Summary
Protokolle für die neuronale Differenzierung von pluripotenten menschlichen Stammzellen (hPSCs) sind oft zeitaufwendig und erfordern erhebliche Zellkultur Fähigkeiten. Hier haben wir ein kleines Molekül-basierte Differenzierung Verfahren zu einem multititre Plattenformat angepasst, die eine einfache, schnelle und effiziente Erzeugung von menschlichen Nervenzellen in einer kontrollierten Art und Weise.
Abstract
Bestehenden Protokollen zur Erzeugung von Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) sind oft langwierig, da sie mehrstufige Verfahren, die die Isolierung und Expansion von neuralen Vorläuferzellen, vor terminalen Differenzierung. Im Vergleich zu diesen zeitraubenden Ansätze haben wir kürzlich festgestellt, dass kombinierte Hemmung von drei Signalwege, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 und FGF / ERK, rasche Induktion Neuroektoderms fördert aus hPSCs, durch sofortige Differenzierung in funktionelle Neuronen gefolgt. Hier haben wir unser Verfahren eine neuartige multititre Plattenformat angepasst, den weiteren Ausbau ihrer Reproduzierbarkeit und kompatibel zu machen mit mittel-Throughput-Anwendungen. Es umfasst vier Tagen Neuroektoderms Formation in schwimmenden Kugeln (Embryoid Bodies), um weitere vier Tagen Differenzierung zu Neuronen unter adhärenten Bedingungen. Die meisten Zellen mit diesem Protokoll erhalten scheinen bipolaren sensorischen Neuronen sein. Außerdemdas Verfahren ist sehr leistungsfähig, erfordert keine besondere fachlichen Fähigkeiten, und basiert auf einer einfachen chemisch definierten Medium mit kosteneffizienten niedermolekularen Wirkstoffen. Aufgrund dieser Eigenschaften kann das Verfahren als eine nützliche Plattform für die weitere funktionelle Untersuchungen sowie für zellbasierte Screening-Ansätze erfordern menschlichen sensorischen Neuronen oder Nervenzellen jeglicher Art dienen.
Introduction
hPSCs, bestehend aus Embryonen gewonnenen humanen embryonalen Stammzellen (hES) und induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) sind pluripotent Bedeutung, dass sie sich zu verschiedenen Zelllinien in vitro 1-2 geben. Zahlreiche differenzierte Zelltypen wurden aus hES-Zellen bisher abgeleitet, unterstützen die Vorstellung, dass diese Zellen wertvolle Werkzeuge für die wissenschaftliche Forschung und zellbasierte Screening-Ansätze zu präsentieren und versprechen für zellbasierte Therapeutika.
Protokolle für neuronale Differenzierung hESCs sind üblicherweise kompliziert und zeitaufwendig, da sie oft beim ersten induzierenden gesamten Neuronalen Schicksal, durch manuelle Trennung von neuralen Vorläuferzellen und anschließender terminaler Differenzierung zu einem gegebenen Neuron interessierenden Art 3-6 gefolgt basieren. In mancher Hinsicht ist diese Komplexität nicht überraschend und unvermeidlich, daß solche state-of-the-art gerichteten Differenzierung Protokolle schrittweise neigen zu imitieren frühen menschlichen Entwicklung, seit M.h ist in sich außerordentlich komplex. Auf der anderen Seite, kann es zum Teil auch Ausdruck unserer mangelnden Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Prozesse, die sich in der Differenzierung Protokolle, die noch weit davon entfernt, vollständig optimiert.
