Summary
Pluripotent मानव स्टेम कोशिकाओं के neuronal भेदभाव (hPSCs) के लिए प्रोटोकॉल अक्सर समय लेने वाली और पर्याप्त सेल संस्कृति कौशल की आवश्यकता होती है. यहाँ, हम एक multititre प्लेट प्रारूप के लिए एक छोटा सा अणु आधारित भेदभाव प्रक्रिया को अनुकूलित किया है, एक नियंत्रित तरीके से मानव न्यूरॉन्स की सरल, तेजी से और कुशल पीढ़ी की इजाजत दी.
Abstract
मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) से न्यूरॉन्स की पीढ़ी के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल अक्सर कठिन है कि वे multistep अलगाव और तंत्रिका कोशिकाओं के अग्रदूत विस्तार पहले टर्मिनल भेदभाव शामिल प्रक्रियाओं हैं. इन समय लेने वाली दृष्टिकोण की तुलना में, हम हाल ही में पाया है कि तीन संकेत दे रास्ते, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, और FGF / ERK, संयुक्त निषेध hPSCs, कार्यात्मक न्यूरॉन्स में तत्काल भेदभाव द्वारा पीछा neuroectoderm की तेजी से प्रेरण को बढ़ावा देता है. यहाँ, हम एक उपन्यास multititre प्लेट प्रारूप हमारे प्रक्रिया को अनुकूलित किया है, आगे अपनी reproducibility बढ़ाने के लिए और यह मध्य throughput अनुप्रयोगों के साथ संगत बनाने के. यह अस्थायी (embryoid निकायों) क्षेत्रों, पक्षपाती की शर्तों के तहत न्यूरॉन्स में भेदभाव का एक और चार दिनों के द्वारा पीछा में neuroectoderm गठन के चार दिनों के शामिल हैं. ज्यादातर इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त कोशिकाओं द्विध्रुवी संवेदी न्यूरॉन्स दिखाई देते हैं. इसके अलावा,अत्यधिक कुशल प्रक्रिया है, विशेष रूप से विशेषज्ञ कौशल की आवश्यकता नहीं है, और लागत कुशल छोटे अणुओं के साथ एक सरल रासायनिक परिभाषित मध्यम पर आधारित है. इन सुविधाओं के कारण प्रक्रिया आगे कार्यात्मक जांच के लिए एक उपयोगी मंच के रूप में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल आधारित स्क्रीनिंग मानव संवेदी न्यूरॉन्स या किसी भी प्रकार के न्यूरॉन्स की आवश्यकता के दृष्टिकोण के लिए सेवा कर सकते हैं.
Introduction
hPSCs, जिसमें भ्रूण व्युत्पन्न मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs), pluripotent अर्थ है कि वे 1-2 इन विट्रो में विभिन्न सेल प्रजातियों को जन्म दे सकते हैं कर रहे हैं. कई विभेदित सेल प्रकार तिथि करने के लिए hESCs से प्राप्त किया गया है, धारणा है कि इन कोशिकाओं को वैज्ञानिक अनुसंधान और सेल आधारित स्क्रीनिंग दृष्टिकोण के लिए मूल्यवान उपकरण मौजूद है, और सेल आधारित चिकित्सा विज्ञान के लिए वादा पकड़ का समर्थन.
HESCs के लिए Neuronal भेदभाव प्रोटोकॉल आम तौर पर कर रहे हैं जटिल और समय लेने के रूप में वे अक्सर पहली उत्प्रेरण समग्र तंत्रिका भाग्य, तंत्रिका progenitors के मैनुअल, अलगाव और 3-6 ब्याज की एक दिया न्यूरॉन प्रकार में बाद टर्मिनल भेदभाव द्वारा पीछा किया पर आधारित हैं. कुछ संबंध में, यह आश्चर्य की बात है और अपरिहार्य जटिलता दिया है कि इस तरह के राज्य के कला निर्देशित भेदभाव प्रोटोकॉल stepwise के लिए करते हैं जल्दी मानव विकास है, जो की नकल नहीं हैज अपने आप में बेहद जटिल है. दूसरी ओर, यह भी भाग में अंतर्निहित आणविक प्रक्रियाओं के बारे में हमारी समझ की कमी को प्रतिबिंबित कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप भेदभाव प्रोटोकॉल है कि अभी भी पूरी तरह से अनुकूलित किया जा रहा से दूर कर रहे हैं में.
