCA Y-27632 conocido para promover la supervivencia hESC 13-14. Como resultado de ello, la homogeneidad de la EBS formado en el 96-V-placas se mejoró considerablemente en comparación a la formación de EBs como cultivos en masa basado en técnicas de splitting aleatorios. Así, este sistema proporciona una plataforma significativamente mejorada para la formación de neuroectodermo en cultivo en suspensión, seguido por la formación de neuronas altamente controlada en condiciones adherentes.
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Protocol
1. Preparación de Matrigel recubiertos con placas y los medios
- Preparación de Matrigel recubierto con Matrigel placas se ha encontrado que es un sustrato preferido para la unión de diferenciar EBs y también promueve la excrecencia eficiente de las neuronas de estos 10.
- Descongelar 10 ml de noche en hielo Matrigel.
- Al día siguiente, se diluye la Matrigel gelatinosa con dos volúmenes de hielo frío DMEM/F-12 y preparar partes alícuotas de 1 ml en tubos de 15 ml preenfriados cónicos que pueden almacenarse congeladas a -20 ° C.
- Decidir sobre un formato de placa para la diferenciación neuronal. Por ejemplo, como punto de partida, se recomienda llevar a cabo una ronda inicial de la diferenciación en un formato de 12-así. Pre-enfriar cuatro placas de 12 pocillos a 4 ° C. Disolver una alícuota de Matrigel congelado mediante la adición de 9 ml de pre-refrigerado DMEM/F-12 seguido por pipeteando arriba y abajo hasta que todo el Matrigel prediluido ha descongelado y se disolvió.
- Entonces, Transferir el contenido en un tubo de 50 ml nuevo que contiene 15 ml de DMEM/F-12 en hielo (dilución final Matrigel: 1:75). A continuación, añadir 0,5 ml de Matrigel diluido a cada pocillo de las pre-enfriados 12-pocillos. Envuelva las placas con Parafilm y se deja reposar durante la noche a temperatura ambiente.
- Al día siguiente, transferir las placas a 4 ° C. Las placas recubiertas se pueden almacenar durante varias semanas antes de su uso.
- Medios de comunicación
EB medio de formación (~ 15 ml necesario para realizar la diferenciación en una placa de 96 pocillos - ver Tabla 1 y el esquema en la figura 2):
DMEM/F-12 con 0,4% (PVA)
1x N2
1x B27
0,05% de BSA
20 ng / ml FGF2
10 mM Y-27632
1x PenStrepGln
Medio de diferenciación (~ 30 ml necesario para realizar la diferenciación en una placa de 96-pocillos, seguido por la formación de neuronas en una Matrigel recubierto de 12-pocillos, véase la Tabla 1):
DMEM/F-12
1x N2
0,05% de BSA
0,5 mM PD0325901
15 SB431542 mu M
0,5 mM Dorsomorphin
1x PenStrepGln
2. EB forzado Formación
- Crecer hPSCs bajo tus preferidos sin conexión en condiciones. Utilizamos MEF medio acondicionado en Matrigel revestidos 6-y las placas 15. Sin embargo, otros sistemas de cultivo, como medio definido caseros o comerciales también debería funcionar. En el momento de iniciar un experimento diferenciación, hPSCs debe ser sub-confluente y creciendo activamente.
- Mecánicamente eliminar espontáneamente colonias diferenciadas usando una punta de pipeta de plástico estéril bajo un microscopio estéreo.
- Lávese las restantes colonias indiferenciadas con PBS, y se resumen a células individuales utilizando Accutase contiene 1X Y-27632. Pellets individuales células por centrifugación a 200 xg durante 2 min, se resuspende en un pequeño volumen de medio de formación de EB y determinar título celular utilizando un hematocitómetro.
- Añadir una alícuota de células ael EB restante medio de formación para dar como resultado un título entre 40.000 y 80.000 células por ml.
- Usando una pipeta multicanal, transferir 100 l por pocillo a una placa de fondo 96V, resultando en 4.000 a 8.000 células por pocillo. Centrifugación placa de 96 pocillos en una centrífuga de plato oscilante a 400 xg durante 1 min para recoger las células en la parte inferior de los pocillos, y transferir a la incubadora de cultivo celular. EBS se forman durante la noche, como se muestra en la figura 1.
3. Neuroectodermo Inducción
- Al día siguiente (día 0), recoger EBs de 96V de la placa bajo un microscopio estéreo y transferencia en un pequeño volumen en una placa de 3,5 cm bacteriano que contiene 2 ml de medio de diferenciación. Agitar suavemente el plato durante unos segundos para lavar el EBS.
