Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الشيتوزان / التدخل RNA الجسيمات النانوية وساطة جين إسكات في الأمراض ناقل يرقات البعوض

Published: March 25, 2015 doi: 10.3791/52523
Automatic Translation
*1, *2,3, 3,4, 1, 3,4, 5, 2,3,4
1Division of Biology, Kansas State University, 2Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, 3Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame, 4Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 5Department of Entomology, Kansas State University
* These authors contributed equally

Summary

نحن هنا وصف الإجراء لتثبيط وظيفة الجينات في البعوض ناقلات الأمراض من خلال استخدام الشيتوزان / التدخل النانوية RNA التي يتم تناولها من قبل يرقات.

Abstract

البعوض الحامل للمرض إلحاق المزيد من المعاناة البشرية من أي كائن حي آخر - وتقتل أكثر من مليون شخص كل عام. مشاريع الجينوم البعوض سهلت البحث في جوانب جديدة من البعوض البيولوجيا، بما في ذلك الدراسات الجينية وظيفية في الابتدائي متجه الأفارقة الملاريا الأنوفيلة الغامبية وحمى الضنك والحمى الصفراء ناقلات الزاعجة المصرية. وقد استخدم RNA interference- (RNAi-) بوساطة إسكات الجينات لاستهداف الجينات في المصالح في كل من هذه الأنواع من البعوض ناقلات الأمراض. هنا، نحن تصف الإجراء لإعداد الشيتوزان / التدخل النانوية RNA التي يتم جنبا إلى جنب مع المواد الغذائية وتناولها من قبل يرقات. هذا واضحة من الناحية الفنية، الإنتاجية العالية، ومنهجية غير مكلفة نسبيا، والذي يتوافق مع طويلة RNA المزدوج تقطعت بهم السبل (الرنا المزدوج الجديلة) أو التدخل RNA (سيرنا) جزيئات صغيرة، وقد استخدمت لضربة قاضية ناجحة لعدد من الجينات المختلفة في A. الغامبية وA. الزاعجة المصريةاليرقات. وبعد الوجبات اليرقات، ضربة قاضية، والتي يتم التحقق منها من خلال QRT-PCR أو التهجين في الموقع، يمكن أن تستمر على الأقل خلال مرحلة العذراء في وقت متأخر. قد تكون هذه المنهجية تنطبق على مجموعة متنوعة واسعة من البعوض والحشرات الأخرى، بما في ذلك الآفات الزراعية، وكذلك الكائنات غير نموذج الأخرى. وبالإضافة إلى فائدتها في مختبر أبحاث، في المستقبل، الشيتوزان، وهو بوليمر غير مكلفة، وغير سامة وقابلة للتحلل، يحتمل أن تستخدم في هذا المجال.

Introduction

البعوض التغذية ناقلات دماء أنوفيلي وAedine أجناس تنقل العوامل المسببة للمرض مسؤولة عن العديد من أسوأ الآفات البشرية. ما يقدر بنحو 3.4 مليار شخص معرضون لخطر الإصابة بالملاريا ل، وهو المسؤول عن أكثر من نصف مليون حالة وفاة سنويا في جميع أنحاء العالم. النتائج الملاريا من العدوى عن طريق المتصورة ليرة سورية. الطفيليات، والتي تنتقل إلى البشر من خلال لدغات البعوض الحامل للجنس الأنوفيليس، بما في ذلك ناقلات الأفارقة الرئيسي الأنوفيلة الغامبية ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ ، 2014) 1. الزاعجة المصرية هي البعوض الناقل الرئيسي لفيروس حمى الضنك، والذي يسبب حمى الضنك، وهو مرض حموي غير محدد وهذا هو المرض الأكثر انتشارا والفيروسة المنقولة بالمفصليات كبير في العالم. فيروس حمى الضنك في الوقت الحاضر تهديدا لل> 2.5 مليار شخص في المناطق المدارية، مع inciden سنويم ما يقرب من 50 مليون الحالات مما أدى إلى ~ 24،000 حالة وفاة سنويا ( http://www.cdc.gov/dengue/ ، 2014) 2. وعلى الرغم من تأثير عالمي مدمر من الأمراض التي تنتقل عن طريق البعوض على صحة الإنسان، وسيلة فعالة لمنع وعلاج هذه الأمراض تنعدم. مكافحة البعوض هي حاليا أفضل طريقة للوقاية من الأمراض.