में neuroectoderm, Pera एट अल में undifferentiated hPSCs के रूपांतरण के लिए संबंध के साथ. पाया गया है कि बीएमपी / SMAD1/5/8 संकेतन के दमन 7 hESCs के तंत्रिका प्रेरण को बढ़ाता है. इसके अलावा, / 3 SMAD2 संकेतन की निष्क्रियता के neuroectoderm 8 गठन को बढ़ावा देने के दिखाया गया है. तदनुसार, इन दो रास्ते में से एक संयुक्त निष्क्रियता और अधिक कुशल 4,9 hPSCs के तंत्रिका प्रेरण करने के लिए नेतृत्व करने के लिए जाता है. हाल ही में, हम पता चला है कि एक तिहाई संकेतन मार्ग, FGF / ERK, hESCs में जल्द से जल्द neuroectodermal प्रतिबद्धता के इस कदम का एक मजबूत repressor के रूप में कार्य करता है. इसके विपरीत, इन सभी तीन रास्ते के साथ - साथ दमन neuroectoderm में साथ hESCs के रूपांतरण के पास सजातीय नेतृत्वसिर्फ चार 10 दिनों में. बाद में, अत्यधिक कुशल कार्यात्मक न्यूरॉन्स में टर्मिनल भेदभाव आठ दिनों के भीतर मनाया गया. प्राप्त न्यूरॉन्स परिधीय तंत्रिका तंत्र, जो भाग में उनके तेजी से 10 व्युत्पत्ति समझा जा सकता है के संवेदी न्यूरॉन्स होने की संभावना थे. संवेदी न्यूरॉन रखरखाव में दोष पारिवारिक dysautonomia 11 के रूप में इस तरह के कुछ मानव विकारों का एक कारण माना जाता है. जैसे hiPSC 12 प्रौद्योगिकी पर आधारित आगे कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए, रोगों, साथ ही लागू न्यूरॉन्स के किसी विशेष प्रकार की आवश्यकता नहीं प्रयोजनों के लिए अच्छी तरह से मॉडलिंग के लिए, इस भेदभाव की प्रक्रिया एक उपयोगी आधार मौजूद हो सकता है.
हालांकि, भेदभाव रणनीति हम मूल hESC 10 कालोनियों के clumps से भ्रूण के शरीर के शामिल गठन (यूके) में कार्यरत हैं, और यह काफी EB आकार के बारे में विविधता के एक डिग्री में हुई है, और भी कुछ CE में न्यूरॉन गठन दक्षता समझौता दिखाईकरूँगा लाइनों. इसके अलावा, EB आकार में विविधता के कारण, व्यवस्थित न्यूरॉन गठन के दौरान और बाद में अतिरिक्त वृद्धि कारक या छोटे अणुओं के प्रभाव का परीक्षण करने की क्षमता के लिए कुछ हद तक चकित हो दिखाई दिया.
इस रिपोर्ट में, हम मध्यम throughput संगत, मजबूर एकत्रीकरण आधारित तकनीक के लिए एक अत्यधिक आकार नियंत्रित तरीके में ईबीएस उत्पन्न करने के लिए हमारे पिछले प्रक्रिया रूपांतरित किया है, के रूप में भी 13 अन्य संदर्भों में दिखाया. इसके बाद, ईबीएस 96-अच्छी तरह से प्लेटों के वी के आकार कुओं U-आकार अल्ट्रा कम लगाव 96 अच्छी तरह प्लेटें हस्तांतरित में उत्पन्न करने के लिए निलंबन में neuroectoderm गठन आरंभ. चार दिन बाद, ईबीएस टर्मिनली विभेदित उच्च दक्षता और एकरूपता पर न्यूरॉन्स को जन्म देने के बाहर चढ़ाया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, दिन-4 ईबीएस एकल कक्षों में अलग थे और बाहर के रूप में इस तरह के, जिसके परिणामस्वरूप मानव न्यूरॉन्स के कम घनत्व monolayers में चढ़ाया. सुसंगत परिणाम इस प्रकार अब तक दो स्वतंत्र रूप से डी के साथ प्राप्त थेrived hESC लाइनों, HuES6 और NCL3.
