Summary
Protocollen voor neuronale differentiatie van pluripotente menselijke stamcellen (hPSCs) vaak tijdrovend en vereisen grote celkweek vaardigheden. Hier hebben we een kleine molecule aangepast gebaseerde differentiatie procedure een multititre plaat formaat, zodat eenvoudige, snelle en efficiënte productie van humane neuronen in een gecontroleerde manier.
Abstract
Bestaande protocollen voor het genereren van neuronen uit humane pluripotente stamcellen (hPSCs) zijn vaak vervelend omdat ze meerstaps procedures waarbij de isolatie en expansie van neurale voorlopercellen, voorafgaand aan terminale differentiatie. In vergelijking met deze tijdrovende aanpak, hebben we onlangs ontdekt dat gecombineerde remming van drie signaleringsroutes, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, en FGF / ERK, een snelle inductie van neuroectoderm bevordert van hPSCs, gevolgd door onmiddellijke differentiatie in functionele neuronen. Hier hebben we aangepast onze procedure om een nieuwe multititre plaat formaat, verder zijn reproduceerbaarheid en compatibel te maken met mid-throughput toepassingen. Het omvat vier dagen neuroectoderm vorming in drijvende bollen (embryoid organen), gevolgd door nog eens vier dagen differentiatie tot neuronen onder hechtende omstandigheden. De meeste cellen verkregen met dit protocol lijken bipolaire sensorische neuronen. Bovendiende procedure is zeer efficiënt, geen bijzondere vakkennis, en is gebaseerd op een eenvoudig chemisch gedefinieerd medium met rendabele kleine moleculen. Door deze maatregelen kan de regeling dienen als een nuttig platform voor verder functioneel onderzoek en voor celgebaseerde screening benadert waarbij menselijke sensorische neuronen of neuronen van elk type.
Introduction
hPSCs, omvattende embryo-verkregen embryonale stamcellen (hESC ') en geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), pluripotent zijn betekent dat zij aanleiding geven tot verschillende cellijnen in vitro 1-2. Tal van gedifferentieerde celtypes zijn afgeleid van hESC 's tot nu toe, het ondersteunen van het idee dat deze cellen waardevolle instrumenten voor wetenschappelijk onderzoek en cel-gebaseerde screeningsmethoden te presenteren, en veelbelovend voor cel-gebaseerde therapieën.
Neuronale differentiatie protocollen voor hESC 'zijn meestal complex en tijdrovend omdat ze vaak gebaseerd op de eerste inducerende algemene neurale lot, gevolgd door manuele isolatie van neurale stamcellen en daaropvolgende terminale differentiatie in een bepaalde soort neuron plaats 3-6. In sommige opzicht deze complexiteit is het niet verwonderlijk en onvermijdelijk gezien het feit dat een dergelijke state-of-the-art gerichte differentiatie protocollen hebben de neiging om stapsgewijs na te bootsen de vroege ontwikkeling van de mens, which is op zichzelf zeer complex. Anderzijds kan het voor een deel ook tijdens ons gebrek aan begrip van de onderliggende moleculaire processen, waardoor differentiatie protocollen die nog verre van volledig geoptimaliseerd.
Met betrekking tot de omzetting van ongedifferentieerde hPSCs in neuroectoderm, Pera et al.. vond dat onderdrukking van BMP / SMAD1/5/8 signalering neurale inductie van hESC 's 7 verbetert. Bovendien heeft inactivering van Smad2 / 3 signalering is aangetoond neuroectoderm vorming 8 bevorderen. Dienovereenkomstig, in combinatie inactivatie van deze twee wegen heeft de neiging te leiden tot een efficiëntere neurale inductie van hPSCs 4,9. Meer recent hebben wij aangetoond dat een derde signaalweg, FGF / ERK, dient als een sterke repressor van de eerste stappen van neuroectodermale inzet in hESC '. Omgekeerd gelijktijdige repressie van deze drie routes tot bijna homogene omzetting van hESC 'in neuroectoderm metin slechts vier dagen 10. Vervolgens werd zeer efficiënte terminale differentiatie in functionele neuronen waargenomen binnen acht dagen. De verkregen neuronen waarschijnlijk sensorische neuronen van het perifere zenuwstelsel, die gedeeltelijk verklaren hun snelle afleiding 10. Defecten in sensorische neuron onderhoud wordt beschouwd als een oorzaak van bepaalde menselijke aandoeningen zoals familiaire dysautonomia 11. Voor het modelleren van dergelijke ziekten gebaseerd op technologie hiPSC 12 voor meer functionele karakterisering, en voor toegepaste doeleinden zonder eigen een bepaald type van neuronen kan deze differentiatie procedure vormen een nuttige basis.