وقد تم الاعتراف الإمكانات لمكافحة الأمراض المنقولة المفصلية التي كتبها التلاعب الجيني للالحشرات ناقلات لأكثر من أربعة عقود 3. سلالات معدلة وراثيا من A. بعوض هندستها لديك امرأة معينة كظوم يطير النمط الظاهري جعلت مؤخرا إمكانية استخدام استراتيجيات المعدلة وراثيا لمكافحة ناقلات الأمراض واقعا 4-6. وقد تحدت هذه التطورات الباحثين من تحديد الأهداف وراثية جديدة لمكافحة النواقل وسائل إضافية من التلاعب وظيفة الجين في البعوض الناقل للمرض. تحوير التعبير الجيني دتنمية خلال شهر، كما كان الحال في البعوض الأنثى يطير 4، قد تعزز توضيح استراتيجيات جديدة لمكافحة ناقلات الأمراض. ومع ذلك، إلى حد كبير بسبب التحديات التقنية، تم التعرف على وظائف عدد قليل جدا من الجينات خلال تطوير A. الغامبية، A. بعوض، أو الأنواع الأخرى من البعوض.

منذ اكتشافه في C. ايليجانس 7، والتدخل RNA (رني)، والتي يتم حفظها في الحيوانات والنباتات، والكائنات الدقيقة، وقد استخدمت على نطاق واسع للدراسات وراثية وظيفية في مجموعة متنوعة واسعة من الكائنات الحية، بما في ذلك الحشرات 8،9. يبدأ مسار رني التي كتبها المقامر الذي يشق طويلة الرنا المزدوج الجديلة في 20-25 الرناوات siRNAs طويلة النوكليوتيدات القصيرة التي تعمل بوصفها تسلسل محدد التدخل RNA. الجينات الصمت الرناوات siRNAs التي هي مكملة في تسلسل من خلال تعزيز دوران النص، انشقاق، وتعطيل الترجمة 9. جزيئات الرنا المزدوج الجديلة طويلة (عادة 300-600 بي بي) أو العرف الرناوات siRNAs استهداف particulaتسلسل ص يمكن استخدامها في مختبر أبحاث لإسكات أي الجينات في المصالح. من خلال إدارة التدخل عندما يتم تسليم RNA، يمكن للباحثين التحكم في الوقت الذي الجينات إسكات يبادر. هذه الميزة مفيدة لأنها يمكن أن تستخدم للتغلب على التحديات مثل الفتك التنموية أو العقم، والتي يمكن أن تعوق إنتاج وصيانة سلالات تحمل طفرات وراثية، وهي عملية مكلفة وكثيفة العمالة التي لا تتوفر في جميع أنواع الحشرات بعد. على الرغم من أن درجة إسكات الجينات التي كتبها رني يمكن أن تختلف من الجينات إلى الجينات، الأنسجة إلى الأنسجة، والحيوان الى الحيوان، ويستخدم على نطاق واسع رني للتحليل وظيفي من الجينات في البعوض والحشرات الأخرى 8،9.