एक शर्त के रूप में सफल EB गठन कड़ाई से एक सिंथेटिक बहुलक, polyvinyl शराब (PVA) के उपयोग पर निर्भर रॉक अवरोध करनेवाला वाई 27,632 hESC 13-14 अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता था, के साथ मिलकर. नतीजतन, ईबीएस की एकरूपता 96-V प्लेटों में गठित ईबीएस के बड़े पैमाने पर यादृच्छिक बंटवारे तकनीक पर आधारित संस्कृतियों के रूप में गठन के लिए तुलना में काफी हद तक बढ़ाया गया था. यह प्रणाली इस प्रकार निलंबन संस्कृति में neuroectoderm गठन, अत्यधिक नियंत्रित पक्षपाती शर्तों के तहत न्यूरॉन गठन द्वारा पीछा के लिए एक महत्वपूर्ण सुधार मंच प्रदान करता है.
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Protocol
1. Matrigel लेपित प्लेट्स और मीडिया की तैयारी
- Matrigel में लिपटे प्लेटों Matrigel की तैयारी ईबीएस फर्क की कुर्की के लिए एक पसंदीदा सब्सट्रेट होना पाया गया है और भी इन 10 से न्यूरॉन्स के कुशल परिणाम को बढ़ावा देता है.
- Thaw बर्फ पर रातोंरात Matrigel की 10 मिलीलीटर.
- अगले दिन, ठंडा DMEM/F-12 के दो संस्करणों के साथ जेली की तरह Matrigel पतला और 15 prechilled मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब जो संग्रहीत -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर हो सकता है में एक मिलीलीटर की aliquots तैयार
- Neuronal भेदभाव के लिए एक थाली स्वरूप पर फैसला. उदाहरण के लिए, एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, हम एक 12-अच्छी तरह से प्रारूप में एक भेदभाव के प्रारंभिक दौर के प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं. पूर्व शांत चार 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 अच्छी तरह प्लेटें पूर्व ठंडा ऊपर और नीचे pipetting जब तक सभी prediluted Matrigel thawed और भंग बाद DMEM/F-12 9 मिलीलीटर जोड़कर जमी Matrigel की एक अशेष भाजक भंग.
- तो, एक नया 50 मिलीलीटर बर्फ (अंतिम Matrigel कमजोर पड़ने: 1:75) पर DMEM/F-12 की 15 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में सामग्री को स्थानांतरित. फिर, पूर्व कूल्ड 12 अच्छी तरह प्लेटें की एक अच्छी तरह से पतला Matrigel की 0.5 मिलीलीटर जोड़ने. Parafilm साथ प्लेटों लपेटें और रातोंरात आरटी में खड़े हैं.
- अगले दिन, 4 डिग्री सेल्सियस प्लेटों हस्तांतरण लेपित प्लेट का उपयोग करने से पहले कई हफ्तों के लिए भंडारित किया जा सकता है.
- मीडिया
EB गठन मध्यम (~ 15 एक 96 अच्छी तरह से थाली में भेदभाव करने की जरूरत मिलीलीटर - 1 चित्रा में 2 और टेबल योजना देखें):
DMEM/F-12 साथ में 0.4% (PVA)
1x N2
1x B27
0.05% BSA
20 एनजी / एमएल FGF2
10 सुक्ष्ममापी वाई - 27,632
1x PenStrepGln
भेदभाव मध्यम (~ 30 मिलीलीटर एक 96 अच्छी तरह से थाली में भेदभाव करने की जरूरत है, एक Matrigel में लिपटे 12-अच्छी तरह से थाली में न्यूरॉन गठन के द्वारा पीछा किया, 1 टेबल देखें):
DMEM/F-12
1x N2
0.05% BSA
0.5 PD0325901 सुक्ष्ममापी
15 सुक्ष्ममापी SB431542
0.5 सुक्ष्ममापी Dorsomorphin
1x PenStrepGln
2. मजबूर EB गठन
- अपने पसंदीदा फीडर मुक्त शर्तों के तहत hPSCs आगे बढ़ें. हम Matrigel लेपित छह अच्छी तरह से 15 प्लेटों पर MEF वातानुकूलित माध्यम का उपयोग करें. हालांकि, घर या वाणिज्यिक परिभाषित मीडिया के रूप में अन्य संस्कृति प्रणालियों में भी काम करना चाहिए. भेदभाव का प्रयोग शुरू करने के समय, hPSCs उप सहधारा और सक्रिय रूप से बढ़ होना चाहिए.