Im Hinblick auf die Umwandlung von undifferenzierten hPSCs in Neuroektoderms, Pera et al. festgestellt, dass Unterdrückung von BMP / SMAD1/5/8 Signalisierung neuralen Induktion von hESCs 7 erhöht. Darüber hinaus hat die Inaktivierung von SMAD2 / 3 Signalisierung gezeigt, Neuroektoderms Formation 8 fördern. Dementsprechend neigt kombiniert Inaktivierung dieser beiden Signalwege zu einer effizienteren neuronalen Induktion hPSCs 4,9 führen. Vor kurzem haben wir gezeigt, dass ein Drittel Signalweg, FGF / ERK als starker Repressor der frühesten Schritte neuroektodermalen Engagement in hESCs dient. Umgekehrt führen gleichzeitiger Unterdrückung von all diesen drei Wegen in der Nähe homogene Umwandlung von hES-Zellen in Neuroektoderms mitin nur vier Tagen 10. Anschließend wurde hocheffiziente terminalen Differenzierung in funktionale Nervenzellen innerhalb von acht Tagen beobachtet. Die Neuronen erhalten wurden wahrscheinlich sensorischen Neuronen des peripheren Nervensystems, die zum Teil erklären könnte ihre rasche Ableitung 10 sein. Defekte in sensorischen Neuronen Wartung eine Ursache bestimmter menschlicher Erkrankungen wie familiäre dysautonomia 11 betrachtet. Zur Modellierung solcher Krankheiten auf hiPSC Technologie 12 basiert, für weitere funktionelle Charakterisierung sowie zur aufgebracht Zwecke nicht erforderlich ist, eine bestimmte Art von Neuronen, kann diese Differenzierung Verfahren stellen eine brauchbare Basis.
Allerdings führte die Differenzierungsstrategie ursprünglich beteiligt Bildung von embryonalen Körper (EBs) von Klumpen von HES Kolonien 10 eingesetzt, und diese in einem ganz Grad der Heterogenität bezüglich EB Größen und schien auch Neuron Bildung Effizienz in irgendeiner ce kompromittierenll Linien. Darüber hinaus aufgrund der Heterogenität in EB Größen erschien die Fähigkeit, systematisch zu testen Auswirkungen von zusätzlichen Wachstumsfaktoren oder kleine Moleküle während und nach Bildung Neuron etwas verwechselt werden.
In diesem Bericht haben wir unsere bisherigen Verfahren zu einem mittleren Durchsatz-kompatibel, gezwungen, Aggregation-basierte Technik, um EBs in einem sehr size-kontrollierte Weise erzeugen, wie auch in anderen Zusammenhängen 13 dargestellt. Anschließend wird die EBs in V-förmige Vertiefungen von 96-Well-Platten wurden mit U-förmigen ultra-low attachment 96-Well-Platten transferiert erzeugt, um Neuroektoderms Formation in Suspension einzuleiten. Vier Tage später konnte die EBs aus was zu ausdifferenzierten Neuronen bei hohem Wirkungsgrad und Homogenität beschichtet werden. Alternativ wurden Tag-4 EBs in einzelne Zellen dissoziiert und als solche, die Folge niedriger Dichte Monoschichten der menschlichen Neuronen überzogen. Coherent Ergebnisse wurden bisher mit zwei unabhängig de erhaltenrived hES-Zelllinien, HuES6 und NCl3.
Als Voraussetzung war erfolgreich EB Bildung strikt abhängig von der Verwendung eines synthetischen Polymer, Polyvinylalkohol (PVA), zusammen mit ROCK Inhibitor Y-27632 bekannten HES Überleben 13-14 fördern. Als ein Ergebnis gebildet Homogenität der EBs in 96-V-Platten wurde im wesentlichen gegenüber Bildung von EBs als Masse Kulturen auf zufällige Spaltung Techniken verbessert. Dieses System stellt somit eine deutlich verbesserte Plattform für Neuroektoderms Formation in Suspensionskultur, die von hoch kontrollierten Neuron Formation unter adhärenten Bedingungen.
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Protocol
Ein. Vorbereitung der Matrigel-beschichteten Platten und Medien
- Herstellung von Matrigel-beschichteten Platten Matrigel wurde gefunden, ein bevorzugtes Substrat für die Befestigung von differenzierenden EBs sein und fördert auch die effiziente Auswachsen von Neuronen aus diesen 10.
- Thaw 10 ml Matrigel über Nacht auf Eis.