وقد استخدمت ثلاث استراتيجيات التدخل تسليم RNA في البعوض: حقن مكروي، تمرغ / التطبيق الموضعي، والابتلاع. للتعرف على تاريخ مفصل والمقارنة من استخدام هذه التقنيات الثلاث في الحشرات، يرجى الرجوع إلى يو وآخرون 8. Wه وقد استخدمت بنجاح حقن مكروي 10 كوسيلة لتقديم الرناوات siRNAs لاستهداف الجينات التنموية في A. الأجنة بعوض، يرقات، عذارى و11-14. ومع ذلك، تتطلب هذه الاستراتيجية تسليم كثيفة العمالة على حد سواء الإعداد حقن مكروي ويد ماهرة. وعلاوة على ذلك، هو حقن مكروي مرهقة للكائن الحي، وهو عامل التباس، وخاصة عندما سيتم تقييم الظواهر السلوكية. وأخيرا، لا يمكن تمديد تسليم حقن مكروي إلى الميدان لمكافحة النواقل. وكبديل لذلك، تمرغ الكائن في التدخل الحل RNA كما أصبحت وسيلة شعبية للحمل إسكات الجينات، كما أنها مريحة ويتطلب معدات قليلة أو العمل. وقد تم تطبيقها في المقام الأول تمرغ في خط الخلية الحشرات يدرس 8، ولكن في دراسة حديثة، وقد تحقق ضربة قاضية في A. بعوض اليرقات مغمورة في محلول من الرنا المزدوج الجديلة 15، والتي ظهرت الحيوانات أن تناول. ومع ذلك، من أجل دراسة شملت تحليل experimenta متعددةمجموعات لتر أو الظواهر، تمرغ مكلف نوعا ما. لوبيز مارتينيز وآخرون. 16 وصفت الإماهة مدفوعة رني، نهجا جديدا للتدخل تسليم RNA الذي ينطوي على الجفاف في محلول ملحي والإماهة مع قطرة واحدة من المياه التي تحتوي على التدخل RNA. لا تقطع هذا النهج التكاليف المرتبطة الغمر الحيوان كله، ولكن هي أكثر تكلفة من حقن مكروي وربما تكون محدودة في تطبيقه على الأنواع التي يمكن أن يتسامح مع الضغوط الأسموزية العالية. وعلاوة على ذلك، فمن الصعب أن نتصور كيف يمكن تكييفها الغمر أو منهجية الغمر / الإماهة الجفاف لمكافحة ناقلات الأمراض في هذا المجال. لهذه الأسباب، لدراسات ما بعد الجنينية، والتسليم بالتدخل RNA مع الطعام تناولها هو استراتيجية بديلة قابلة للحياة.

على الرغم من أن الاستراتيجيات القائمة على ابتلاع لا تعمل في جميع أنواع الحشرات، وربما أبرزها ذبابة الفاكهة البطن، وقد شجعت تسليم عن طريق الفم بالتدخل RNA مختلطة مع الطعام سي جينlencing في مجموعة متنوعة من الحشرات 8،17، بما في ذلك A. بعوض البالغين 18. وصفنا الشيتوزان بوساطة جسيمات متناهية الصغر رني في A. الغامبية يرقات 19 وطبقت بنجاح هذا النهج للحد من التعبير الجيني في A. بعوض اليرقات 20،21. هنا، ومنهجية لهذا الإجراء رني، الذي ينطوي على entrapping بالتدخل RNA من قبل الشيتوزان البوليمر، هو مفصل. تتشكل الشيتوزان / التدخل النانوية RNA التي كتبها التجميع الذاتي للpolycations مع التدخل RNA من خلال القوى الكهروستاتيكية بين الشحنات الموجبة من المجموعات الأمينية في الشيتوزان والشحنات السالبة التي تحملها مجموعات الفوسفات على العمود الفقري بالتدخل RNA 19. الإجراء الموضح متوافق مع كل من جزيئات الرنا المزدوج الجديلة الطويلة (المشار إليها فيما يلي باسم الرنا المزدوج الجديلة) أو مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل سيرنا (المشار إليه فيما بعد سيرنا). يتم خلط التالية التوليف، الشيتوزان / التدخل النانوية RNA مع الطعام اليرقات وتسليمها إلىاليرقات من خلال الابتلاع عن طريق الفم. هذه المنهجية غير مكلفة نسبيا، ويتطلب القليل من المعدات والعمالة 19، وتسهل تحليل الإنتاجية العالية من الظواهر متعددة، بما في ذلك تحليل السلوكيات 20،21. من المحتمل أن هذه المنهجية، التي يمكن تكييفها للدراسات إسكات الجينات في الحشرات الأخرى، بما في ذلك ناقلات الأمراض الأخرى والآفات الزراعية الحشرات، يمكن استخدامها لإسكات الجينات في مجموعة متنوعة من الأنواع الحيوانية الأخرى. وعلاوة على ذلك، الشيتوزان، وهي غير مكلفة، وغير سامة وقابلة للتحلل البوليمر 22، من المحتمل أن تستخدم في الميدان لمكافحة البعوض أنواع محددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. أنواع البعوض وتربية

  1. الحفاظ A. الغامبية G3 وA. سلالات بعوض ليفربول IB12 (المستخدمة في الدراسات تمثيلية أدناه) أو سلالات أخرى من الفائدة وفقا للممارسة المختبر القياسية أو كما هو موضح سابقا 23،24.

