Summary
Protocolli per la differenziazione neuronale di cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) sono spesso molto tempo e richiedono notevoli capacità di colture cellulari. Qui, abbiamo adattato una piccola molecola procedura basata differenziazione di un formato di piastra multititre, permettendo la generazione semplice, rapido, efficace e di neuroni umani in modo controllato.
Abstract
Protocolli esistenti per la generazione di neuroni da cellule staminali pluripotenti (hPSCs) sono spesso noioso in quanto sono procedure multistep coinvolgono l'isolamento e l'espansione di cellule precursori neurali, prima differenziazione terminale. In confronto a questi approcci in termini di tempo, abbiamo recentemente scoperto che l'inibizione combinata di tre vie di segnalazione, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 e FGF / ERK, promuove la rapida induzione neuroectoderma da hPSCs, seguita da immediata differenziazione in neuroni funzionali. Qui, abbiamo adattato la nostra procedura per un nuovo formato di piastra multititre, per migliorare ulteriormente la sua riproducibilità e di renderlo compatibile con metà del throughput delle applicazioni. Esso si articola in quattro giorni di formazione neuroectoderma in sfere galleggianti (corpi embrionali), seguito da altri quattro giorni di differenziamento in neuroni in condizioni aderenti. La maggior parte delle cellule ottenute con questo protocollo sembrano essere i neuroni sensoriali bipolari. Inoltre,la procedura è altamente efficiente, non richiede particolari competenze esperte, e si basa su un mezzo chimicamente definito semplice con piccole molecole costo-efficienti. A causa di queste caratteristiche, la procedura può servire come piattaforma utile per un'ulteriore indagine funzionale così come per la cella di screening avvicina richiedendo umani neuroni sensoriali o neuroni di qualsiasi tipo.
Introduction
hPSCs, composto da embrioni derivati da cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs), sono pluripotenti significato che possono dare origine a diverse linee cellulari in vitro 1-2. Numerosi tipi di cellule differenziate sono stati derivati da hESC ad oggi, sostenendo l'idea che queste cellule presentano strumenti utili per la ricerca scientifica e basati su celle approcci di screening, e promettenti per terapie a base di cellule.
Protocolli per la differenziazione neuronale hESC sono solitamente complesse e lunghe quanto sono spesso basati sulla prima sorte indurre complessiva neurale, seguito da isolamento manuale dei progenitori neurali, e la differenziazione terminale successiva in un determinato tipo di neurone di interesse 3-6. In alcuni riguardo, questa complessità non è sorprendente e inevitabile dato che un tale state-of-the-art protocolli di differenziazione diretti tendono a imitare graduale primi stadi dello sviluppo umano, which è di per sé estremamente complesso. D'altra parte, può in parte anche riflettere la nostra mancanza di comprensione dei processi molecolari sottostanti, con conseguente protocolli di differenziazione che sono ancora lungi dall'essere completamente ottimizzato.
Per quanto riguarda la conversione di hPSCs indifferenziate in neuroectoderma, Pera et al. trovato che la soppressione di BMP / SMAD1/5/8 segnalazione aumenta l'induzione neurale del hESC 7. Inoltre, l'inattivazione di SMAD2 / 3 segnalazione ha dimostrato di promuovere la formazione neuroectoderma 8. Di conseguenza, l'inattivazione combinata di queste due vie tende a generare una più efficace di induzione neurale del hPSCs 4,9. Più di recente, abbiamo dimostrato che un percorso di segnalazione terzo, FGF / ERK, funge da repressore forte delle prime fasi di impegno neuroectodermica in hESC. Al contrario, la repressione simultanea di tutti e tre questi percorsi portare a quasi omogenea conversione di hESC in neuroectoderma conin soli quattro giorni 10. Successivamente, la differenziazione terminale altamente efficiente in neuroni funzionali è stato osservato entro otto giorni. I neuroni ottenuti sono stati probabilmente i neuroni sensoriali del sistema nervoso periferico, che può in parte spiegare la loro derivazione rapida 10. Difetti nella manutenzione neurone sensoriale è considerata una causa di alcune patologie umane come disautonomia familiare 11. Per la modellazione di tali malattie basato su tecnologia hiPSC 12, per un'ulteriore caratterizzazione funzionale, nonché per scopi applicati non richiedono alcun tipo particolare di neuroni, questa procedura differenziazione può presentare una base utile.