Echter, de differentiatie strategie die we oorspronkelijk betrokken vorming van embryonale organen (EBS) in dienst van de massa's van hESC kolonies 10, en dit resulteerde in een flink mate van heterogeniteit ten aanzien van EB maten, en verscheen ook tot neuron vorming efficiëntie compromissen in sommige cell lijnen. Bovendien, vanwege de heterogeniteit in afmetingen EB het vermogen om systematisch effect van extra groeifactoren of kleine moleculen tijdens en na testen neuron formatie enigszins worden verward.
In dit verslag wordt aangepast onze vorige procedure om een middelgrote doorvoer compatibel, gedwongen aggregatie gebaseerde techniek aan EBS genereren in een zeer gecontroleerde manier grootte, zoals ook in andere contexten 13. Vervolgens EBS gegenereerd in V-vormige putjes van platen met 96 putjes werden overgebracht naar U-vormige ultra-laag attachment platen met 96 putjes, tot neuroectoderm vorming in suspensie te leiden. Vier dagen later kan de EBS worden uitgeplaat die tot terminaal gedifferentieerde neuronen bij hoge efficiency en homogeniteit. Alternatief dagen EB-4 werden gedissocieerd in enkele cellen en uitgeplaat als zodanig, waardoor lage dichtheid monolagen van menselijke neuronen. Consistente resultaten werden tot nu toe verkregen met twee onafhankelijk dedan eindelijk zover hESC lijnen, HuES6 en NCL3.
Als een voorwaarde, succesvolle EB formatie was strikt afhankelijk van het gebruik van een synthetisch polymeer, polyvinylalcohol (PVA), samen met ROCK remmer Y-27632 bekend dat hESC overleven 13 tot 14 te bevorderen. Dientengevolge homogeniteit van de EBS gevormd in 96-V-platen werd aanzienlijk verbeterd in vergelijking met vorming van EBS als massa kweken gebaseerd op willekeurige splitsing technieken. Dit systeem verschaft dus een sterk verbeterd platform voor neuroectoderm vorming in suspensiekweek, gevolgd door zeer gecontroleerde vorming onder neuron hechtende omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van Matrigel beklede platen en Media
- Bereiding van Matrigel beklede platen Matrigel is gevonden een voorkeurssubstraat voor het bevestigen differentiëren EVSA zijn en ook stimuleert een efficiënte uitgroei van neuronen van de 10.
- Thaw 10 ml Matrigel 's nachts op het ijs.
- Volgende dag verdunnen geleiachtige Matrigel met twee volumes ijskoude DMEM/F-12 en aliquots van 1 ml in 15 ml voorgekoelde conische buizen die kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C.
- Beslissen over een plaat formaat voor neuronale differentiatie. Bijvoorbeeld, als uitgangspunt, raden wij een eerste ronde van differentiatie in een 12-well formaat uitvoeren. Pre-cool vier 12-well platen bij 4 ° C. Los een aliquot van bevroren Matrigel door toevoeging van 9 ml voorgekoeld DMEM/F-12 gevolgd door op en neer pipetteren totdat alle voorverdunde Matrigel is ontdooid en opgelost.
- Dan, Breng de inhoud in een nieuwe 50 ml buis met 15 ml DMEM/F-12 op ijs (laatste Matrigel verdunning: 1:75). Vervolgens voegt 0,5 ml verdund Matrigel aan elk putje van de voorgekoelde 12-well platen. Wikkel platen met Parafilm en laat bij kamertemperatuur gedurende de nacht.
- Volgende dag overdrachtsplaten tot 4 ° C. Beklede platen kunnen worden opgeslagen voor meerdere weken vóór gebruik.