2. الرنا المزدوج الجديلة وسيرنا التصميم والإنتاج

  1. الاشعال تصميم لبناء قوالب الرنا المزدوج الجديلة طويلة محددة لهذا الجين من الفائدة. استخدام أداة E-رني 25. إنتاج الرنا المزدوج الجديلة وفقا لطريقة الاختيار أو كما سبق وصفه (19).
    1. لسيطرة سلبية، توليف الرنا المزدوج الجديلة 19 المقابلة لتسلسل بروتين الفلورية الخضراء (GFP)، β-غالاكتوزيداز (β-غال)، أو بعض الجينات الأخرى لا المعبر عنها في البعوض. إذا رغبت في ذلك، الرنا المزدوج الجديلة 19 تستخدم لتوليد نتائج ممثلة نوجزها فيما يلي يمكن استخدامها كعنصر تحكم إيجابية. متجر الرنا المزدوج الجديلة الذائبة في المياه خالية من ريبونوكلياز في -80 °؛ C لحين الحاجة إليها.
  2. بدلا من ذلك، تصميم سيرنا الجينات المحددة وفقا للممارسة المختبر القياسية أو كما هو موضح سابقا (10). يتبارى تسلسل من سيرنا ضربة قاضية لتصميم تحكم سيرنا السلبية التي لا تتوافق مع أي جين البعوض. شراء الرناوات siRNAs المخصصة، والتي تتوفر من خلال عدد من البائعين السمعة.
    1. إذا رغبت في ذلك، الرناوات siRNAs 20،21 استخدامها للحصول على نتائج ممثلة نوجزها فيما يلي يمكن أن تستخدم الضوابط الإيجابية. متجر سيرنا يذوب في الماء ريبونوكلياز خالية في -80 ° C لحين الحاجة إليها.

3. إعداد الشيتوزان / التدخل RNA النانوية

  1. جمع مسبقة الصنع RT 100 ملي كبريتات الصوديوم (100 ملي نا 2 SO 4 في منزوع الأيونات H 2 O) و 0.1 M خلات الصوديوم (0.1 M بريدا 2 H 3 O 2 -0.1 M حمض الخليك، ودرجة الحموضة 4.5 في منزوع الأيونات H 2 O) المخازن المؤقتة.
  2. حل الشيتوزان (≥75٪deacetylated) في 0.1 M الصوديوم العازلة خلات لجعل 0.02٪ (ث / ت) حل العمل والحفاظ على الحل في RT قبل الاستخدام.
  3. حل الرنا المزدوج الجديلة أو سيرنا في 50 ميكرولتر منزوع الأيونات H 2 O وإضافته إلى 100 ​​ملي العازلة كبريتات الصوديوم لجعل حل 100 ميكرولتر من 32 ميكروغرام من الرنا المزدوج الجديلة / سيرنا في 100 ميكرولتر من 50 ملي كبريتات الصوديوم.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من حل الشيتوزان إلى حل الرنا المزدوج الجديلة / سيرنا ثم تسخين الخليط في حمام مائي عند 55 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. إعداد عنصر تحكم من خلال إضافة 100 ميكرولتر من 50 ملي كبريتات الصوديوم إلى 100 ميكرولتر من حل الشيتوزان واتبع نفس الإجراء.
  5. مزيج الحلول فورا لمدة 30 ثانية بواسطة عالية السرعة vortexing لفي RT لتسهيل تشكيل الجسيمات النانوية.
  6. أجهزة الطرد المركزي الخليط في 13،000 x ج لمدة 10 دقيقة في RT، وبعد ذلك الوقت بيليه يجب أن يكون مرئيا. نقل طاف لأنبوب جديد 1.5 مل. الهواء الجاف بيليه ل≈10 دقيقة في RT قبل استخدامه لإعداد الطعام البعوض.
  7. Measure تركيز الرنا المزدوج الجديلة / سيرنا في طاف باستخدام طاف من سيطرة (انظر 3.5) كما فارغة لحساب المبلغ الإجمالي للالرنا المزدوج الجديلة / سيرنا التي بقيت في طاف. استخدام الفرق بين كميات الانطلاق من الرنا المزدوج الجديلة / سيرنا والمبالغ المتبقية في supernatants لحساب النسبة المئوية من الرنا المزدوج الجديلة / سيرنا شرك في الجسيمات النانوية. هذه الكفاءة تحميل هي عادة أكثر من 90٪.
  8. كرر نفس الإجراء إذا كان هناك حاجة لمزيد النانوية. استخدام الجسيمات النانوية المجففة على الفور. لم يتم تقييم تأثير التخزين البارد من الجسيمات قبل الاستخدام.