Tuttavia, la strategia di differenziazione che avevamo originariamente impiegato coinvolto formazione di corpi embrionali (EB) da ciuffi di colonie hESC 10, e ciò ha determinato un bel grado di eterogeneità per quanto riguarda formati EB, e apparso anche di compromettere l'efficienza formazione dei neuroni in alcune ceLinee ll. Inoltre, a causa della eterogeneità in dimensioni EB, la possibilità di verificare sistematicamente effetti dei fattori di crescita addizionali o piccole molecole durante e dopo la formazione dei neuroni sembravano essere alquanto confuso.
In questo rapporto, abbiamo adattato la nostra procedura precedente per un rendimento medio-compatibile, l'aggregazione forzata a base di tecnica per generare EBs in una dimensione altamente controllato modo, come mostrato anche in altri contesti 13. Successivamente, l'EBS generato in forma di V pozzetti di piastre da 96 pozzetti sono state trasferite a forma di U bassissimo attaccamento piastre da 96 pozzetti, per avviare la formazione neuroectoderma in sospensione. Quattro giorni più tardi, l'EBS potrebbe essere piastrate dando origine a neuroni terminalmente differenziate ad alta efficienza e omogeneità. In alternativa, giorno-4 EBs erano dissociate in singole cellule e placcato in quanto tale, che ha portato a bassa densità monostrati di neuroni umani. Risultati coerenti sono stati finora ottenuti con due indipendentemente delinee di hESC rived, HuES6 e NCl3.
Come prerequisito, formazione EB successo era strettamente dipendente l'uso di un polimero sintetico, alcool polivinilico (PVA), insieme con inibitore ROCK Y-27.632 noto per promuovere la sopravvivenza hESC 13-14. Come risultato, l'omogeneità del EBs formata in 96-V-piastre è stata notevolmente migliorata rispetto a formazione di EBS come culture di massa basato su metodi di frazionamento casuali. Questo sistema fornisce quindi una piattaforma significativamente migliorato per la formazione neuroectoderma in coltura in sospensione, seguito dalla formazione neurone altamente controllato in condizioni aderenti.
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Protocol
1. Preparazione di Matrigel piastre rivestite e Media
- Preparazione di Matrigel piastre rivestite Matrigel è stato trovato per essere un substrato preferito per il fissaggio di differenziare EBs e promuove anche la conseguenza efficiente di questi neuroni di 10.
- Scongelare 10 ml di una notte sul ghiaccio Matrigel.
- Il giorno dopo, diluire il gelatinosa Matrigel con due volumi di ghiaccio-freddo DMEM/F-12 e preparare aliquote di 1 ml in prechilled provette da 15 ml coniche che possono essere conservati congelati a -20 ° C.
- Decidere su un formato di piastra per la differenziazione neuronale. Per esempio, come punto di partenza, si consiglia di effettuare un primo giro di differenziazione in un 12-pozzetti. Pre-raffreddare quattro piastre da 12 pozzetti a 4 ° C. Sciogliere un'aliquota di Matrigel congelate aggiungendo 9 ml di pre-raffreddate DMEM/F-12 seguiti pipettando su e giù fino a che tutto il prediluito Matrigel è stato scongelato e disciolto.
- Poi, Trasferire il contenuto in un nuovo tubo da 50 ml contenente 15 ml di DMEM/F-12 su ghiaccio (diluizione finale Matrigel: 1:75). Quindi, si aggiungono 0,5 ml di Matrigel diluito ad ogni pozzetto di pre-raffreddamento 12-pozzetti. Avvolgere le piastre con Parafilm e lasciare riposare a notte RT.
- Giorno successivo, trasferire piastre a 4 ° C. Piastre rivestite possono essere conservati per diverse settimane prima dell'uso.