- Media
EB vorming medium (~ 15 ml nodig om differentiatie te voeren in een 96-well plaat - Tabel 1 en schema in Figuur 2 te zien):
DMEM/F-12 met 0,4% (PVA)
1x N2
1x B27
0,05% BSA
20 ng / ml FGF2
10 pM Y-27632
1x PenStrepGln
Differentiatiemedium (~ 30 ml nodig om differentiatie te voeren in een 96-well plaat, gevolgd door vorming neuron in een Matrigel gecoate 12-well plaat, zie tabel 1):
DMEM/F-12
1x N2
0,05% BSA
0,5 uM PD0325901
15 uM SB431542
0,5 uM Dorsomorphin
1x PenStrepGln
2. Gedwongen EB Vorming
- Grow hPSCs onder uw favoriete feeder-vrije omstandigheden. Wij gebruiken MEF-geconditioneerd medium op Matrigel beklede 6-well platen 15. Echter, ook andere kweeksystemen zoals zelfgemaakte of commerciële gedefinieerde media werken ook. Op het moment van het starten van een experiment differentiatie moet worden hPSCs sub-confluente en actief groeiende.
- Mechanisch verwijderen spontaan onderscheiden kolonies met behulp van een steriele plastic pipetpunt onder een stereomicroscoop.
- Was de resterende ongedifferentieerde kolonies met behulp van PBS, en verteren om enkele cellen met behulp van Accutase met 1X Y-27632. Pellet enkele cellen door centrifugatie bij 200 xg gedurende 2 min, resuspendeer in een klein volume medium en EB vorming bepalen cel titer met een hematocytometer.
- Voeg een hoeveelheid van cellende resterende EB vorming medium leiden tot een titer tussen 40.000 en 80.000 cellen per ml.
- Met een meerkanaalspipet pipet 100 ul per putje van een 96 V-bodemplaat, waardoor 4.000 tot 8.000 cellen per putje. Spin 96-well plaat in een uitklapbare plaat centrifuge bij 400 xg gedurende 1 min aan cellen op de bodem van de wells verzamelen en overbrengen in celkweek incubator. EBS zal nachts vormen, zoals getoond in figuur 1.
3. Neuroectoderm Inductie
- Volgende dag (dag 0), verzamelen van 96V EVSA plaat onder een stereomicroscoop en overdracht in een klein volume in een 3,5 cm bacteriële schaaltje met 2 ml differentiatiemedium. Schud voorzichtig de schotel enkele seconden ingedrukt om de EVSA's te wassen.
- Voeg 100 ul differentiatiemedium per putje van een ultra-laag-attachment U-bodem 96-well plaat. Onder een stereomicroscoop, overdracht EVSA's in kleine volumes van de was-schaal in de 96U-putten (een EB per well). Plaats 96U plaat in celcultuur incubator voor 4 dagen naar neuroectoderm vorming mogelijk te maken.
4. Neuron Vorming
- Op dag 4, bereidt een wasmachine schotel als in stap 3.1 en bovendien DMEM/F-12 vervangen in een voorverwarmde Matrigel gecoate 12-well plaat door differentiatie medium (1 ml per well).
- Plating van EBS
- Verzamel EVSA's van 96U plaat, was deze zoals hierboven, en zorgvuldig zaad ze een voor een in putjes van de Matrigel-gecoate 12-well plaat (ongeveer 8 EVSA's per well): EBS moeten gelijkelijk worden verdeeld binnen de putten om ongestoord uitgroei van maken neuronen in de komende dagen (zie "dag 5" beeld in figuur 2).
- Voor overdracht van de 12-well plaat terug in de incubator, laat EBS losjes hechten ongeveer 10 min bij RT. Dan, voorzichtig overbrengen 12-well plaat om celkweek incubator. Neuronen zal groeien van de geïllustreerde EVSA in een radiale wijze binnen de komende 4 dagen, als shown in Figuur 2 ("dag 8" beeld rechts).
5. Neuron Formation als monolagen
- Als alternatief voor de stappen van punt 4), op dag 4 van de procedure, EBS verzamelen in een 3,5 cm bacteriële schaaltje met 2 ml differentiatiemedium, vervolgens overbrengen EBS in een klein volume op een PBS-bevattende schaal en in een ander gerecht met Accutase.