4. إعداد البعوض الأغذية التي تحتوي على الشيتوزان / التدخل RNA النانوية

  1. إعداد 1 مل من محلول الاغاروز 2٪ (ث / ت) في الماء منزوع الأيونات، إذابة الاغاروز، والحفاظ على حل الاغاروز ذاب في حمام 55 مئوية الماء قبل الاستخدام.
  2. مزيج رقائق الأسماك الغذاء (البروتين الخام 47٪، ودقيقة. الدهون الخام 10٪، كحد أقصى. الألياف الخام 3٪)، والخميرة الجافة فينسبة 2: 1 (ث / ث). طحن الخليط إلى جسيمات صغيرة مع هاون ومدقة (مقبول من خلال رقم 50 USA القياسية اختبار منخل). استخدام الغذاء الأرض، التي ينبغي أن تكون في اللون البني اللون، إما مباشرة أو تخزينها في حاوية مغلقة عند 4 مئوية لعدة أسابيع.
  3. في أنبوب 1.5 مل، مزيج 6 ملغ من الغذاء الأرض مع النانوية المجففة من القسم 3.7 مع المسواك.
  4. إضافة 30 ميكرولتر من 2٪ قبل ذاب حل agarose هلام إلى خليط الغذائية جسيمات متناهية الصغر. يحرك فورا وبدقة باستخدام مسواك أو طرف الماصة.
  5. استخدام الجل تحتوي على المواد الغذائية والجسيمات النانوية لتغذية يرقات البعوض على الفور. بدلا من ذلك، مرة واحدة عزز الجل تماما في RT، تخزين هلام في 4 درجات مئوية، وتستخدم في اليوم التالي، أو في -80 ° C لاستخدامها لاحقا.

5. تغذية يرقات البعوض مع الأغذية التي تحتوي على الشيتوزان / التدخل RNA النانوية

  1. التغذية A. الغامبية يرقات البعوض:
    1. إزالة سيngle بيليه هلام من أنبوب 1.5 مل باستخدام مسواك وقطع عليه في 6 شرائح متساوية باستخدام شفرة حلاقة نظيفة أو اختيار الأسنان.
    2. نقل 20 يرقات العمر الثالثة إلى 500 مل طبق بتري تحتوي على 100 مل من الماء منزوع الأيونات.
    3. تغذية يرقات البعوض عن طريق إضافة شريحة واحدة من بيليه هلام (المفروم إلى قطع صغيرة) في طبق بتري مرة واحدة يوميا لمدة أربعة أيام. مما لا شك فيه أن نلاحظ تغذية اليرقات على بيليه، الذي ينبغي أن انخفاض كبير في حجم أو غائبة تماما في اليوم التالي. بعد الوقت، وسوف البعوض يتطور إلى أواخر الرابعة يرقات العمر.
    4. تسجيل أي تغييرات المظهري مرئية أثناء التجربة. فحص مستويات النص والتغيرات المظهرية الأخرى كما نوقش في قسم 6 في نهاية الفترة لمدة أربعة أيام.
  2. التغذية A. بعوض يرقات البعوض:
    1. قطع بيليه هلام إلى 6 شرائح متساوية باستخدام شفرة حلاقة نظيفة أو المسواك.
    2. وضع 50-متزامنة سن 24 ساعة بعد الفقس البيض فايRST يرقات العمر في طبق بتري في ≈40 مل منزوع الأيونات الماء.
    3. تغذية اليرقات شريحة واحدة لكل طبق بتري لمدة 4 ساعة / يوم، ثم نقل اليرقات العودة إلى النظام الغذائي العادي اليرقات من 2: 1 الأرض الأسماك رقائق المواد الغذائية والخميرة الجافة لبقية اليوم. كرر العملية يوميا طوال الأعمار اليرقية الأربعة.
    4. فحص مستويات النص والتغيرات المظهرية الأخرى كما نوقش في قسم 6 في النقاط المرجوة الوقت التنموية.