- Am nächsten Tag, verdünnen das geleeartige Matrigel mit zwei Volumina eiskaltem DMEM/F-12 und bereiten Aliquots von 1 ml in vorgekühlte 15 ml konischen Röhrchen, die bei -20 ° C werden
- Entscheiden Sie auf einem Teller-Format für die neuronale Differenzierung. Zum Beispiel, als Ausgangspunkt, empfehlen wir eine erste Runde der Differenzierung in einer 12-Well-Format durchzuführen. Pre-cool vier 12-Well-Platten bei 4 ° C. Lösen Sie ein Aliquot der gefrorenen Matrigel durch Zugabe von 9 ml vorgekühlte DMEM/F-12 durch Auf-und Abpipettieren, bis alle vorverdünnte Matrigel wurde aufgetaut und gelöst, gefolgt.
- Dann, Übertragen Sie den Inhalt in ein neues 50-ml-Tube mit 15 ml DMEM/F-12 auf Eis (final Matrigel Verdünnung: 1:75). Dann fügen Sie 0,5 ml verdünntem Matrigel in jede Vertiefung der vorgekühlten 12-Well-Platten. Wickeln Platten mit Parafilm und stehen lassen über Nacht bei RT.
- Am nächsten Tag übertragen Platten auf 4 ° C. Beschichteten Platten können für mehrere Wochen vor der Verwendung gelagert werden.
- Medien
EB Bildung Medium (~ 15 ml benötigt, um die Differenzierung in einem 96-Well-Platte durchzuführen - siehe Tabelle 1 und Schema in Abbildung 2):
DMEM/F-12 mit 0,4% (PVA)
1x N2
1x B27
0,05% BSA
20 ng / ml FGF2
10 uM Y-27632
1x PenStrepGln
Differenzierungsmedium (~ 30 ml benötigt, um die Differenzierung in einer 96-Well-Platte durchzuführen, gefolgt von Neuron-Bildung in einem Matrigel-beschichteten 12-Well-Platte, siehe Tabelle 1):
DMEM/F-12
1x N2
0,05% BSA
0,5 uM PD0325901
15 uM SB431542
0,5 uM Dorsomorphin
1x PenStrepGln
2. Erzwungene EB Formation
- Wachsen hPSCs unter Ihrem bevorzugten Feeder-freien Bedingungen. Wir verwenden MEF-konditioniertes Medium auf Matrigel-beschichteten 6-Loch-Platten 15. Allerdings sollten andere Kultur Systemen wie selbstgemacht oder kommerziell definierten Medien auch funktionieren. Zum Zeitpunkt des Startens eines Differenzierung Experiment sollte hPSCs sein subkonfluente und aktiv wachsen.
- Mechanisch entfernen spontan differenziert Kolonien mit einer sterilen Kunststoff-Pipettenspitze unter einem Stereomikroskop.
- Waschen verbleibenden undifferenzierte Kolonien mit PBS, und verdauen, um einzelne Zellen mit Accutase mit 1X Y-27632. Pellet einzelnen Zellen durch Zentrifugation bei 200 × g für 2 Minuten, in einem kleinen Volumen von EB Bildung Medium und bestimmen Zelltiter unter Verwendung eines Hämozytometers resuspendieren.
- Fügen Sie ein Aliquot von Zellendie restlichen EB Bildung Medium in einem Titer zwischen 40.000 und 80.000 Zellen pro ml führen.
- Mit einer Mehrkanalpipette, dann 100 ul pro Well einer 96V-Bodenplatte, was 4.000 bis 8.000 Zellen pro Vertiefung. Spin 96-Well-Platte in einem Swing-out Platte Zentrifuge bei 400 xg für 1 min zu sammeln Zellen am Boden der Wells und Transfer zum Zellkulturbrutschrank. EBs über Nacht bilden, wie in Abbildung 1 dargestellt.
3. Neuroektoderms Induction
- Am nächsten Tag (Tag 0), sammeln EBs aus 96V Platte unter einem Stereomikroskop und Transfer in einem kleinen Volumen in einen 3,5 cm bakterielle Schale mit 2 ml Differenzierungsmedium. Vorsichtig geschwenkt, das Gericht für einige Sekunden, um die EBs waschen.
