Summary
Protokoller for neuronal differensiering av pluripotent menneskelige stamceller (hPSCs) er ofte tidkrevende og krever betydelige cellekultur ferdigheter. Her har vi tilpasset et lite molekyl-basert differensiering prosedyren til en multititre plate format, slik at enkel, rask, og effektiv produksjon av humane nevroner på en kontrollert måte.
Abstract
Eksisterende protokoller for generering av nerveceller fra humane pluripotent stamceller (hPSCs) er ofte langtekkelig i at de er flertrinnsoppgaver prosedyrer som involverer isolering og utvidelse av nevrale forløper celler, før til terminal differensiering. I forhold til disse tidkrevende tilnærminger, har vi nylig funnet at kombinerte hemming av tre signalveier, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 og FGF / ERK, fremmer rask induksjon av neuroectoderm fra hPSCs, etterfulgt av umiddelbar differensiering i funksjonelle nerveceller. Her har vi tilpasset vår prosedyre til en roman multititre plate format, for ytterligere å styrke sin reproduserbarhet og å gjøre den kompatibel med mid-gjennomstrømning. Det består av fire dager med neuroectoderm formasjon i flytende kuler (embryoid organer), etterfulgt av ytterligere fire dager med differensiering i nevroner i henhold tilhenger forhold. De fleste celler oppnådd med denne protokollen synes å være bipolare sensoriske nevroner. Videreprosedyren er svært effektiv, krever ikke spesielle spisskompetanse, og er basert på en enkel kjemisk definerte medium med kostnadseffektive små molekyler. På grunn av disse egenskaper kan prosedyren tjene som et nyttig plattform for videre funksjonelle undersøkelser samt for celle-basert screening nærmer krever menneskelige sensoriske nevroner eller nevroner av enhver type.
Introduction
hPSCs, bestående embryo-avledet humane embryonale stamceller (hESCs) og indusert pluripotent stamceller (hiPSCs), er pluripotent betyr at de kan gi opphav til ulike celle linjene i vitro 1-2. Mange differensierte celletyper er avledet fra hESCs til dags dato, støtter forestillingen om at disse cellene presentere verdifulle verktøy for vitenskapelig forskning og celle-baserte screening tilnærminger, og holder løftet for celle-basert terapi.
Neuronal differensiering protokoller for hESCs er vanligvis komplekse og tidkrevende som de er ofte basert på første inducing samlet nevrale skjebne, etterfulgt av manuell isolering av nevrale stamceller, og påfølgende terminal differensiering inn i en gitt neuron type interesse 3-6. I noen henseende er denne kompleksiteten ikke overraskende og uunngåelig gitt at en slik state-of-the-art rettet differensiering protokoller tendens til trinnvis etterligne tidlig menneskelig utvikling, hh er i seg selv svært kompleks. På den annen side kan det til dels også reflekterer vår manglende forståelse av de underliggende molekylære prosesser, noe som resulterer i differensiering protokoller som er fortsatt langt fra å bli fullt optimalisert.
Med hensyn til konvertering av udifferensierte hPSCs inn neuroectoderm, Pera et al. fant at undertrykkelse av BMP / SMAD1/5/8 signalering forbedrer nevrale induksjon av hESCs 7. Videre har inaktivering av SMAD2 / 3 signalering vist seg å fremme neuroectoderm formasjon 8. Følgelig har en tendens kombinert inaktivering av disse to veier å føre til mer effektiv nevral induksjon av hPSCs 4,9. Mer nylig har vi vist at en tredje signalveien, serverer FGF / ERK, som en sterk repressor av de tidligste trinn neuroectodermal engasjement i hESCs. Omvendt, samtidig undertrykkelse av alle disse tre veiene fører til nær-homogen konvertering av hESCs inn neuroectoderm medpå bare fire dager 10. Deretter ble svært effektiv terminal differensiering i funksjonelle nerveceller observert innen åtte dager. Nervecellene som ble målt var sannsynlig å være sensoriske nevroner av det perifere nervesystemet, som kan delvis forklare den raske derivasjon 10. Defekter i sensorisk neuron vedlikehold regnes en årsak til visse menneskelige lidelser som familiær dysautonomia 11. For modellering slike sykdommer basert på hiPSC teknikk 12, for ytterligere funksjonell karakterisering samt for anvendt formål ikke krever noen bestemt type av nevroner, kan denne differensiering prosedyren presentere et nyttig utgangspunkt.