- Laat verteren enkele cellen, centrifuge bij 200 xg gedurende 2 min, resuspendeer in een klein volume differentiatiemedium en bepalen cel titer met een hematocytometer. Stel titer naar 1-2X10 6 cellen per ml met behulp van differentiatie medium (zonder Y-27632).
- Cellaag in voorverwarmde Matrigel gecoate 12-well plaat (1 ml per well), en breng celkweek incubator. Neuron vorming als monolagen waargenomen tussen dag 7 tot 8 (figuur 3C). Er zij opgemerkt dat deze monolaag variant vande procedure niet volledig geoptimaliseerd met betrekking tot celoverleving en meest geschikte substraat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In ons vorige rapport, in lijn met vele anderen, kon EVSA's van hPSCs eenvoudig worden gegenereerd door replating aggregaten op routine splitsing van hPSCs in lage-gehechtheid gerechten 10. Dit resulteert meestal in een brede verspreiding van de resulterende EB maten (Figuur 1C, boven). Een ander probleem in verband is dat EBS gesuspendeerd blijven neiging te aggregeren met elkaar, wat leidt tot een nog grotere heterogeniteit van EB afmetingen. Om deze problemen te omzeilen, hebben we dan ook geprobeerd om EVSA's te genereren door plateren enkele hPSCs in lage-bevestiging putten van multititre platen (Figuur 1A). Dit resulteerde in geen EB vorming en celdood (fig. 1B, rechtsonder). Toepassing van een bekende survival molecuul voor hPSCs, Y-27632, leverde vergelijkbare resultaten op. Ook toepassing van polyvinyl alcohol (PVA) dat eerder is aangetoond dat EB vorming van hESC '16 verbeteren, doorgaans "verzamelen" de hPSCs onderaan de 96V-Putten, maar leidde niet tot EB formatie. Echter, als Y-27632 combinatie met PVA suppletie konden we gemakkelijk EB genereren van eencellige suspensies van hESC 'onder chemisch gedefinieerde omstandigheden (figuur 1B). Gunstig kunnen EB afmetingen in deze multititre plaatformaat gehouden te worden door enten verschillende aantallen cellen per well, in tegenstelling tot gebruikelijke technieken (figuur 1C, onder).
Bij verdere incubatie in de 96V platen echter de EBS neiging om aan de bodem van de wells. Daarom, op de dag na de EB formatie, was het nodig om de EBS over te dragen aan ultra-lage bevestiging 96U platen (Figuur 1A). Neuroectoderm wordt vervolgens geïnduceerd in dit formaat met een kleine molecule cocktail bestaande uit PD0325901 (FGF / ERK inhibitor), SB431542 (TGFβ/SMAD2 inhibitor) en dorsomorphin (BMP/SMAD1 inhibitor), zoals 10. Na neuroectoderm vormingMet deze kleine molecule cocktail kan de EBS worden uitgeplaat aanleiding geven tot neuronen op een format, mits een oppervlak van Matrigel '(figuur 2). Door het initiëren EB formatie met verschillende aantallen cellen (figuur 1C, onder), vonden we dat EBS gegenereerd bij 8000 cellen vaak de beste neuronale differentiatie capaciteit opleveren. Dit wordt gekenmerkt door geprononceerde neuronale uitwassen van de geïllustreerde EBS verminderd necrotische centra EB na het uitplaten en hoge expressie van zintuiglijke en pan-neuronale markers zoals BRN3A en β-tubuline III (figuren 2 en 3A, B). De totale efficiëntie neuronale differentiatie lijken vergelijkbaar met de oorspronkelijke procedure (~ 70%) (figuur 3), die van toepassing was zowel hESC 'en hiPSCs 10. We hebben tot nu toe in dienst twee onafhankelijke hESC lijnen, HuES6 en NCL3, in de multi-procedure, terwijl cellijn-afhankelijke variabiliteit in differentiation efficiëntie kan over het algemeen niet worden uitgesloten.
Verschillende toepassingen van HPSC afgeleide neuronen vergt monolagen van gedifferentieerde cellen in plaats van verzinkt EVSA's. We hebben daarom ook onderzocht of vermeende neuro-ectodermale cellen bollen op dag 4 van het protocol (figuur 2, midden) kan worden gescheiden in afzonderlijke cellen met behulp van Accutase, om vervolgens te worden uitgeplaat als monolagen. Inderdaad, na uitplaten afzonderlijke cellen van dag-4 neuroectodermale cellen uitgesproken neuronale differentiatie van deze cellen opnieuw uitgeplaat verkregen in efficiëntie van ongeveer 60% (Figuur 3C).