- Media
EB medie formazione (~ 15 ml necessario effettuare differenziazione in una piastra a 96 pozzetti - vedi Tabella 1 e schema della figura 2):
DMEM/F-12 con il 0,4% (PVA)
1x N2
1x B27
0,05% BSA
20 ng / ml FGF2
10 pM Y-27.632
1x PenStrepGln
Differenziazione media (~ 30 ml necessario effettuare differenziazione in una piastra a 96 pozzetti, seguito dalla formazione neurone in uno Matrigel rivestita 12-pozzetti, vedi Tabella 1):
DMEM/F-12
1x N2
0,05% BSA
0,5 micron PD0325901
15 um SB431542
0,5 micron Dorsomorphin
1x PenStrepGln
2. EB Formazione forzata
- Grow hPSCs sotto i vostri preferiti alimentatore senza condizioni. Usiamo MEF condizionata medie su Matrigel rivestite piastre da 6 pozzetti 15. Tuttavia, i sistemi di coltura di altri come i media definiti fatti in casa o commerciale deve anche lavorare. Al momento di avviare un esperimento differenziazione, hPSCs dovrebbe essere sub-confluenti e attiva crescita.
- Rimuovere meccanicamente spontaneamente colonie differenziate con una punta di pipetta sterile di plastica sotto un microscopio stereo.
- Lavare le restanti colonie indifferenziate con PBS, e digerire di singole cellule utilizzando Accutase contenente 1X Y-27632. Pellet di cellule singole mediante centrifugazione a 200 xg per 2 minuti, risospendere in un piccolo volume di mezzo di formazione EB e determinare titolo cellulare mediante un hematocytometer.
- Aggiungi una aliquota di celluleil restante formazione medio EB comportare un titolo tra 40.000 e 80.000 cellule per ml.
- Usando una pipetta multicanale, trasferire 100 microlitri per pozzetto di una piastra di fondo-96V, con conseguente 4000 a 8000 cellule per pozzetto. Spin piastra da 96 pozzetti in un incernierato centrifuga piastra a 400 xg per 1 minuto per raccogliere le cellule al fondo dei pozzetti, e trasferimento incubatore per colture cellulari. EBs formerà durante la notte, come mostrato in Figura 1.
3. Neuroectoderma induzione
- Giorno successivo (giorno 0), raccogliere EBs dalla piastra 96V sotto un microscopio stereo e trasferimento in un piccolo volume in un piatto 3,5 centimetri batterica contenente 2 ml di terreno di differenziamento. Agitare delicatamente il piatto per alcuni secondi per lavare il EBS.
- Aggiungere 100 pl di mezzo di differenziazione per pozzetto di un ultra-bassa attacco U-bottom piastra a 96 pozzetti. In uno stereomicroscopio, il trasferimento EBS in piccoli volumi dalla lavastoviglie in 96U-pozzetti (uno EB per noill). Inserire la piastra di 96U in incubatore per colture cellulare per 4 giorni per permettere la formazione neuroectoderma.
4. Neuron Formazione
- Il giorno 4, preparare un piatto di lavaggio come al punto 3.1 e inoltre sostituire DMEM/F-12 in un pre-riscaldato Matrigel rivestita 12-pozzetti da terreno di differenziamento (1 ml per pozzetto).
- Placcatura di EBS
- Raccogliere EBs dalla piastra 96U, lavare questi semi come sopra, e con cura uno per uno nei pozzetti del Matrigel rivestite 12-pozzetti (circa 8 EBs per pozzetto): EB deve essere equamente distribuita all'interno dei pozzetti per consentire di conseguenza indisturbato neuroni nel corso dei prossimi giorni (vedi immagine "ore 5" in Figura 2).
- Prima del trasferimento del 12 e piastra posteriore in incubatrice, EBs consentono di collegare liberamente per circa 10 minuti a temperatura ambiente. Poi, trasferire accuratamente 12 pozzetti alla cultura incubatore cellulare. Neuroni crescerà fuori dal placcato EBs in modo radiale entro 4 giorni, come shown in figura 2 (il "Giorno 8" immagine a destra).
5. Formazione Neuron come monostrati
- In alternativa alle fasi del punto 4), al giorno 4 della procedura, raccogliere EBs in un piatto 3,5 centimetri batterica contenente 2 ml di terreno di differenziamento, poi trasferire EBs in un piccolo volume di PBS contenente un piatto, e poi in un altro piatto contenente Accutase.