- यंत्रवत् अनायास विभेदित एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत एक बाँझ प्लास्टिक विंदुक टिप का उपयोग कालोनियों को हटा दें.
- शेष undifferentiated एकल कक्षों, पीबीएस और पचाने में वाई 27,632 1X युक्त Accutase का उपयोग का उपयोग कर कालोनियों धो लें. गोली 2 मिनट, EB गठन माध्यम और सेल एक hematocytometer का उपयोग कर titre निर्धारित की एक छोटी मात्रा में resuspend के लिए 200 XG पर centrifugation द्वारा एकल कक्षों.
- कोशिकाओं के एक अशेष भाजक जोड़ेंशेष EB गठन मध्यम मिलीग्राम प्रति 40,000 और 80,000 कोशिकाओं के बीच एक titre में परिणाम.
- एक multichannel विंदुक का प्रयोग, 96V नीचे एक थाली के लिए अच्छी तरह से प्रति 100 μl हस्तांतरण, अच्छी तरह से प्रति 4,000 से 8000 कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप. स्पिन एक स्विंग बाहर 1 मिनट के लिए 400 XG पर थाली अपकेंद्रित्र में 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं के नीचे कोशिकाओं को इकट्ठा करने, है और सेल संस्कृति इनक्यूबेटर स्थानांतरण. ईबीएस रातोंरात फार्म, चित्रा 1 में दिखाया जाएगा.
3. Neuroectoderm प्रेरण
- अगले दिन (0 दिन), 96V थाली से एक स्टीरियो और एक 3.5 सेमी बैक्टीरियल भेदभाव माध्यम के 2 मिलीलीटर युक्त पकवान में एक छोटी मात्रा में माइक्रोस्कोप हस्तांतरण के तहत ईबीएस इकट्ठा. धीरे कई सेकंड के लिए पकवान को उत्तेजित करना है ईबीएस धो लो.
- भेदभाव माध्यम के 100 μl प्रति अच्छी तरह से एक अल्ट्रा कम लगाव प्लेट 96-अच्छी तरह से यू - नीचे के जोड़ें. एक stereomicroscope तहत, 96U कुओं में धोने के पकवान से छोटी मात्रा में स्थानांतरण ईबीएस (हम प्रति एक EB) करूँगा. जगह 4 दिन लिए neuroectoderm गठन की अनुमति के लिए सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 96U थाली.
4. न्यूरॉन गठन
- 4 दिन, 3.1 चरण में के रूप में एक कपड़े धोने पकवान तैयार है और इसके अलावा एक पूर्व गर्म Matrigel लेपित भेदभाव मध्यम (अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीग्राम) द्वारा 12-अच्छी तरह से थाली में DMEM/F-12 की जगह.
- ईबीएस एक के चढ़ाना
- 96U थाली से ईबीएस लीजिए, इन के रूप में ऊपर है, और ध्यान से बीज धोने उन्हें एक Matrigel में लिपटे 12-अच्छी तरह से थाली के कुओं में एक (8 के बारे में अच्छी तरह से प्रति ईबीएस): ईबीएस कुओं के भीतर समान रूप से वितरित किया जाना चाहिए करने के लिए undisturbed परिणाम की अनुमति अगले कुछ दिनों में न्यूरॉन्स (देखें "5 दिन चित्रा 2 में छवि).
- 12 अच्छी तरह से इनक्यूबेटर में वापस थाली के हस्तांतरण से पहले, ईबीएस शिथिल आरटी पर लगभग 10 मिनट के लिए अनुमति देते हैं. फिर, ध्यान से सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 12 अच्छी तरह से थाली हस्तांतरण. न्यूरॉन्स एक रेडियल तरीके से मढ़वाया ईबीएस से अगले 4 दिनों के भीतर हो जाना थानेदार के रूप में,चित्रा 2 में wn (8 दिन "सही पर इस छवि).
5. Monolayers रूप न्यूरॉन गठन
- 4 अंक के कदम के लिए एक विकल्प के रूप में), प्रक्रिया के 4 दिन में, एक 3.5 सेमी बैक्टीरियल भेदभाव माध्यम के 2 मिलीलीटर युक्त पकवान में ईबीएस एकत्रित करते हैं, तो पीबीएस युक्त एक डिश के लिए एक छोटी मात्रा में ईबीएस स्थानांतरित करने के लिए, और बाद में अन्य Accutase युक्त पकवान.