Men resulterte differensieringsstrategi vi opprinnelig ansatt involvert dannelsen av embryonale organer (EBS) fra klumper av hESC kolonier 10, og dette i ganske grad av heterogenitet om EB størrelser, og også ut til å inngå kompromisser Nevron formasjon effektivitet i noen cell linjer. Videre, på grunn av heterogeniteten i EB størrelser, dukket evnen til systematisk teste effekten av ytterligere vekstfaktorer eller små molekyler under og etter nevron dannelsen å bli noe forvirret.
I denne rapporten, tilpasset vi vår forrige prosedyren til en middels gjennomstrømning-kompatibel, tvunget aggregering-teknikk for å generere EBS i en svært størrelse kontrollert måte, som også vist i andre sammenhenger 13. Deretter, EBS generert på V-formede brønner av 96-brønners plater ble overført til U-formet ultralav vedlegg 96-brønners plater, for å initiere neuroectoderm formasjonen i suspensjon. Fire dager senere kunne EBS bli belagt ut gi opphav til terminalt differensierte nevroner ved høy effektivitet og homogenitet. Alternativt, var dag-4 EBS dissosiert i enkeltceller og belagt ut som sådan, noe som resulterte i lav tetthet monolayers av menneskelige nerveceller. Sammenhengende resultater ble så langt oppnådd med to uavhengig derived hESC linjer, HuES6 og NCL3.
Som en forutsetning, var vellykket EB formasjon strengt avhengig av bruken av et syntetisk polymer, polyvinylalkohol (PVA), sammen med ROCK inhibitor Y-27632 kjent for å fremme overlevelse hESC 13-14. Som et resultat, homogenitet i EBS dannet i 96-V-platene ble vesentlig forbedret sammenlignet med dannelsen av EBS som masse kulturer basert på tilfeldige splitting teknikker. Dette systemet tilveiebringer således en betydelig forbedret plattform for neuroectoderm formasjonen i suspensjonskultur, etterfulgt av svært kontrollerte neuron formasjon under adherente betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Matrigel-belagte plater og media
- Fremstilling av Matrigel-belagte plater Matrigel har blitt funnet å være en foretrukket substrat for festing av differensierende EBS og også fremmer effektiv utvekst av nerveceller fra disse 10.
- Tine 10 ml Matrigel natten på is.
- Neste dag fortynnes geleaktig Matrigel med to volumdeler iskald DMEM/F-12 og forberede aliquoter av 1 ml i prechilled 15 ml koniske rør som kan lagres frosset ved -20 ° C.
- Avgjøre hvilken plate format for neuronal differensiering. For eksempel, som et utgangspunkt, anbefales det å utføre en innledende runde differensiering i en 12-brønn format. Pre-cool fire 12-brønners plater ved 4 ° C. Oppløse en aliquot av frossen Matrigel ved tilsetning 9 ml av pre-kjølt DMEM/F-12 etterfulgt av pipettering opp og ned inntil alt forhåndsfortynnet Matrigel har tint og oppløst.
- Deretter, Overføre innholdet til en ny 50 ml tube inneholder 15 ml DMEM/F-12 på is (endelig Matrigel fortynning: 1:75). Deretter tilsett 0,5 ml fortynnet Matrigel til hver brønn av den pre-avkjølte 12-brønners plater. Pakk plater med Parafilm og la stå ved romtemperatur over natten.
- Neste dag, overføre platene til 4 ° C. Belagte plater kan lagres i flere uker før bruk.