- Lasciate digerire a cellule singole, centrifugare a 200 xg per 2 minuti, risospendere in un piccolo volume di terreno di differenziamento e determinare titolo cellulare mediante un hematocytometer. Regolare il titolo a 1-2X10 6 cellule per ml con terreno di differenziamento (senza Y-27632).
- Cellule piastra out in pre-riscaldato Matrigel rivestite 12-pozzetti (1 ml per pozzetto), e trasferimento in coltura cellulare incubatore. Formazione neurone come monostrati è stata osservata tra i giorni 7-8 (Figura 3C). Va notato, tuttavia, che questa variante del monostratola procedura non è completamente ottimizzato per quanto riguarda la sopravvivenza delle cellule e substrato più adatto.
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Representative Results
Nella nostra precedente relazione, in linea con molti altri, EBs da hPSCs potrebbe essere generato semplicemente replating aggregati al momento scissione di routine di hPSCs in basso attaccamento piatti 10. Questo di solito si traduce in una distribuzione gamma di formati EB risultanti (Figura 1C, in alto). Un altro problema derivante da questo è che EBs mantenute in sospensione tendono ad aggregarsi tra loro, portando ad una eterogeneità ancora maggiore di dimensioni EB. Per aggirare questi problemi, abbiamo quindi cercato di generare EBs da placcatura hPSCs singoli in basso attaccamento pozzetti di piastre multititre (Figura 1A). Ciò ha comportato nessuna formazione di EB e la morte cellulare (Figura 1B, in basso a destra). Applicando una molecola nota per la sopravvivenza hPSCs, Y-27.632, ha dato risultati simili. Analogamente, alcool polivinilico applicazione (PVA) che precedentemente è stato indicato per aumentare la formazione di EB hESC 16, tendente a "raccogliere" i hPSCs al fondo del 96V-Pozzi, ma non ha portato alla formazione di EB. Tuttavia, se la combinazione Y-27632 con l'integrazione di PVA, siamo stati in grado di generare facilmente EBs da monocellulari sospensioni di hESC, in condizioni di costituzione chimica definita (Figura 1B). Convenientemente, dimensioni EB in questo formato piastra multititre potrebbe essere strettamente controllato mediante inseminazione di un diverso numero di cellule per pozzetto, in contrasto con tecniche convenzionali (Figura 1C, in basso).
Su ulteriore incubazione nelle piastre 96V, tuttavia, l'EBS tendevano ad attaccarsi al fondo dei pozzetti. Pertanto, il giorno dopo la formazione EB, si è tenuto a deferire il EBS per ultra-low piastre di fissaggio 96U (Figura 1A). Neuroectoderma è poi indotta in questo formato usando un cocktail piccola molecola composta PD0325901 (FGF / inibitore ERK), SB431542 (inibitore TGFβ/SMAD2), e dorsomorphin (BMP/SMAD1 inibitore), come descritto 10. Dopo la formazione del neuroectodermaUtilizzando questo cocktail piccola molecola, l'EBS può essere placcato per dare origine a neuroni in qualsiasi formato, a condizione che le superfici sono rivestite con Matrigel; (Figura 2). Avviando formazione EB con diverso numero di cellule (Figura 1C, in basso), abbiamo trovato che EBs generato da circa 8000 cellule tendono a produrre la migliore capacità di differenziazione neuronale. Questa è caratterizzata da marcate escrescenze neuronali dal placcato EBS, ridotta centri EB necrotiche dopo la placcatura, e alta espressione di marcatori sensoriali e pan-neuronale come BRN3A e β-III tubulina (figure 2 e 3A, B). Le efficienze complessive differenziazione neuronale sembra essere paragonabile alla procedura originale (~ 70%) (Figura 3), applicabile sia alle hESC e hiPSCs 10. Finora abbiamo impiegato due linee di hESC indipendenti, HuES6 e NCl3, nella procedura di cavità multiple, mentre la linea cellulare-dipendente variabilità differentiatioefficienza n genere non può essere esclusa.
Diverse applicazioni di HPSC derivati neuroni richiederà monostrati di cellule differenziate, invece di placcato EBS. Abbiamo pertanto esaminato se putativi sfere cellulari neuroectodermici al giorno 4 del protocollo (figura 2, al centro) potrebbe essere dissociato in singole cellule utilizzando Accutase, per poi essere placcato come monostrati. Infatti, sulla placcatura su singole cellule di giorni-4 cellule neuroectodermici, pronunciata differenziazione neuronale di queste cellule ripiastrate si ottiene un'efficienza del 60% circa (Figura 3C).