- एकल कक्षों, 2 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र, भेदभाव माध्यम की एक छोटी मात्रा में resuspend पचाने में और सेल एक hematocytometer का उपयोग titre का निर्धारण. 1-2x10 मिलीलीटर प्रति 6 कोशिकाओं भेदभाव मध्यम (वाई 27,632 के बिना) का उपयोग करने के लिए titre समायोजित करें.
- पूर्व गर्म Matrigel में लिपटे 12-अच्छी तरह से (अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीग्राम) थाली, और सेल संस्कृति इनक्यूबेटर हस्तांतरण में प्लेट कोशिकाओं. Monolayers रूप न्यूरॉन गठन 7 दिनों के लिए 8 (चित्रा -3 सी) के बीच मनाया गया. यह ध्यान दिया जाना चाहिए तथापि, कि इस monolayer के संस्करणप्रक्रिया सेल अस्तित्व और सबसे उपयुक्त सब्सट्रेट संबंध के साथ पूरी तरह से अनुकूल नहीं है.
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Representative Results
हमारी पिछली रिपोर्ट में कई अन्य लोगों के साथ लाइन में, hPSCs से ईबीएस कम लगाव 10 व्यंजन में दिनचर्या hPSCs के बंटवारे पर समुच्चय replating द्वारा बस उत्पन्न हो सकता है. यह जिसके परिणामस्वरूप EB आकार (चित्रा 1C, ऊपर) की एक विस्तृत वितरण में आमतौर पर परिणाम है. एक और इस से उत्पन्न समस्या यह है कि निलंबन में बनाए रखा ईबीएस एक दूसरे के साथ कुल के लिए करते हैं, जिससे EB आकार के एक भी उच्च विविधता. इन समस्याओं को दरकिनार करने के लिए, इसलिए हम कम लगाव multititre प्लेटों के कुओं (चित्रा 1 ए) में एकल hPSCs चढ़ाना ईबीएस उत्पन्न करने का प्रयास किया. यह कोई EB गठन और कोशिका मृत्यु (चित्रा 1B, नीचे सही) में हुई. HPSCs के लिए एक ज्ञात अस्तित्व अणु लागू, 27,632 वाई, इसी तरह के परिणाम दे दी है. इसी तरह, आवेदन polyvinyl शराब (PVA), जो पहले hESCs के 16 EB गठन बढ़ाने दिखाया गया है 96V के नीचे hPSCs "" इकट्ठा की प्रवृत्तिलेकिन कुओं EB गठन नहीं हो पाई. हालांकि, अगर Y PVA अनुपूरण के साथ 27,632 के संयोजन, हम hESCs के एकल कक्ष निलंबन, रासायनिक परिभाषित शर्तों के तहत (चित्रा 1B) से आसानी से ईबीएस उत्पन्न करने में सक्षम थे. सुविधा, इस multititre प्लेट प्रारूप में EB आकार कसकर कोशिकाओं के विभिन्न संख्या के प्रति अच्छी तरह से बोने के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है और परंपरागत तकनीकों (चित्रा 1C, नीचे) का उपयोग करने के लिए विपरीत.
96V प्लेटों में आगे ऊष्मायन पर, तथापि, ईबीएस कुओं के नीचे करने के लिए छड़ी की प्रवृत्ति. इसलिए, दिन EB गठन के बाद, यह अल्ट्रा कम लगाव 96U प्लेट (चित्रा 1 ए) के लिए ईबीएस हस्तांतरण के लिए आवश्यक था. Neuroectoderm तो इस प्रारूप में एक छोटा सा अणु PD0325901 (FGF / ERK अवरोध करनेवाला), SB431542 (TGFβ/SMAD2 अवरोध करनेवाला) से मिलकर कॉकटेल का उपयोग प्रेरित है, और dorsomorphin (BMP/SMAD1 अवरोध करनेवाला), 10 के रूप में वर्णित है. Neuroectoderm गठन के बादइस छोटे अणु कॉकटेल का उपयोग, ईबीएस बाहर चढ़ाया जा सकता है किसी भी प्रारूप पर न्यूरॉन्स को जन्म देने कि सतहों Matrigel साथ लेपित हैं, (2 चित्रा). कोशिकाओं के विभिन्न संख्या (चित्रा 1C, नीचे) के के साथ EB गठन की शुरुआत करके, हमने पाया कि ईबीएस 8000 कोशिकाओं के आसपास से उत्पन्न करने के लिए सबसे अच्छा neuronal भेदभाव क्षमता उपज होते हैं. मढ़वाया ईबीएस, चढ़ाना के बाद परिगलित EB केन्द्रों को कम, और BRN3A और β-III ट्यूबिलिन (2 आंकड़े और 3 ए, बी) जैसे संवेदी और अखिल neuronal मार्कर की उच्च अभिव्यक्ति से स्पष्ट neuronal outgrowths द्वारा विशेषता है. समग्र neuronal भेदभाव क्षमता मूल प्रक्रिया (~ 70%) (3 चित्रा), जो दोनों hESCs और hiPSCs 10 लागू किया गया था बराबर होना दिखाई देते हैं. हम इस प्रकार अब तक दो स्वतंत्र hESC लाइनों, HuES6 और NCL3 प्रक्रिया में multiwell, कार्यरत है, जबकि सेल लाइन पर निर्भर differentiatio में परिवर्तनशीलताn क्षमता आम तौर पर इनकार नहीं किया जा सकता है.
HPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के कई अनुप्रयोगों मढ़वाया ईबीएस की बजाय विभेदित कोशिकाओं की monolayers की आवश्यकता होगी. इसलिए हम यह भी जांच की कि प्रोटोकॉल के 4 दिन (2 चित्रा, मध्य) में ख्यात neuroectodermal सेल क्षेत्रों एकल Accutase कोशिकाओं का उपयोग कर dissociated में हो सकता है, तो बाहर monolayers रूप में चढ़ाया. दरअसल, बाहर दिन-4 neuroectodermal कोशिकाओं के एकल कक्षों चढ़ाना पर, neuronal इन replated कोशिकाओं के भेदभाव लगभग 60% की क्षमता (चित्रा 3C) प्राप्त सुनाया.
चित्रा 1. EB गठन प्रक्रिया EB गठन प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध). विभिन्न की दीक्षा से पहले एक दिन (घ-1) ntiation, 100 μl प्रति कई हजार कोशिकाओं युक्त hESCs के एक निलंबन 96V कुओं में वरीयता दी गई है, centrifugation द्वारा पीछा किया. ईबीएस रातोंरात गठन कर रहे हैं तो आगे के इलाज के लिए अल्ट्रा कम लगाव 96U कुओं में स्थानांतरित बी.) EB गठन पर PVA और वाई 27,632 के प्रभाव का परीक्षण. EB गठन केवल दोनों PVA और वाई 27,632 (तीर सिर देख) युक्त मध्यम में मनाया जा सकता है सी) शीर्ष: परंपरागत साधनों द्वारा गठित ईबीएस आमतौर पर आकार में विषम. नीचे: ईबीएस "स्पिन EB" इनपुट कोशिकाओं के विभिन्न संख्या का उपयोग करके ए में चित्रित तकनीक के साथ बनाई, EB आकार कसकर नियंत्रित किया जा सकता है और अत्यधिक वर्दी थे. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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चित्रा 2. न्यूरॉन गठन प्रवाह चार्ट भेदभाव की दीक्षा (d-1) एक दिन पहले, ईबीएस 96V संकेत EB गठन माध्यम का उपयोग कर प्लेट में उत्पन्न कर रहे हैं. ईबीएस 96U प्लेटों में हस्तांतरण पर, तंत्रिका प्रेरण भेदभाव माध्यम का उपयोग शुरू किया है. 4 दिन बाद, ईबीएस बाहर एक वांछित multiwell स्वरूप के Matrigel लेपित कुओं में चढ़ाया जाता है. प्रतिनिधि morphologies प्रत्येक चरण के लिए दिखाए जाते हैं. सही पर तस्वीर मढ़वाया ईबीएस से विशिष्ट neuronal outgrowths से पता चलता है - उच्च घनत्व सेल पर क्षेत्र बहुत सही मढ़वाया EB केंद्र से जो न्यूरॉन्स एक रेडियल तरीके से बाहर हो जाना करते हैं का हिस्सा है. वैकल्पिक रूप से, 4 दिन ईबीएस एकल कक्षों में अलग हो सकता है और टर्मिनल भेदभाव के लिए बाहर चढ़ाया (विवरण के लिए पाठ और 3C चित्रा) monolayers. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. न्यूरॉन्स की विशेषता) वास्तविक समय दिन के लक्षण वर्णन RT-पीसीआर 8 थोक neuronal संस्कृतियों. ध्यान दें कि विभेदित नमूनों में तंत्रिका शिखा और अखिल neuronal मार्कर जीन जोरदार upregulated undifferentiated नियंत्रण कक्ष के रूप में की तुलना में थे. हालांकि 16,000 कोशिकाओं के साथ शुरू नमूनों उच्चतम neuronal अभिव्यक्ति (लघुगणक स्केलिंग नोट) स्तर, ईबीएस से पता चला कि 4000 के बीच 8000 कोशिकाओं morphological मापदंड के आधार पर सबसे अधिक उपयोगी साबित बी.) सबसे मढ़वाया ईबीएस से बढ़ कोशिकाओं के लिए सकारात्मक धुंधला न्यूरॉन्स बीटा III ट्यूबिलिन (लाल) और संवेदी न्यूरॉन मार्कर BRN3A (हरा) सी) न्यूरॉन्स एकल कोशिका के बजाय चढ़ाना ईबीएस चढ़ाना के बाद गठन किया था. प्रोटोकॉल के 4 दिन (चित्रा 2), चल ईबीएस Accutase dissociated का उपयोग कर और एकल कक्षों के रूप में वरीयता प्राप्त करने के लिए तो टर्मिनली monolayers के रूप में अलग थे. के रूप में छोड़ दिया पर दिखाया गया है, पर ठेठ neuronal आकारिकी साथ कोशिकाओं कि बीटा III ट्यूबिलिन के लिए सकारात्मक दाग को आसानी से प्राप्त किया गया जबकि सेल अस्तित्व के रूप में EB चढ़ाना तुलना में कुछ हद तक कम किया जा दिखाई दिया. अधिकार: neuronal उपज की मात्रा का ठहराव Immunocytochemistry आधारित (n = 3 प्रतिनिधि + / विश्लेषण - वर्गों एसडी). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
| जीन का नाम | Fwd प्राइमर अनुक्रम | राजस्व प्राइमर अनुक्रम |
| ACTB (गृह व्यवस्था जीन) | TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG | ACATCTGCTGGAAGGTGGACA |
| RPL37A (गृह व्यवस्था जीन) | GTGGTTCCTGCATGAAGACAGTG | TTCTGATGGCGGACTTTACCG |
| DCX | AGGGCTTTCTTGGGTCAGAGG | GCTGCGAATCTTCAGCACTCA |
| ISL1 | TTTATTGTCGGAAGACTTGCCACTT | TCAAAGACCACCGTACAACCTTTATCT |
| MAPT | TTACCCTGGGCACTGGCCTA | TCCTGCTCAACATGGCAAACTC |
| NEUROD1 | GACTGATTGCACCAGCCCTTC | CGGACGGTTCGTGTTTGAAAG |
| NEUROG1 | CAGAGACAAGGAGTGGGCTTCA | CTCCAGCCCTGTGCCTGAAT |
| SOX10 | TCCTTGCCAGCTCCCTCTTC | CAAGGGTTAGGGCCTGAGCA |
| SYT4 | GCCAATCTCACCACCCAAATG | CACACACCATGCTTCCTTCCA |
तालिका 2. प्राइमर्स RT-qPCR के लिए प्रयोग किया जाता है.
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Discussion
अधिकांश भेदभाव हमारे पहले प्रकाशित की प्रक्रिया 10 सहित hPSCs, से EB गठन से जुड़े प्रोटोकॉल मैनुअल या समुच्चय है, जो अनिवार्य रूप से EB आकार में विविधता की ओर जाता है के रूप में hESCs एंजाइम की मदद से की कटाई पर आधारित हैं. इस तथ्य को कुछ सेल लाइनों के साथ भेदभाव दक्षता में परिवर्तनशीलता की ओर जाता है, जिससे व्यवस्थित विश्लेषण करती है मुश्किल प्रतिपादन, एक मध्यम throughput पैमाने पर विशेष रूप से है. इसके अलावा, मैनुअल विच्छेदन श्रम प्रधान जो अपने आप scalability समझौता है.