- Fügen Sie 100 ul der Differenzierung Medium pro Vertiefung einer ultra-low-Anlage U-96-Well-Platte. Unter einem Stereomikroskop, Transfer EBs in kleinen Mengen aus dem Abspülen in die 96U-Brunnen (ein EB pro wirll). Ort 96U Platte in Zellkulturbrutschrank für 4 Tage Neuroektoderms Bildung zu ermöglichen.
4. Neuron Formation
- Am Tag 4, bereiten ein Abspülen wie in Schritt 3,1 und zusätzlich ersetzen DMEM/F-12 in einer vorgewärmten Matrigel-beschichteten 12-Well-Platte durch Differenzierung Medium (1 ml pro Vertiefung).
- Plating von EBs
- Collect EBs aus 96U Platte, wäscht diesen wie oben, und sorgfältig Saatgut sie nacheinander in die Vertiefungen der Matrigel-beschichteten 12-Well-Platte (ungefähr 8 EBs pro Well): EBs gleichermaßen sollte innerhalb der Vertiefungen zu verteilen, damit ungestörte Auswuchs ermöglichen Neuronen in den nächsten Tagen (siehe "Tag 5" in Abbildung 2).
- Vor der Übertragung der 12-Well-Platte wieder in den Inkubator, ermöglichen EBs lose ca. 10 min bei RT befestigen. Dann transferieren Sie 12-Well-Platte auf Zellkulturbrutschrank. Neuronen wachsen aus dem plattierten EBs in radialer Weise innerhalb der nächsten 4 Tage, wie shown in Abbildung 2 ("Tag 8" Bild rechts).
5. Neuron Formation als Monoschichten
- Als Alternative zu den Schritten des Punktes 4), am Tag 4 der Prozedur, sammeln EBs in eine 3,5 cm bakteriellen Schale, enthaltend 2 ml Differenzierungsmedium, dann übertragen EBs in einem kleinen Volumen zu einem PBS-enthaltenden Schale und dann in andere Schale mit Accutase.
- Lassen verdauen, um einzelne Zellen, Zentrifuge bei 200 × g für 2 Minuten, in einem kleinen Volumen von Differenzierungsmedium resuspendiert und bestimmen Zelltiter unter Verwendung eines Hämozytometers. Passen Titer zu 1-2x10 6 Zellen pro ml unter Verwendung Differenzierungsmedium (ohne Y-27632).
- Platte Zellen in vorgewärmten Matrigel-beschichteten 12-Well-Platte (1 ml pro Vertiefung), und Transfer zum Zellkulturbrutschrank. Neuron Formation als Monolayer wurde zwischen Tag 7 bis 8 (3C) beobachtet. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass diese Variante der Monoschichtdas Verfahren wird nicht vollständig mit Bezug auf das Überleben von Zellen und am meisten geeigneten Substrat optimiert.
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Representative Results
In unserem letzten Bericht im Einklang mit vielen anderen, konnte EBs aus hPSCs einfach durch Replattierung Aggregate auf Routine Aufspaltung hPSCs in Low-attachment Gerichte 10 erzeugt werden. Dies führt in der Regel eine breite Verteilung der resultierenden EB Größen (1C, oben). Ein weiteres Problem, das sich daraus ist, dass EBs in Suspension gehalten, um Aggregation neigen miteinander, was zu einem noch höheren Heterogenität EB Größen. Um diese Probleme zu umgehen, haben wir daher versucht, EBs durch Ausplattieren einzigen hPSCs in Low-attachment Vertiefungen multititre Platten (Abbildung 1A) zu generieren. Dies führte in keinem EB Bildung und Zelltod (Abbildung 1B, unten rechts). Anwenden eines bekannten Überleben Molekül für hPSCs gab Y-27632, zu ähnlichen Ergebnissen. Ebenso neigten Aufbringen Polyvinylalkohol (PVA), die zuvor gezeigt wurde, EB Bildung von HES 16 zu erhöhen, um "zu sammeln" die hPSCs am Boden des 96V-Wannen aber nicht auf EB-Bildung führen. Allerdings, wenn die Kombination von Y-27632 mit PVA Ergänzung, konnten wir ohne weiteres erzeugen EBs von Einzel-Zellsuspensionen hESCs unter chemisch definierten Bedingungen (Abbildung 1B). Günstigerweise könnte EB Größen in dieser multititre Plattenformat dicht durch Impfen einer unterschiedlichen Anzahl von Zellen pro Vertiefung gesteuert werden, im Gegensatz zur Verwendung von herkömmlichen Techniken (1C, unten).