6. التأكيد على إسقاط الموروثة

  1. الكمي نسخة النسبي الذي QRT-PCR في A. بعوض وA. الغامبية اليرقات.
    1. أداء وتحليل فحوصات QRT-PCR مع ثلاثة مكررات البيولوجية على 10 على الأقل السيطرة المجمعة مقابل اليرقات التجريبية كما هو موضح 11،19،20، أو وفقا لإجراءات المختبر القياسية. تدرج نتائج ممثلة أدناه.
    2. لتحليل جزء معين نوع الأنسجة / الجسم (أي.، الدماغ أو هوائي)، PERFOجمهورية مقدونيا QRT-PCR كما هو موضح في 6.1.1 تشريح التالية لاسترداد الأنسجة من الاهتمام (على سبيل المثال، انظر ميسور وآخرون. 21).
  2. تأكيدا لضربة قاضية من قبل التهجين في الموقع
    1. تجميع المسمى digoxygenin العقاقير والشعور riboprobes تحكم وفقا للممارسة المختبر القياسية أو على النحو المبين 26.
    2. تنفيذ الموقع التهجين في بروتوكول هاوجين وآخرون. 27 لتأكيد ضربة قاضية في كما هو موضح سابقا 11،20 ومناقشته في القسم نتائج ممثلة أدناه.
  3. تأكيدا لضربة قاضية من قبل المناعية
    1. إذا كانت الأجسام المضادة ضد البروتين المنتج من الجينات المستهدفة المتاحة، نفذ المناعية كما هو موضح سابقا 28، مما يسهل تحديد الأفراد الذين يعانون من أعظم مستويات ضربة قاضية للتحليل النمط الظاهري 20 كما يتمثل في representatiلقد قسم النتائج أدناه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A. الغامبية:

تتشكل جزيئات الشيتوزان / الرنا المزدوج الجديلة بسبب التفاعل الكهربائي بين المجموعات الأمينية من الشيتوزان ومجموعات الفوسفات من الرنا المزدوج الجديلة. كفاءة الرنا المزدوج الجديلة إدماجها النانوية هي عادة فوق 90٪ مقاسا استنزاف الرنا المزدوج الجديلة من الحل. تظهر الصور مجهر القوة الذرية التي الشيتوزان-الرنا المزدوج الجديلة المتوسطات حجم الجسيمات 140 نانومتر في القطر، تتراوح 100-200 نانومتر (الشكل 1).

الشكل (1)
الشكل 1. تشكيل الجسيمات النانوية التي كتبها الشيتوزان والتدخل RNA. القوة الذرية صورة مجهرية من الجسيمات النانوية الشيتوزان / الرنا المزدوج الجديلة (A) أو حل الشيتوزان بدون إضافة الرنا المزدوج الجديلة (B). وكان حجم الصور 1.0 ميكرون × 1.0 ميكرون. مقياس شريط = 250 نانومتر.e.com/files/ftp_upload/52523/52523fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

تغذية هذه الجسيمات التي هي مجتمعة مع الطعام اليرقات القياسية، وأدمج في الاغاروز يدعم نمو اليرقات الطبيعية. الأهم من ذلك، ضربة قاضية محددة من المستمدة من الأديم الظاهر النصوص AgCHS1 وكذلك AgCHS2 المعي المتوسط ​​محددة (الشكل 2) ممكنة 19، مما يدل على أن الرنا المزدوج الجديلة تناولها عن طريق ابتلاع الجسيمات النانوية يبادر رني ما وراء المعي المتوسط. وقد لوحظت الكفاءة ضربة قاضية ≈40-60٪ (على سبيل المثال، الشكل 2) وتختلف بين النصوص.

الشكل 2
الشكل 2. مستويات النسخ من الكيتين سينسيز 2 (AgCHS2) بعد ابتلاع الرنا المزدوج الجديلة في <م> A. الغامبية اليرقات. مستويات مرنا النسبية للAgCHS2 في اليرقات تتغذى على الجسيمات النانوية مع س أو س AgCHS2 السيطرة GFP. وتعرض البيانات كما يعني ± SD من ثلاث مكررات البيولوجية مستقلة. رسائل مختلفة على أشرطة تشير إلى اختلافات كبيرة على أساس الاختبارات ر الاقتران (P = 0.003).