इसके विपरीत, यहाँ वर्णित विधि एकल कक्षों, जो सेल और नमूने के बीच कम से कम परिवर्तनशीलता से निपटने की सुविधा से EB गठन पर आधारित है. महत्वपूर्ण बात है, हम बताते हैं कि न्यूरॉन्स में समग्र भेदभाव क्षमता के लिए स्पिन ईबीएस के साथ प्रोटोकॉल की शुरुआत से प्रभावित हो प्रतीत नहीं होता. इसके अलावा रखते हुए, व्यक्तिगत 96-अच्छी तरह से निलंबन प्लेट का उपयोग कर के माध्यम से एक दूसरे से अलग ईबीएस टी रोकता हैजो पारंपरिक प्रक्रिया 10 का अभी तक एक और दोष प्रस्तुत निलंबन में एक दूसरे के साथ से कुल हेम. एक परिणाम के रूप में, इनपुट एक दिया प्रयोग आरंभ करने के लिए आवश्यक hPSCs की राशि लगभग 6 अच्छी तरह से थाली subconfluent hPSC कालोनियों के साथ अच्छी तरह से एक आम तौर पर दो 96 अच्छी तरह प्लेटें में भेदभाव आरंभ करने के लिए पर्याप्त है कि कम है. अंत में, स्पिन EB तकनीक EB आकार पर कड़ा नियंत्रण के लिए सक्षम बनाता है. हमारी टिप्पणियों के अनुसार, neuronal मार्करों की अभिव्यक्ति के स्तर मढ़वाया ईबीएस (चित्रा 3A) के बढ़ते आकार के साथ कुछ हद तक वृद्धि करते हैं. दूसरी ओर, बहुत बड़ी ईबीएस चढ़ाना के बाद परिगलित केन्द्रों को प्रदर्शित करते हैं. इसलिए, एक समझौते के रूप में, हम 4000 के लिए 8000 कोशिकाओं के ईबीएस एक उपयुक्त श्रेणी हो पाया.
इसकी उच्च दक्षता के कारण, सादगी, गति, और लागत प्रभावशीलता, हम कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक उपयोगी मंच वर्णित विधि के लिए आशा है, रोग मॉडलिंग मानव की आवश्यकता होती हैensory न्यूरॉन्स, या मध्यम throughput सेल आधारित औषधीय किसी भी प्रकार के न्यूरॉन्स की आवश्यकता assays. बाद के आवेदन के बारे, उच्च सामग्री इमेजिंग के रूप में इस तरह के स्वचालित विश्लेषण के साथ अनुकूलता वांछनीय होगा. यह, हालांकि, तथ्य यह है कि मढ़वाया ईबीएस की परिधि में केवल outgrowing न्यूरॉन्स विश्लेषण किया जा सकता है के द्वारा समझौता किया जा सकता है. इस बाधा को दरकिनार करने के लिए, हम भी करने के लिए प्रोटोकॉल के 4 दिन में ईबीएस dissociating और बाहर एकल कक्षों चढ़ाना न्यूरॉन्स की monolayers उत्पन्न करने का प्रयास किया. दरअसल, चित्रा 3C में आंकड़े बताते हैं कि न्यूरॉन्स लगभग 60% की उचित दक्षता में गठित. हालांकि, हम इन शर्तों के तहत सेल अस्तित्व में एक कमी मनाया, सुझाव है कि प्रोटोकॉल के इस बदलाव आगे का पता लगाया और हो सकता है अनुकूलित किया है, उदाहरण के लिए एक अलग लगाव सब्सट्रेट का उपयोग करके. (5.2 चरण में बाहर दिन-4 कोशिकाओं चढ़ाना पर Y-+२७,६३२ के अलावा चढ़ाना के बाद सेल अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए किया था, लेकिन यह भी w हस्तक्षेप दिखाईइसलिए ith बाद में neuronal भेदभाव और छोड़े गए. होना चाहिए) इसके अलावा, यह भी प्रोटोकॉल के दूसरे चरण में मध्यम संरचना अलग से जांच करने के लिए है कि न्यूरॉन्स के अन्य प्रकार इस मंच के साथ उत्पन्न किया जा सकता है दिलचस्प हो जाएगा. इसके अलावा, 96V 0 दिन में 96U के आकार कुओं में से ईबीएस के हस्तांतरण के संबंध के साथ, यह एक multichannel pipetting के आधार पर प्रक्रिया ईजाद करने के लिए वांछनीय हो सकता है, अंततः वर्णित विधि की अनुकूलता उच्च throughput हासिल होगा.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के मैक्स प्लैंक सोसायटी द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
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