- Media
EB formasjon medium (~ 15 ml for å utføre differensiering i en 96-brønns plate - se tabell 1 og ordningen i figur 2):
DMEM/F-12 med 0,4% (PVA)
1x N2
1x B27
0,05% BSA
20 ng / ml FGF2
10 uM Y-27632
1x PenStrepGln
Differensiering medium (~ 30 ml for å utføre differensiering i en 96-brønn plate, etterfulgt av nevron formasjonen i en Matrigel-belagt 12-brønn plate, se Tabell 1):
DMEM/F-12
1x N2
0,05% BSA
0,5 mikrometer PD0325901
15 uM SB431542
0,5 pM Dorsomorphin
1x PenStrepGln
2. Tvunget EB Formation
- Grow hPSCs under din foretrukne mater-free forhold. Vi bruker MEF-conditioned medium på Matrigel-belagte 6-brønners plater 15. Imidlertid bør andre kulturer som hjemmelaget eller kommersiell definerte medier også fungere. På tidspunktet for å starte en differensiering eksperiment, bør hPSCs være sub-confluent og aktivt voksende.
- Mekanisk fjerne spontant differensiert kolonier ved hjelp av en steril plast pipettespiss under et stereo mikroskop.
- Vask gjenværende udifferensierte kolonier med PBS, og fordøye til enkeltceller ved hjelp Accutase inneholder 1X Y-27632. Pellet enkeltceller ved sentrifugering ved 200 xg i 2 min, resuspender i et lite volum av EB formasjon medium og bestemme celle titer ved hjelp av en hematocytometer.
- Legg til en aliquot av celler tilgjenværende EB formasjonen medium til resultere i en titer mellom 40.000 og 80.000 celler per ml.
- Ved hjelp av en flerkanals pipette, overføre 100 ul per brønn til en 96 V-bunnplaten, noe som resulterer i 4,000 til 8,000 celler per brønn. Spin 96-brønns plate i et utsvingbar plate sentrifuge ved 400 xg i 1 min for å samle cellene ved bunnen av brønner, og overføre til cellekultur inkubator. EBS vil danne over natten, som vist i figur 1.
3. Neuroectoderm Induksjon
- Neste dag (dag 0), samle EBS fra 96 V plate under en stereo mikroskop og overføring i et lite volum i en 3,5 cm bakteriell parabolen som inneholder 2 ml av differensiering medium. Forsiktig agitate fatet i flere sekunder for å vaske EBS.
- Legg 100 pl differensiering medium pr brønn av en ultra-lav-vedlegg U-bunn 96-brønns plate. Under en stereomikroskop, overføring EBS i små volumer fra vasking rett inn i 96U-brønner (en EB per vill). Sted 96U plate i cellekultur inkubator for 4 dager å tillate neuroectoderm formasjon.
4. Neuron Formation
- På dag 4, forberede en vask rett som i trinn 3.1 og i tillegg erstatte DMEM/F-12 i en forvarmet Matrigel-belagt 12-brønners plate med differensiering medium (1 ml per brønn).
- Plating av EBS
- Samle EBS fra 96U plate, vaske disse som ovenfor, og nøye frø dem en etter en inn i brønnene i Matrigel-belagte 12-brønns plate (ca. 8 EBS per brønn): EBS bør være jevnt fordelt innenfor brønnene å tillate uforstyrret utvekst av nevroner i løpet av de neste dagene (se "dag 5" bilde i figur 2).
- Før overføring av den 12-brønns plate tilbake i inkubatoren, tillate EBS å løst feste for rundt 10 min ved RT. Så forsiktig overføre 12-brønns plate i cellekultur inkubator. Neuroner vil vokse ut fra belagt EBS i en radial måte innenfor de neste 4 dager, som shown i Figur 2 ("dag 8" bildet til høyre).
5. Neuron formasjon som monolayers
- Som et alternativ til trinnene av punkt 4), på dag 4 av prosedyren, samle EBS i en 3,5 cm bakteriell parabolen inneholder 2 ml av differensiering medium, og deretter overføre EBS i et lite volum til et PBS-holdig parabolen, og deretter inn en annen parabolen inneholder Accutase.
- La fordøye til enkeltceller, sentrifuger ved 200 xg i 2 min, resuspender i et lite volum av differensiering medium og bestemme celle titer ved hjelp av en hematocytometer. Juster titer til 1-2x10 6 celler pr ml med differensiering medium (uten Y-27632).