Bei weiterer Inkubation der Platten 96V jedoch neigte die EBs, auf den Grund der Vertiefungen haften. Daher am Tag nach EB Bildung wurde es erforderlich, die EBs zu ultra-low attachment 96U Platten (Abbildung 1A) übertragen. Neuroektoderms wird dann in diesem Format unter Verwendung eines kleinen Moleküls Cocktail bestehend aus PD0325901 (FGF / ERK-Inhibitor), SB431542 (TGFβ/SMAD2 Inhibitor) induziert und Dorsomorphin (BMP/SMAD1 Inhibitor), wie beschrieben 10. Nach Neuroektoderms BildungVerwendung dieses kleine Molekül Cocktail kann die EBs aus ausplattiert werden, um die zu Neuronen auf einem beliebigen Format zu geben, vorausgesetzt, dass Oberflächen mit Matrigel beschichtet; (Abbildung 2). Durch die Initiierung EB Formation mit einer unterschiedlichen Anzahl von Zellen (1C, unten), fanden wir, dass EBs aus rund 8000 Zellen erzeugt neigen dazu, die besten neuronalen Differenzierung Kapazitäten ergeben. Dies wird durch ausgeprägte neuronalen Auswüchse von der plattierten EBs, reduziert nekrotischen EB Zentren nach dem Ausplattieren und hohe Expression von sensorischen und pan-neuronalen Marker wie BRN3A und β-Tubulin III (Fig. 2 und 3A, B) aufweist. Die Gesamtergebnisse neuronale Differenzierung Effizienzen zu sein scheinen vergleichbar mit der ursprünglichen Verfahrens (~ 70%) (Abb. 3), die die sowohl auf HES und hiPSCs 10 war. Wir haben bisher zwei unabhängige hES-Zelllinien, HuES6 und NCl3, in der Multiwell Verfahren eingesetzt während Zelllinie Variabilität in differentiation Wirkungsgrade können in der Regel nicht ausgeschlossen werden.
Mehrere Anwendungen HPSC abgeleiteten Neuronen benötigen Monoschichten von differenzierten Zellen anstelle von plated EBs. Wir haben daher auch untersucht, ob vermeintliche neuroektodermalen Zelle Kugeln an Tag 4 des Protokolls (Abbildung 2, Mitte) könnte dissoziiert in einzelne Zellen mit Accutase; um dann als Monolayer beschichtet werden. Tatsächlich Ausplattieren auf einzelne Zellen von Tag-4 neuroektodermalen Zellen ausgeprägt neuronale Differenzierung dieser Zellen wird wiederplattierte mit Wirkungsgraden von ca. 60% (3C) erhalten.