Figuur 1. EB formatie procedure. A) Schematische voorstelling van de EB formatie procedure. Een dag voor aanvang van de differe ntiation (d-1), een suspensie van hESC 'met enkele duizenden cellen per 100 ui wordt geënt in wells 96V, gevolgd door centrifugatie. EVSA gevormd nacht worden vervolgens overgebracht in ultra-laag bevestiging 96U putjes voor verdere behandeling. B) testen van de effecten van PVA en Y-27632 on EB vorming. EB vorming kon slechts worden waargenomen in medium dat zowel PVA en Y-27632 (zie pijlpunt) C) Top:. EB gevormd door gebruikelijke middelen meestal heterogeen in grootte. Onder: EVSA gevormd met "spin EB" techniek afgebeeld in A. Door het gebruik van verschillende aantallen invoercellen, EB maten streng gecontroleerd worden en waren zeer uniform. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
35fig2highres.jpg "/>
Figuur 2. Neuron vorming stroomschema. Een dag voor het begin van differentiatie (d-1), worden gegenereerd in EB 96V platen gebruikmakend van de aangegeven EB vorming medium. Bij overdracht van de EBS in 96U platen, wordt neurale inductie gestart met behulp van differentiatie medium. 4 dagen later worden EB uitgeplaat in Matrigel beklede putjes van een gewenst multiwell format. Representatieve morfologieën worden voor elke stap. De foto rechts toont typische neuronale uitwassen van vergulde EVSA's - de hoge celdichtheid gebied op de uiterst rechts is een deel van de vergulde EB centrum van waaruit de neuronen hebben de neiging om uit te groeien in een radiale manier. U kunt ook op dag 4, kan EVSA's worden losgekoppeld in enkele cellen en uitgeplaat voor terminale differentiatie als monolagen (tekst en afbeelding 3C voor details). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Karakterisering van neuronen. A) Real-time RT-PCR karakterisering van dag 8 bulk neuronale culturen. Merk op dat in gesplitste monsters neurale en pan-neuronale marker genen sterk opgereguleerd in vergelijking met ongedifferentieerde controle cellen. Hoewel monsters gestart met 16.000 cellen vertoonden de hoogste neuronale expressie niveaus (let op de logaritmische schaal), EVSA's tussen de 4.000 tot 8.000 cellen bleken zeer nuttig op basis van morfologische criteria. B) De meeste cellen uit de vergulde EVSA groeiende zijn neuronen kleuring positief voor bèta- III Tubuline (rood) en de sensorische neuron marker BRN3A (groen). C) Neuronen gevormd na enkele cel plating in plaats van plateren EVSA's. Op dag 4 van het protocol (figuur 2), Drijvende EVSA's waren gescheiden met behulp van Accutase en gezaaid uit als enkele cellen om dan terminaal differentiëren als monolagen. Zoals links, werden cellen met een karakteristieke neuronale morfologie die positief gekleurd voor beta-tubuline III gemakkelijk verkregen, terwijl celoverleving bleken enigszins verlaagd zijn in vergelijking met EB plating. Rechts: Immunocytochemie gebaseerde kwantificatie van neuronale opbrengst (n = 3 representatieve secties geanalyseerd + / - SD). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
| Naam van gen | Fwd primersequentie | Rev primersequentie |
| ACTB (schoonmaak-gen) | TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG | ACATCTGCTGGAAGGTGGACA |
| RPL37A (schoonmaak-gen) | GTGGTTCCTGCATGAAGACAGTG | TTCTGATGGCGGACTTTACCG |
| DCX | AGGGCTTTCTTGGGTCAGAGG | GCTGCGAATCTTCAGCACTCA |
| ISL1 | TTTATTGTCGGAAGACTTGCCACTT | TCAAAGACCACCGTACAACCTTTATCT |
| MAPT | TTACCCTGGGCACTGGCCTA | TCCTGCTCAACATGGCAAACTC |
| NEUROD1 | GACTGATTGCACCAGCCCTTC | CGGACGGTTCGTGTTTGAAAG |
| NEUROG1 | CAGAGACAAGGAGTGGGCTTCA | CTCCAGCCCTGTGCCTGAAT |
| SOX10 | TCCTTGCCAGCTCCCTCTTC | CAAGGGTTAGGGCCTGAGCA |
| SYT4 | GCCAATCTCACCACCCAAATG | CACACACCATGCTTCCTTCCA |
Tabel 2. Primers gebruikt voor RT-qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meeste protocollen betreffende differentiatie EB vorming van hPSCs, waaronder onze eerder gepubliceerde procedure 10, gebaseerd op handmatige of enzym-assisted oogsten van hESC 'als aggregaten, die onvermijdelijk leidt heterogeniteit in afmetingen EB. Dit feit leidt tot variabiliteit in differentiatie efficiëntie sommige cellijnen, waardoor een systematische analyses moeilijk, vooral op een gemiddelde doorvoer schaal. Bovendien handmatige dissectie arbeidsintensief dat zelf compromitteert schaalbaarheid.