- Añadir 100 l de medio de diferenciación por pocillo de un ultra-bajo-apego fondo en U de 96 pocillos. Bajo un microscopio estereoscópico, la transferencia de EBS en pequeños volúmenes del lavado de platos en el 96U-pozos (uno por EB quell). Place 96U placa en cultivo celular incubadora durante 4 días para permitir la formación neuroectodermo.
4. Neurona Formación
- El día 4, preparar un plato de lavado como en el paso 3,1 y adicionalmente sustituir DMEM/F-12 en un pre-calentado Matrigel recubierto 12-así placa por medio de diferenciación (1 ml por pocillo).
- Revestimiento de EBs
- Recoger EBs de placa de 96U, lavar estas semillas como anteriormente, y con cuidado uno por uno en los pocillos de la Matrigel recubierto de 12-pocillos (aproximadamente 8 CE por pocillo): EBS se distribuirá uniformemente dentro de los pozos para permitir el crecimiento sin perturbaciones de neuronas en los próximos días (ver "día 5" imagen de la Figura 2).
- Antes de la transferencia de la placa de respaldo 12-bien en la incubadora, permitir EBS para acoplar con flojedad de alrededor de 10 min a TA. Luego, transferir cuidadosamente 12-así placa de cultivo celular incubadora. Las neuronas se crecen desde el chapado de EBs de forma radial dentro de los próximos 4 días, como shown en la Figura 2 ("Día 8" La imagen de la derecha).
5. Neurona Formación como monocapas
- Como alternativa a los pasos del punto 4), en el día 4 del procedimiento, recoger EBs de en una placa de 3,5 cm bacteriano que contiene 2 ml de medio de diferenciación, a continuación, transferir embrioides en un pequeño volumen a un plato que contiene PBS, y luego en otro plato que contiene Accutase.
- Deje digerir a células individuales, se centrifuga a 200 xg durante 2 min, se resuspende en un pequeño volumen de medio de diferenciación y determinar título celular utilizando un hematocitómetro. Ajuste título a 1-2x10 6 células por ml usando medio de diferenciación (sin S-27632).
- Células de la placa hacia fuera en pre-calentado Matrigel recubierto de 12-pocillos (1 ml por pocillo), y la transferencia a la incubadora de cultivo celular. Formación de las neuronas como monocapas se observó entre los días 7 a 8 (Figura 3C). Cabe señalar, sin embargo, que esta variante de monocapael procedimiento no está totalmente optimizado con respecto a la supervivencia de las células y el substrato más adecuado.
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Representative Results
En nuestro informe anterior, en línea con muchos otros, EBS desde hPSCs podría generarse simplemente replating agregados sobre la división de rutina de hPSCs en platos de baja fijación 10. Esto usualmente resulta en una amplia distribución de tamaños de EB resultantes (Figura 1 C, arriba). Otro problema que resulta de esto es que EBS mantienen en suspensión tienden a agregarse entre sí, dando lugar a una heterogeneidad aún mayor de tamaños de EB. Para evitar estos problemas, por lo tanto, intentó generar EBS en placas hPSCs individuales en pocillos de baja unión de placas multititre (Figura 1A). Esto dio lugar a ninguna formación de EB y la muerte celular (Figura 1B, parte inferior derecha). La aplicación de una molécula de supervivencia conocido por hPSCs, Y-27632, dio resultados similares. Del mismo modo, la aplicación de alcohol de polivinilo (PVA) que ha sido previamente demostrado para mejorar la formación de EB hESCs 16, tienden a "recoger" los hPSCs en la parte inferior de la 96VPozos, pero no condujo a la formación de EB. Sin embargo, si la combinación de Y-27632 con la suplementación de PVA, hemos sido capaces de generar fácilmente EBS desde una sola célula suspensiones de hESCs, bajo condiciones químicamente definidas (fig. 1B). Convenientemente, los tamaños de EB en este formato de placa de multititre podría ser estrechamente controlada por la siembra de diferente número de células por pocillo, en contraste con el uso de técnicas convencionales (Figura 1C, la parte inferior).