Figura 1. EB procedura di formazione. A) Schema del procedimento di formazione EB. Un giorno prima dell'inizio del differe ntiation (d-1), una sospensione di hESC contenenti diverse migliaia di cellule per 100 pl è seminate in pozzetti 96V, seguito da centrifugazione. EBs formata durante la notte vengono poi trasferiti in ultra-low pozzi attacco 96U per un ulteriore trattamento. B) Verifica gli effetti di PVA e Y-27632 sulla formazione EB. Formazione di EB non poteva che essere osservata in terreno contenente sia PVA e Y-27632 (vedi punta di freccia) C) In alto:. EBs formato da mezzi convenzionali sono di solito di dimensioni eterogenee. In basso: EBs formato con "spin EB" tecnica descritta in A. Utilizzando un diverso numero di celle di input, dimensioni EB può essere controllato ed erano altamente uniforme. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Figura 2. Diagramma di flusso formazione Neuron. Un giorno prima dell'inizio della differenziazione (d-1), EBS sono generati in piastre 96V utilizzando il mezzo di formazione indicato EB. Al trasferimento della EB in 96U piastre, l'induzione neurale avviene per mezzo terreno di differenziamento. 4 giorni dopo, EBS sono piastrate in Matrigel pozzetti rivestiti di un formato multiwell desiderato. Morfologie rappresentativi sono riportati per ogni passaggio. L'immagine a destra mostra tipiche escrescenze neuronali da placcato EBS - zona ad alta densità cellulare in fondo a destra è parte del centro EB placcato da cui i neuroni tendono a crescere in modo radiale. In alternativa, il giorno 4, EBS può essere dissociato in cellule singole e piastrate per la differenziazione terminale come monostrati (testo e figura 3C per i dettagli). Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Caratterizzazione dei neuroni. A) Real-time RT-PCR caratterizzazione di giorno 8 culture di massa neuronali. Si noti che in campioni differenziati cresta neurale e pan-neuronali geni marcatori erano fortemente upregulated rispetto alle cellule di controllo indifferenziate. Anche se i campioni avviate con 16.000 cellule mostravano i più alti livelli di espressione neuronali (notare la scala logaritmica), EBS tra 4.000 a 8.000 cellule rivelato molto utile in base a criteri morfologici. B) La maggior parte delle cellule in crescita fuori dal placcato EBS sono neuroni colorazione positiva per la beta- Tubulin III (rosso) e il neurone sensoriale marcatore BRN3A (verde). C) I neuroni formato dopo placcatura singola cella invece di placcatura EBS. Il giorno 4 del protocollo (Figura 2), Galleggiante EBs erano dissociate con Accutase e privati dei semi come singole cellule per poi differenziare terminalmente come monostrati. Come mostrato a sinistra, cellule con tipica morfologia neuronale che colorate positivamente per beta-tubulina III sono stati ottenuti facilmente, mentre la sopravvivenza cellulare sembrava essere piuttosto ridotta rispetto alla placcatura EB. A destra: immunocitochimica basata quantificazione del rendimento neuronale (n = 3 sezioni rappresentative analizzati + / - SD). Clicca qui per ingrandire la figura .
| Nome del gene | Fwd innesco sequenza | Rev innesco sequenza |
| ACTB (gene housekeeping) | TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG | ACATCTGCTGGAAGGTGGACA |
| RPL37A (gene housekeeping) | GTGGTTCCTGCATGAAGACAGTG | TTCTGATGGCGGACTTTACCG |
| DCX | AGGGCTTTCTTGGGTCAGAGG | GCTGCGAATCTTCAGCACTCA |
| ISL1 | TTTATTGTCGGAAGACTTGCCACTT | TCAAAGACCACCGTACAACCTTTATCT |
| MAPT | TTACCCTGGGCACTGGCCTA | TCCTGCTCAACATGGCAAACTC |
| NEUROD1 | GACTGATTGCACCAGCCCTTC | CGGACGGTTCGTGTTTGAAAG |
| NEUROG1 | CAGAGACAAGGAGTGGGCTTCA | CTCCAGCCCTGTGCCTGAAT |
| SOX10 | TCCTTGCCAGCTCCCTCTTC | CAAGGGTTAGGGCCTGAGCA |
| SYT4 | GCCAATCTCACCACCCAAATG | CACACACCATGCTTCCTTCCA |
Primer Tabella 2. Utilizzato per RT-qPCR.