- Plate celler ut i forvarmet Matrigel-belagt 12-brønners plate (1 ml per brønn), og overføring til cellekultur inkubator. Neuron formasjon som monolag ble observert mellom dager 7-8 (Figur 3C). Det bør imidlertid bemerkes, at dette monolaget variant avprosedyren er ikke optimalisert med hensyn til celleoverlevelse og mest egnet substrat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vår forrige rapport, i tråd med mange andre, kan EBS fra hPSCs bli generert ved å replating tilslag ved rutinemessig splitting av hPSCs inn i lav-vedlegg retter 10. Dette resulterer vanligvis i en bred distribusjon av resultat EB størrelser (Figur 1C, øverst). Annet problem resulterer fra dette er at EBS opprettholdt i suspensjon tendens til å aggregere med hverandre, som fører til en enda høyere heterogenitet av EB størrelser. For å omgå disse problemene, vi derfor forsøkt å generere EBS ved plating enkelt hPSCs inn i lav-vedlegg brønner for multititre plater (Figur 1A). Dette resulterte i ingen EB dannelse og celledød (figur 1B, nederst til høyre). Bruk av en kjent overlevelse molekyl for hPSCs, ga Y-27632, lignende resultater. Likeledes, tendens anvende polyvinylalkohol (PVA) som tidligere har vært vist å forbedre dannelsen av EB hESCs 16, å "samle" de hPSCs nederst den 96 V-Brønner, men førte ikke til EB formasjon. Men hvis kombinere Y-27632 med PVA tilskudd, var vi i stand til lett generere EBS fra encellede suspensjoner av hESCs, under kjemisk definerte vilkår (figur 1B). Hensiktsmessig kunne EB størrelser i denne multititre plate formatet være strengt kontrollert ved såing ulike antall celler per brønn, i motsetning til ved bruk av konvensjonelle teknikker (figur 1C, bunn).
Ved ytterligere inkubasjon i 96 V platene imidlertid tendens EBS å holde seg til bunnen av brønnene. Derfor, på dagen etter EB-formasjonen, ble det nødvendig å overføre EBS til ultra-lav vedlegg 96U plater (figur 1A). Neuroectoderm blir deretter indusert i dette formatet med en lite molekyl cocktail bestående av PD0325901 (FGF / ERK-hemmer), SB431542 (TGFβ/SMAD2 hemmer) og dorsomorphin (BMP/SMAD1 hemmer), som beskrevet 10. Etter neuroectoderm formasjonbruke denne lite molekyl cocktail, kan EBS bli belagt for å gi opphav til neuroner på ethvert format, forutsatt at flater er belagt med Matrigel, (figur 2). Ved å initiere EB formasjon med forskjellige antall celler (Figur 1C, nederst), fant vi at EBS generert fra rundt 8000 celler har en tendens til å gi den beste neuronal differensiering kapasitet. Dette er karakterisert ved uttalt nevrale utvekster fra belagt EBS, redusert nekrotiske EB sentre etter plating, og høy uttrykk for sensoriske og pan-neuronal markører som BRN3A og β-III tubulin (figur 2 og 3A, B). De samlede nevronale differensiering virkningsgrader synes å være sammenlignbar med den opprinnelige prosedyren (~ 70%) (figur 3), som var anvendelig både til hESCs og hiPSCs 10. Vi har så langt brukt to uavhengige hESC linjer, HuES6 og NCL3, i multiwell prosedyren, mens cellelinje-avhengig variasjon i differentiation effektivitet kan vanligvis ikke utelukkes.
Flere anvendelser av hPSC-deriverte nevroner vil kreve monolayers av differensierte celler i stedet for belagt EBS. Vi derfor også undersøkt om antatte neuroectodermal celle kuler på dag 4 av protokollen (figur 2, midten) kan være dissosiert i enkeltceller ved hjelp Accutase, for å deretter bli belagt ut som monolayers. Faktisk, ved plating ut enkeltceller av dag-4 neuroectodermal celler, uttales neuronal differensiering av disse replated cellene oppnås ved effektivitet på ca 60% (figur 3C).