Daarentegen wordt beschreven methode gebaseerd op EB vorming van enkelvoudige cellen, welke cel behandeling en minimaliseert de variabiliteit tussen monsters vergemakkelijkt. Belangrijk is dat we laten zien dat de totale differentiatie capaciteit in neuronen niet lijkt te worden beïnvloed door het initiëren van het protocol met spin EVSA's. Bovendien houden de individuele EB van elkaar gescheiden door middel van het gebruik van 96-well ophangplaten voorkomt tboord van de samenvoeging met elkaar in suspensie - die nog een ander nadeel van de conventionele procedure 10 presenteert. Daardoor de hoeveelheid invoer hPSCs om een bepaald experiment starten is laag in dat ongeveer een putje van 6-well plaat met subconfluente HPSC kolonies meestal voldoende om differentiatie te leiden in twee 96-well platen. Ten slotte is de spin EB techniek maakt strakke controle over EB maten. Volgens onze waarnemingen, het expressieniveau van neuronale markers meestal enigszins toenemen met toenemende maten plated EBS (Figuur 3A). Anderzijds, te groot EB vaak necrotische centra weergegeven na plating. Dus als compromis we EVSA van 4.000 tot 8.000 cellen een geschikte bereik.
Door zijn hoge efficiëntie, eenvoud, snelheid en kosteneffectiviteit, verwachten we de beschreven methode om een nuttig platform voor functionele studies zijn, ziekte-modellen die de menselijke sensory neuronen of middelgrote doorvoer cel-gebaseerde testen die farmacologische neuronen van elk type. Wat de laatste toepassing zou compatibiliteit met geautomatiseerde analyse zoals high-content imaging wenselijk. Deze kan echter worden belemmerd door het feit dat slechts ontgroeien neuronen in de omtrek van de geplateerde EB geanalyseerd worden. Om dit obstakel te omzeilen, hebben we ook geprobeerd om monolagen van neuronen genereren door dissociëren EVSA's op dag 4 van het protocol en plating uit enkele cellen. Inderdaad, de gegevens in Figuur 3C suggereren dat neuronen gevormd redelijk rendement van ongeveer 60%. Echter zagen we een verlaging in celoverleving onder deze omstandigheden, wat suggereert dat deze variant van het protocol kan verder worden onderzocht en geoptimaliseerd, bijvoorbeeld met een andere bevestiging substraat. (De toevoeging van Y-27632 uitplaten op de dag-4 cellen in stap 5.2 gedaan via celoverleving na uitplaten maar ook bleek w interferereni daaropvolgende neuronale differentiatie en derhalve worden weggelaten. Bovendien), zal het interessant om te onderzoeken of andere typen neuronen kunnen worden gegenereerd met dit platform, door het variëren van de samenstelling medium in de tweede fase van het protocol. Bovendien, met betrekking tot de overdracht van de EBS van 96V naar 96U-vormige putjes op dag 0, zou het wenselijk zijn om een procedure gebaseerd op meerkanaals pipetteren ontwikkelen, om uiteindelijk high-throughput verenigbaarheid van de beschreven werkwijze.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door het Max Planck Instituut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
- Pera, M. F., et al. Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin. J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity. Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).
- Greber, B., et al. FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells. EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).
- Anderson, S. L., et al. Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene. Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