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Discussion
Maggior parte dei protocolli di differenziazione che comportano la formazione di EB da hPSCs, compresa la nostra procedura precedentemente pubblicato con il 10, sono basati su manuale o enzima-assistita raccolta di hESC come aggregati, il che porta inevitabilmente a eterogeneità nei formati EB. Questo fatto porta a variabilità in efficienza differenziazione con alcune linee cellulari, rendendo così difficile analisi sistema, in particolare su scala velocità media. Inoltre, la dissezione manuale è alta intensità di lavoro, che di per sé compromette la scalabilità.
Al contrario, il metodo qui descritto è basato sulla formazione di EB da singole cellule, che facilita la manipolazione cellulare e minimizza la variabilità tra i campioni. È importante sottolineare che, si dimostra che la capacità complessiva differenziazione in neuroni non sembra risentire l'avvio del protocollo con spin EBS. Inoltre, mantenendo l'individuo EBs separati l'uno dall'altro mediante utilizzando piastre da 96 pozzetti sospensione impedisce torlo dall'aggregare uno con l'altro in sospensione - che presenta un altro inconveniente del procedimento convenzionale 10. Come risultato, la quantità di hPSCs ingresso necessari per avviare un dato esperimento è basso che circa un pozzetto di piastra da 6 pozzetti con colonie subconfluenti HPSC è generalmente sufficiente per avviare la differenziazione in due piastre da 96 pozzetti. Infine, la tecnica di spin EB permette uno stretto controllo sulle dimensioni EB. Secondo le nostre osservazioni, i livelli di espressione dei marcatori neuronali tendono ad aumentare in certa misura con dimensioni crescenti di placcato EBS (Figura 3A). D'altra parte, troppo grande EBs tendono a mostrare centri necrotiche dopo placcatura. Quindi, a titolo di compromesso, abbiamo trovato EBs di 4.000 a 8.000 cellule per essere in un intervallo adeguato.
Grazie alla sua elevata efficienza, semplicità, velocità e rapporto costo-efficacia, prevediamo il metodo descritto di essere una piattaforma utile per studi funzionali, malattia che richiede la modellazione umana sneuroni ensory o supporto di throughput saggi farmacologici basati sulle cellule richiedono neuroni di qualsiasi tipo. Riguardo quest'ultima applicazione, la compatibilità con l'analisi automatizzata come alto contenuto di imaging sarebbe auspicabile. Ciò, tuttavia, può essere compromessa dal fatto che solo i neuroni che diventano troppo grandi nella periferia del placcato EBs potrebbe essere analizzato. Per aggirare questo ostacolo, abbiamo anche cercato di monostrati di generare neuroni dissociandosi EBs al giorno 4 del protocollo e placcatura le cellule singole. Infatti, i dati della figura 3C suggeriscono che i neuroni formata ragionevole efficienza di circa il 60%. Tuttavia, abbiamo osservato una riduzione della sopravvivenza cellulare in queste condizioni, suggerendo che questa variazione del protocollo può essere ulteriormente esaminato ed ottimizzato, per esempio utilizzando un substrato diverso allegato. (L'aggiunta di Y-27632 su placcatura i day-4 celle nel punto 5.2 ha fatto promuovere la sopravvivenza delle cellule dopo la placcatura, ma è apparso anche interferire with differenziazione neuronale successiva e deve quindi essere omessa.) Inoltre, sarà anche interessante indagare se altri tipi di neuroni potrebbe essere generato con questa piattaforma, variando la composizione del mezzo nella seconda fase del protocollo. Inoltre, per quanto riguarda il trasferimento del EBs da 96V in 96U forma di pozzetti al giorno 0, sarebbe auspicabile definire una procedura basata su pipettaggio multicanale, per ottenere alla fine alta produttività compatibilità del metodo descritto.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla Max Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
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