Figur 1. EB formasjon prosedyre. A) Skjematisk av EB-formasjonen prosedyren. En dag før oppstart av differe ntiation (d-1), en suspensjon av hESCs inneholder flere tusen celler pr 100 ul er seeded i 96 V brønner, etterfulgt av sentrifugering. EBS dannet over natten blir deretter overført inn i ultralave feste 96U brønner for videre behandling. B) å teste effekten av PVA og Y-27632 på EB formasjonen. EB formasjon bare kunne observeres i medium inneholdende både PVA og Y-27632 (se pil hode) C) Topp:. EBS dannet av konvensjonelle midler er vanligvis heterogene i størrelse. Bunn: EBS dannet med "spin EB" teknikk avbildet i A. Ved å bruke forskjellige antall innsettingscellene, kan EB størrelser være strengt kontrollert og var svært jevn. Klikk her for å se større figur .
35fig2highres.jpg "/>
Figur 2. Neuron formasjon flytdiagram. En dag før initiering av differensiering (d-1), er EBS generert på 96 V platene bruker angitte EB formasjonen medium. Ved overdragelse av EBS i 96U plater, er nevrale induksjon gang ved å bruke differensiering medium. 4 dager senere, EBS belagt ut Matrigel-belagte brønner i en ønsket multiwell format. Representative morfologi er vist for hvert trinn. Bildet til høyre viser typiske neuronale utvekster fra belagt EBS - høy celletetthet area på svært høyre del av det pletterte EB senter hvorfra nervecellene tendens til å vokse ut i en radial måte. Alternativt, på dag 4, kan EBS være dissosiert i enkeltceller og belagt ut for terminal differensiering som monolayers (tekst og figur 3C for detaljer). Klikk her for å se større figur .
Figur 3. Karakterisering av nerveceller. A) Real-time RT-PCR karakterisering av dagen 8 bulk nevrale kulturer. Legg merke til at i differensierte prøver neural crest og pan-neuronal markørgener var sterkt oppregulert i forhold til udifferensierte kontroll celler. Selv prøver initiert med 16000 celler viste de høyeste neuronal uttrykk nivåer (merk logaritmisk skalering), EBS mellom 4000 og 8000 celler viste seg mest nyttige basert på morfologiske kriterier. B) De fleste celler som vokser ut fra belagt EBS er nevroner farging positivt for beta- III tubulin (rød) og sensoriske nervecellen markør BRN3A (grønn). C) Neurons dannet etter enkelt celle plating stedet for plating EBS. På dag 4 av protokollen (figur 2), Var flytende EBS dissociated hjelp Accutase og sådd ut som enkeltceller til da terminally skille som monolayers. Som vist på venstre side, ble celler med typiske neuronal morfologi som farget positivt for beta-III tubulin oppnås lett, mens celleoverlevelse syntes å være noe redusert i forhold til EB platekledning. Høyre: immunocytokjemi-baserte kvantifisering av neuronal yield (n = 3 representative seksjoner analysert + / - SD). Klikk her for å se større figur .
| Navn på genet | Fwd primer sekvens | Rev primer sekvens |
| ACTB (husholdningsgenet) | TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG | ACATCTGCTGGAAGGTGGACA |
| RPL37A (husholdningsgenet) | GTGGTTCCTGCATGAAGACAGTG | TTCTGATGGCGGACTTTACCG |
| DCX | AGGGCTTTCTTGGGTCAGAGG | GCTGCGAATCTTCAGCACTCA |
| ISL1 | TTTATTGTCGGAAGACTTGCCACTT | TCAAAGACCACCGTACAACCTTTATCT |
| MAPT | TTACCCTGGGCACTGGCCTA | TCCTGCTCAACATGGCAAACTC |
| NEUROD1 | GACTGATTGCACCAGCCCTTC | CGGACGGTTCGTGTTTGAAAG |
| NEUROG1 | CAGAGACAAGGAGTGGGCTTCA | CTCCAGCCCTGTGCCTGAAT |
| SOX10 | TCCTTGCCAGCTCCCTCTTC | CAAGGGTTAGGGCCTGAGCA |
| SYT4 | GCCAATCTCACCACCCAAATG | CACACACCATGCTTCCTTCCA |
Tabell 2. Primere som brukes til RT-qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De fleste differensiering protokoller som involverer EB formasjon fra hPSCs, inkludert vår tidligere utgitt prosedyre 10, er basert på manuell eller enzym-assistert høsting av hESCs som tilslag, som uunngåelig fører til heterogenitet i EB størrelser. Dette faktum fører til variasjon i differensiering effektivitet med noen cellelinjer, og derved gjøre systematiske analyser vanskelig, særlig på et middels gjennomstrømming skala. Videre er manuell disseksjon arbeidskrevende som i seg selv kompromisser skalerbarhet.