Tras la incubación adicional en las placas de 96V, sin embargo, la EB tiende a pegarse a la parte inferior de los pocillos. Por lo tanto, en el día después de la formación de EB, se requiere para transferir el EBS para placas de fijación ultra-bajas 96U (Figura 1A). Neuroectodermo continuación se induce en este formato utilizando un cóctel de molécula pequeña que consiste de PD0325901 (FGF / ERK inhibidor), SB431542 (TGFβ/SMAD2 inhibidor), y dorsomorphin (BMP/SMAD1 inhibidor), como se ha descrito 10. Después de la formación neuroectodermoutilizando este cóctel molécula pequeña, el EBS puede ser chapado a cabo para dar lugar a neuronas en cualquier formato, siempre que las superficies están recubiertas con Matrigel; (Figura 2). Con el inicio de la formación de EB con diferentes números de células (Figura 1C, la parte inferior), se encontró que EBS generada a partir de alrededor de 8000 células tienden a producir la mejor capacidad de diferenciación neuronal. Este se caracteriza por pronunciados excrecencias neuronales de la chapado EBS, reducido centros necróticos EB después de la siembra, y la alta expresión de marcadores sensoriales y pan-neuronal tales como Brn3a y β-tubulina III (Figuras 2 y 3A, B). Las eficiencias globales la diferenciación neuronal parecen ser comparables con el procedimiento original (~ 70%) (Figura 3), que es aplicable tanto a hESCs y hiPSCs 10. Hasta ahora hemos utilizado dos líneas de células madre independientes, HuES6 y NCl3, en el procedimiento de múltiples pocillos, mientras que la línea celular dependiente de la variabilidad en differentiatioeficiencias n generalmente no puede ser descartada.
Varias aplicaciones de HPSC neuronas derivadas requerirá monocapas de células diferenciadas en lugar de chapado EBs. Por lo tanto, también se investigó si putativo esferas celulares neuroectodérmico en el día 4 del protocolo (Figura 2, centro) podría ser disocia en células individuales utilizando Accutase; a continuación, se sembraron en forma de monocapas. En efecto, al enchapado células individuales de 4 días las células neuroectodérmicos, pronunciada diferenciación neuronal de estas células se volvieron a sembrar se obtiene con rendimientos de aproximadamente el 60% (Figura 3C).
Figura 1. EB procedimiento de formación. Esquema A) del procedimiento de formación de EB. Un día antes de la iniciación de difere ntiation (d-1), una suspensión de hESCs que contienen varios miles de células por 100 l se sembraron en pocillos 96V, seguido por centrifugación. EBS formado durante la noche se transfieren entonces a pocillos de fijación ultra-bajas 96U para el tratamiento adicional. B) Pruebas de los efectos de PVA e Y-27632 en la formación de EB. Formación de EB sólo se pudo observar en medio que contiene tanto PVA e Y-27632 (véase cabeza de flecha) C) Comienzo:. EBs de formar por medios convencionales suelen ser heterogéneos en tamaño. Abajo: EBS formado con "spin EB" técnica representada en A. Mediante el uso de diferentes números de celdas de entrada, el tamaño de EB se puede controlar bien y fueron muy uniforme. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
35fig2highres.jpg "/>
Figura 2. Formación de las neuronas diagrama de flujo. Un día antes de la iniciación de la diferenciación (d-1), EBS se generan en placas 96v utilizando el medio EB formación indicada. Tras la transferencia de la EBS en placas de 96U, la inducción neural se inicia utilizando un medio de diferenciación. 4 días más tarde, EBS se sembraron en pocillos recubiertos con Matrigel de un formato de múltiples pocillos deseado. Morfologías representativos se muestran para cada paso. La foto de la derecha muestra típicas excrecencias neuronales de chapado EBS - la zona de alta densidad de células en el extremo derecho es parte del centro de EB chapado de que las neuronas tienden a crecer de una manera radial. Por otra parte, el día 4, EBS puede disociarse en células individuales y se colocaron para la diferenciación terminal en forma de monocapas (el texto y la figura 3C para más detalles). Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 3. Caracterización de las neuronas. A) Real-time RT-PCR caracterización de día 8 cultivos neuronales a granel. Tenga en cuenta que en las muestras diferenciadas de la cresta neural y pan-neuronal genes marcadores fueron fuertemente upregulated en comparación con las células control no diferenciadas. Aunque las muestras iniciadas con 16.000 células mostraron los niveles más altos de expresión neuronales (véase la escala logarítmica), EBS entre 4.000 y 8.000 células resultó ser muy útil en base a criterios morfológicos. B) La mayoría de las células que crecen desde el chapado EB son las neuronas tinción positiva para el beta- tubulina III (rojo) y la neurona sensorial marcador Brn3a (verde). C) Las neuronas forman después de la siembra sola célula en lugar de placas EBS. En el día 4 del protocolo (Figura 2), Flotante EBS se disociaron usando Accutase y se sembraron a cabo como células individuales a continuación terminalmente diferenciar en forma de monocapas. Como se muestra en el lado izquierdo, las células con morfología neuronal típica que se tiñeron positivas para beta-tubulina III se obtuvieron fácilmente, mientras que la supervivencia celular parecía ser algo reducido en comparación a la chapa del EB. Derecha: La inmunocitoquímica basado en la cuantificación del rendimiento neuronal (n = 3 secciones representativas analizadas + / - SD). Haga clic aquí para ampliar la cifra .