Abbildung 1. EB Bildung Verfahren. A) Schematische Darstellung des EB Bildung Verfahren. Einen Tag vor Beginn der differe ntiation (d-1) eine Suspension von HES mit mehreren tausend Zellen pro 100 ul in 96V Vertiefungen ausgesät, gefolgt von einer Zentrifugation. EBs gebildet Nacht werden dann in Ultra-Low-Anlage 96U Brunnen zur weiteren Behandlung übergeben. B) Prüfung der Auswirkungen von PVA und Y-27632 auf EB Bildung. EB Bildung konnte nur in Medium enthaltend sowohl PVA und Y-27632 (siehe Pfeilspitzen) beobachtet werden C). Oben: EBs durch herkömmliche Mittel gebildet sind in der Regel heterogen skalieren. Unten: EBs gebildet mit "Spin EB-Technik" in A. Durch die Verwendung einer unterschiedlichen Anzahl von Input-Zellen dargestellt, EB Größen können streng kontrolliert werden und waren sehr einheitlich. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
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Abbildung 2. Neuron Bildung Flussdiagramm. Einen Tag vor dem Beginn der Differenzierung (d-1), werden EBs in 96V Platten mit dem angegebenen EB Bildung Medium erzeugt. Nach der Übertragung des EBs in 96U Platten wird neuralen Induktion initiiert mit Differenzierungsmedium. 4 Tage später werden EBs in Matrigel-beschichteten Vertiefungen einer Multiwell gewünschte Format ausplattiert. Vertreter Morphologien sind für jeden Schritt gezeigt. Das Bild auf der rechten Seite zeigt typische neuronale Auswüchse aus beschichtetem EBs - die hohe Zelldichte Bereich auf dem Foto ganz rechts ist Teil des plated EB Zentrum, von dem die Neuronen dazu neigen zu wachsen in einer radialen Weise. Alternativ am Tag 4 kann EBs werden in einzelne Zellen dissoziiert und out für die terminale Differenzierung ausplattiert als Monoschichten (Text und 3C für Details). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 3. Charakterisierung von Neuronen. A) Real-time RT-PCR Charakterisierung von Tag 8 bulk neuronalen Kulturen. Beachten Sie, dass in differenzierten Proben Neuralleiste und pan-neuronalen Marker-Gene stark hochreguliert zu undifferenzierten Kontrollzellen verglichen. Obwohl Proben mit 16.000 Zellen initiiert zeigten die höchsten neuronale Expression (man beachte die logarithmische Skalierung), EBs zwischen 4.000 bis 8.000 Zellen als außerordentlich nützlich erwiesen anhand morphologischer Kriterien. B) Die meisten wachsenden Zellen aus dem plattierten EBs sind Neuronen Färbung für positive beta- III Tubulin (rot) und der sensorischen Neuronenmarker BRN3A (grün). C) Neuronen nach einzelnen Zelle plating statt Ausplattieren EBs gebildet. Am Tag 4 des Protokolls (Abbildung 2), Schwammen EBs dissoziiert mit Accutase und als einzelne Zellen ausgesät, um dann unheilbar als Monoschichten unterscheiden. Wie auf der linken Seite angezeigt, wurden die Zellen mit typischen neuronale Morphologie, dass positiv für beta-III Tubulin gefärbt leicht erhalten, während das Überleben der Zelle zu sein schien etwas verringert im Vergleich zu EB-Beschichtung. Rechts: Immunzytochemie-basierte Quantifizierung der neuronalen Ausbeute (n = 3 repräsentativen Abschnitten analysiert + / - SD). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
| Namen Gens | Fwd Primersequenz | Rev Primersequenz |
| ACTB (Housekeeping-Gen) | TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG | ACATCTGCTGGAAGGTGGACA |
| RPL37A (Housekeeping-Gen) | GTGGTTCCTGCATGAAGACAGTG | TTCTGATGGCGGACTTTACCG |
| DCX | AGGGCTTTCTTGGGTCAGAGG | GCTGCGAATCTTCAGCACTCA |
| ISL1 | TTTATTGTCGGAAGACTTGCCACTT | TCAAAGACCACCGTACAACCTTTATCT |
| MAPT | TTACCCTGGGCACTGGCCTA | TCCTGCTCAACATGGCAAACTC |
| NEUROD1 | GACTGATTGCACCAGCCCTTC | CGGACGGTTCGTGTTTGAAAG |
| Neurog1 | CAGAGACAAGGAGTGGGCTTCA | CTCCAGCCCTGTGCCTGAAT |
| SOX10 | TCCTTGCCAGCTCCCTCTTC | CAAGGGTTAGGGCCTGAGCA |
| SYT4 | GCCAATCTCACCACCCAAATG | CACACACCATGCTTCCTTCCA |
Tabelle 2. Primer für RT-qPCR eingesetzt.