I motsetning til dette er metoden beskrevet her basert på EB formasjonen fra enkeltceller, noe som letter celle håndtering og minimerer variabilitet mellom prøvene. Viktigere, viser vi at samlet differensiering kapasitet i nevroner ikke synes å bli påvirket av å initiere protokollen med spin EBS. Videre holde enkelte EBS skilt fra hverandre ved hjelp av å bruke 96-brønners fjæring plater hindrer them fra aggregering med hverandre i suspensjon - som presenterer enda en ulempe med konvensjonelle prosedyren 10. Som et resultat, er mengden av input hPSCs kreves for å sette i gang en gitt eksperiment lav at omtrent en brønn av seks-brønners plate med subconfluent hPSC kolonier er vanligvis tilstrekkelig til å igangsette differensiering i to 96-brønners plater. Og endelig, spin EB teknikken stram kontroll over EB størrelser. Ifølge våre observasjoner, uttrykket nivåer av nevrale markører tendens til å øke til en viss grad med økende størrelser belagt EBS (Figur 3A). På den annen side, for stor EBS tendens til å vise nekrotiske sentre etter plating. Derfor, som et kompromiss, har vi funnet EBS av 4000 til 8000 celler for å være et egnet område.
På grunn av sin høye effektivitet, enkelhet, hastighet og kostnadseffektivitet, forventer vi beskrevet metode for å være en nyttig plattform for funksjonelle studier, sykdom-modellering krever menneskelig sensory nevroner, eller middels gjennomstrømning celle-baserte farmakologiske analyser krever nevroner av enhver type. Når det gjelder sistnevnte søknaden, ville kompatibilitet med automatisert analyse slik som høy-content avbildning være ønskelig. Dette, kan imidlertid bli kompromittert av det faktum at bare outgrowing nevroner i periferien av belagt EBS kunne analyseres. For å omgå dette hinderet, vi også forsøkt å generere monolayers av nerveceller ved dissociating EBS på dag 4 av protokollen og plating ut enkeltceller. Faktisk, kan dataene i Figur 3C tyder at nerveceller dannet til rimelig effektivitet på ca 60%. Imidlertid observerte vi en nedgang i celleoverlevelse under disse betingelser, noe som tyder på at denne variasjonen av protokollen kan videre utforsket og optimaliseres, for eksempel ved hjelp av en annet vedlegg substrat. (Tillegg av Y-27632 ved plating ut dag-4 celler i trinn 5.2 gjorde fremme celle overlevelse etter plating, men det syntes også å forstyrre wed etterfølgende neuronal differensiering og bør derfor utelates.) Videre vil det også være av interesse å undersøke hvorvidt andre typer nevroner kan genereres med denne plattformen, ved å variere den middels preparat i det andre trinn av protokollen. Dessuten, med hensyn til overføringen av EBS fra 96 V til 96U-formede brønner ved dag 0, ville det være ønskelig å tenke ut en prosedyre basert på flerkanals pipettering, til slutt oppnå høy throughput kompatibilitet av den beskrevne metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Max Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
- Pera, M. F., et al. Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin. J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity. Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).
- Greber, B., et al. FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells. EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).
- Anderson, S. L., et al. Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene. Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