ضربة قاضية من AgCHS1 إلى خفض كبير في المحتوى الكلي للكيتين الرابعة يرقات العمر وزيادة القابلية للحشرات كيتين التوليف المانع، diflubenzuron 19، ضربة قاضية من AgCHS2 زيادة كبيرة في تأثير calcofluor الأبيض وdithiothreitol التي تعطلت المصفوفة المحيط بالغاذية (PM) في الطور الرابع اليرقات (الشكل 3) مما أدى إلى زيادة معدل الوفيات 17.

الشكل (3)
AgCHS2 تناولها النانوية على A. الغامبية مصفوفة المحيط بالغاذية (PM) نفاذية. Calcofluor العلاج بيضاء أو DTT يعطل PM من A. الغامبية اليرقات التي exuberated مزيدا من AgCHS2 ضربة قاضية من خلال ابتلاع الشيتوزان / الرنا المزدوج الجديلة النانوية 19. (A) مع البعوض سليمة PM. (B) البعوض مع تعطلت PM، ديكستران الأزرق تتسرب إلى ceacae المعدة.

A. بعوض:

واستخدمت الشيتوزان / الجسيمات النانوية سيرنا لاستهداف الجين التوجيه محور عصبي semaphorin-1A (sema1a) خلال A. نمو اليرقات بعوض 20. وأكد ضربة قاضية من sema1a من خلال الموقع التهجين، التي اكتشفت انخفاض مستويات sema1a في ≈60٪ من العقول الحمار اليرقات فيإسيد وفشلت في الكشف عن التعبير sema1a في ≈40٪ من أدمغة الحيوانات ضربة قاضية (الشكل 4C مقابل باء؛ رأس السهم الأصفر يشير إلى الفص antennal). وكشفت فحوصات QRT-PCR التي أجريت على الحيوانات كلها مجمعة على أن هذا الأسلوب أدى إلى تخفيض 32 ± 10٪ في محاضر sema1a بالمقارنة مع ضبط جسيمات متناهية الصغر الحيوانات التي تتغذى (الشكل 4A؛ P <0.01 على أساس الاقتران ر الاختبار، N = 5، حيث N هو عدد مكررات البيولوجية). ضربة قاضية في الدماغ استمرت خلال 24 ساعة على الأقل التنمية العذراء، كما يتضح من فقدان مكافحة Sema1a الأجسام المضادة التعبير (الشكل 4E1 مقابل D1)، والذي تم استخدامه لتحديد الحيوانات مع ضربة قاضية كبيرة خلال تحليل اليرقات والعذراء النمط الظاهري حاسة الشم. تم الكشف عن عيوب الفص antennal اليرقات والعذراء (كميا في الجدول رقم 1) في sema1a ضربة قاضية اليرقات والعذارى (الشكل 4E2، مقابل E3 (الشكل 4E2 مقابل D2، تصور مع mAbnc82، وتظهر تراكب كل من إشارات في الشكل 4D3، E3). تم إنشاؤها الظواهر مقارنة مع اثنين من sema1a منفصلة الرناوات siRNAs ضربة قاضية، مما ساعد على ضمان العيوب احظ لم تكن نتيجة للخارج الموقع تستهدف إما عن طريق سيرنا. تم إنشاء أعلى مستويات ضربة قاضية عندما تم الجمع بين الرناوات siRNAs، وهي الاستراتيجية التي يمكن استخدامها لزيادة كفاءة ضربة قاضية (انظر ميسور وآخرون. (20) لمزيد من التفاصيل).