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Discussion
Die meisten Differenzierungsprotokolle mit EB-Bildung aus hPSCs, einschließlich unserer bereits veröffentlichten Verfahren 10, auf manuelle oder Enzym-gestützte Ernte hESCs als Aggregate, was unweigerlich zu Heterogenität in EB Größen basieren. Diese Tatsache führt zu Schwankungen in der Differenzierung Effizienz mit einigen Zelllinien, wodurch systematische Untersuchungen schwierig, insbesondere bei einem mittleren Durchsatz Maßstab. Darüber hinaus ist die manuelle Dissektion arbeitsintensive die selbst kompromittiert Skalierbarkeit.
Im Gegensatz dazu ist das hier beschriebene Verfahren auf EB Bildung von einzelnen Zellen, die Zellenhandhabungseinheit und minimiert Variabilität zwischen Proben erleichtert basiert. Wichtig ist, dass wir zeigen, dass insgesamt Differenzierungsfähigkeit in Neuronen scheint nicht durch die Initiierung des Protokolls mit Spin EBs betroffen sein. Ferner halten die einzelnen EBs voneinander mittels Verwendung von 96-Well-Platten getrennt Suspension verhindert tSaum aus Aggregieren miteinander in Suspension - die noch einen weiteren Nachteil des herkömmlichen Verfahrens 10 präsentiert. Als Ergebnis ist die Menge des Eingangs hPSCs erforderlich, um ein bestimmtes Experiment einzuleiten, daß etwa eine Vertiefung der Platte mit 6 Vertiefungen mit subkonfluente HPSC Kolonien ist in der Regel ausreichend, um die Differenzierung in zwei 96-Well-Platten zu initiieren niedrig. Schließlich ermöglicht das Spin EB-Technik strenge Kontrolle über EB Größen. Nach unseren Beobachtungen, neigen die Expressionsniveaus von neuronalen Marker in gewissem Maße mit zunehmender Größe der plattierten EBs (3A) zu erhöhen. Andererseits neigen zu groß, um nekrotische Zentren EBs nach dem Ausplattieren anzuzeigen. Daher als Kompromiss, fanden wir EBs von 4.000 bis 8.000 Zellen ein geeigneter Bereich sein.
Aufgrund seiner hohen Leistungsfähigkeit, Einfachheit, Schnelligkeit und Kosteneffizienz wir das beschriebene Verfahren, um eine nützliche Plattform für funktionelle Studien werden antizipieren, krankheits-Modellierung erfordern menschlichen sensory Neuronen oder mittlerem Durchsatz zellbasierten Assays erfordern pharmakologische Neuronen beliebigen Typs. Bezüglich der letzteren Anwendung würden Kompatibilität mit automatisierten Analyse wie High-Content-Imaging wünschenswert. Dies kann jedoch durch die Tatsache, dass nur auswachsenden Neuronen in der Peripherie des plattierten EBs analysiert werden könnte beeinträchtigt werden. Um dieses Hindernis zu umgehen, haben wir auch versucht, Monoschichten von Neuronen durch Dissoziation EBs an Tag 4 des Protokolls und Ausplattieren Einzelzellen generieren. Tatsächlich weisen die Daten in 3C dass Neuronen zu vernünftigen Wirkungsgrad von etwa 60% gebildet. Wir beobachteten jedoch eine Abnahme Zellüberleben unter diesen Bedingungen, was nahe legt, dass diese Variation des Protokolls kann weiter untersucht und optimiert werden, beispielsweise durch Verwendung eines anderen Befestigung Substrat. (Die Zugabe von Y-27632 auf Ausplattieren der Tag-4-Zellen in Schritt 5,2 getan fördern das Überleben der Zelle nach der Beschichtung, aber es schien auch w störeni-ten nachfolgenden neuronale Differenzierung und daher weggelassen werden.) Darüber hinaus wird es auch interessant sein, zu untersuchen, ob andere Arten von Neuronen mit dieser Plattform erzeugt werden könnte, indem die Zusammensetzung des Mediums in der zweiten Stufe des Protokolls. Zudem in Bezug auf die Übertragung der EBs aus 96V in 96U-förmige Vertiefungen an Tag 0, wäre es wünschenswert, ein Verfahren auf Mehrkanalpipetten konzipiert werden, um letztlich zu erreichen Hochdurchsatz-Kompatibilität des beschriebenen Verfahrens.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
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