| Nombre de gen | Fwd secuencia del cebador | Ap secuencia del cebador |
| ACTB (la limpieza de genes) | TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG | ACATCTGCTGGAAGGTGGACA |
| RPL37A (la limpieza de genes) | GTGGTTCCTGCATGAAGACAGTG | TTCTGATGGCGGACTTTACCG |
| DCX | AGGGCTTTCTTGGGTCAGAGG | GCTGCGAATCTTCAGCACTCA |
| ISL1 | TTTATTGTCGGAAGACTTGCCACTT | TCAAAGACCACCGTACAACCTTTATCT |
| MAPT | TTACCCTGGGCACTGGCCTA | TCCTGCTCAACATGGCAAACTC |
| NeuroD1 | GACTGATTGCACCAGCCCTTC | CGGACGGTTCGTGTTTGAAAG |
| NEUROG1 | CAGAGACAAGGAGTGGGCTTCA | CTCCAGCCCTGTGCCTGAAT |
| SOX10 | TCCTTGCCAGCTCCCTCTTC | CAAGGGTTAGGGCCTGAGCA |
| SYT4 | GCCAATCTCACCACCCAAATG | CACACACCATGCTTCCTTCCA |
Primers Tabla 2. Utilizados para la RT-qPCR.
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Discussion
La mayoría de los protocolos de diferenciación que implican la formación de EB hPSCs, incluyendo nuestro procedimiento previamente publicado 10, se basa en el manual o con ayuda de enzima de recolección hESCs como agregados, lo que inevitablemente conduce a la heterogeneidad en los tamaños de EB. Este hecho conduce a variabilidad en la eficacia con la diferenciación de algunas líneas celulares, haciendo así difícil análisis sistemáticos, en particular, a una escala de rendimiento medio. Además, la disección manual es un trabajo intensivo que de por sí compromete la escalabilidad.
En contraste, el método descrito aquí se basa en la formación de EB a partir de células individuales, lo que facilita la manipulación de células y reduce al mínimo la variabilidad entre las muestras. Es importante destacar que, se muestra que la capacidad de diferenciación en neuronas general no parece verse afectada por la iniciación del protocolo de giro con EBs. Además, para mantener el individuo EBS separados unos de otros por medio de la utilización de placas de 96 pocillos de suspensión evita tdobladillo de la agregación de uno con el otro en suspensión - que presenta otro inconveniente del procedimiento convencional 10. Como resultado, la cantidad de hPSCs de entrada requeridos para iniciar un experimento dado que es bajo en aproximadamente un pocillo de 6-así placa con subconfluentes colonias HPSC es generalmente suficiente para iniciar la diferenciación en dos placas de 96 pocillos. Finalmente, la técnica EB giro permite un estricto control sobre tamaños EB. Según nuestras observaciones, los niveles de expresión de marcadores neuronales tienden a aumentar en cierta medida con tamaños crecientes de chapado EBS (Figura 3A). Por otro lado, demasiado grande EBS tienden a mostrar centros necróticos después de la siembra. Por lo tanto, como una solución de compromiso, se encontró de EBs de 4.000 a 8.000 células a ser un intervalo adecuado.
Debido a su alta eficiencia, simplicidad, rapidez y rentabilidad, anticipamos el método descrito a ser una plataforma útil para los estudios funcionales, enfermedades que requieren de modelado humano sensory neuronas, o medio de transmisión de la celda a base de ensayos farmacológicos que requieren las neuronas de cualquier tipo. En cuanto a la última aplicación, la compatibilidad con el análisis automatizado tal como de alto contenido de imagen sería deseable. Esto, sin embargo, puede estar comprometida por el hecho de que sólo las neuronas outgrowing en la periferia de la chapado EBS podrían ser analizados. Para sortear este obstáculo, también trató de generar monocapas de neuronas disociando EBS en el día 4 del protocolo y enchapado células individuales. En efecto, los datos de la Figura 3C sugieren que las neuronas formado en una eficiencia razonable de aproximadamente 60%. Sin embargo, se observó una disminución en la supervivencia celular en estas condiciones, lo que sugiere que esta variación del protocolo puede ser explorado y optimizado, por ejemplo mediante el uso de un sustrato de fijación diferente. (La adición de Y-27632 en placas las células 4 días-en el paso 5,2 hizo promover la supervivencia celular después de la siembra pero también parecía interferir wi-ésimo posterior diferenciación neuronal y por lo tanto debe ser omitido.) Además, también será interesante investigar si otros tipos de neuronas podría ser generado con esta plataforma, mediante la variación de la composición del medio en la segunda etapa del protocolo. Por otra parte, en lo que respecta a la transferencia de la EBS desde 96V a 96U en forma de pocillos a día 0, sería deseable idear un procedimiento basado en pipeteo multicanal, para alcanzar en última instancia, de alto rendimiento de la compatibilidad del método descrito.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la Sociedad Max Planck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
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