الشكل (4)
الشكل 4. الشيتوزان / سيرنا الناجم عن ضربة قاضية من sema1a في نظام حاسة الشم النامية A. الزاعجة المصرية. QRT-PCR (A) والتهجين في الموقع (B، C) وأكدت فحوصات ضربة قاضية من sema1a في اليرقات تتغذى على خليط من sema1a استهداف سيرنا 890 وسيرنا 1198 الشيتوزان / التدخل النانوية RNA مقابل النانوية السيطرة. أدى فقدان Sema1a التعبير في الكبيبات التي يتم مشوه (E1-3 مقابل D1-3). انظر النص لمزيد من التفاصيل. الظهرية متروك في كل اللوحات. = شريط نطاق 25 ميكرون. هذا الرقم ظهر أصلا في ميسور وآخرون 20. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

يرقات الشرانق
سيرنا ن <أقوياء> Wildtype عيوب AL ن Wildtype عيوب AL
سيطرة 69 69 (100٪) 0 (0٪) 68 68 (100٪) 0 (0٪)
sema1a KD 77 42 (54.5٪) 35 (44٪) * 75 51 (68٪) 24 (32٪) *

الجدول 1. الكمي من العيوب الفص antennal التالية ضربة قاضية sema1a. ملخص المترجمة من النتائج التي تم الحصول عليها من أجل السيطرة سيرنا مقابل sema1a ضربة قاضية (KD) سيرنا 890 + سيرنا 1198 الشيتوزان التي تغذيها جسيمات متناهية الصغر الحيوانات من ما مجموعه ثمانية التجارب تكرار تنفيذها في كل من اليرقات ( ويرد الأيسر) والشرانق (يمين). المجموعوأشار عدد من الأفراد الخاضعين للتقييم (ن) وأرقام / النسب المئوية للحيوانات التي تظهر النوع البري التشكل مقابل الفص antennal (AL) العيوب (العيوب التي تستهدف مستقبلات الشم العصبية، معيبة neuropil وتشكيل الكبيبات). تم التحقق ضربة قاضية immunohistochemically مع مكافحة Sema1a تلوين الأجسام المضادة في مجموعة فرعية من الحيوانات (15 اليرقات والشرانق 10) الذي عرض أكثر العيوب الشديدة (الرمز مع *). تم العثور على جميع الحيوانات ضربة قاضية تقييمها بهذه الطريقة أن ينخفض ​​مستويات Sema1a، في حين أن مستويات Sema1a في الحيوانات التي تتغذى على السيطرة لم تتغير بشكل ملحوظ. هذا الجدول ظهرت أصلا في ميسور وآخرون 20.

في التحقيق الثاني تم استخدام 21، الشيتوزان / الجسيمات النانوية سيرنا لاستهداف عامل النسخ احدة في التفكير (سيم) خلال تطوير نظام حاسة الشم. وأشارت فحوصات QRT-PCR مع العقول المجمعة تشريح من الحيوانات كلها أن أدمغة ضربة قاضية سيم كان في المتوسط ​​reducti 47٪على في محاضر سيم بالمقارنة مع السيطرة على الحيوانات التي تتغذى على جسيمات متناهية الصغر (P = 0.005 بناء على الاقتران ر الاختبار). المقايسات مقارنة مع هوائيات كشف على متوسط ​​انخفاض 77٪ في مستويات سيم مع الاحترام للحيوانات (P = 0.002 بناء على الاقتران ر الاختبار) السيطرة على تغذية. على الرغم من بعض التقلبات في مستويات ضربة قاضية بين الأنسجة والحيوانات، ولم يتم الكشف عن محاضر سيم من خلال التهجين في الموقع في ≈50٪ من أدمغة الحيوانات ضربة قاضية / هوائيات بعد العلاج مع أي من اثنين الرناوات siRNAs ضربة قاضية مختلفة (الشكل 5B2، B3، C2، C3 مقابل B1، C1، الجدول 2). في المقايسات السلوكية الخميرة التي تم خلالها منح الأفراد التي تم جذبها إلى الخميرة على درجة من 1، في حين أعطيت الحيوانات التي لم ينجذب بنتيجة 0، متوسط ​​درجات سيم سيم 430 أو 718 كانت الحيوانات ضربة قاضية سيأقل gnificantly من أن الحيوانات التي تتغذى على السيطرة في تجربتين تكرار (الشكل 5A؛ P <0.001 على أساس الاقتران ر الاختبار). معيب السلوك تتبع رائحة (الشكل 5A) المترابطة مع انخفاض مستويات سيم في هوائيات (الشكل 5B2، B3 مقابل B1) والعقول (الشكل 5C2، C3 مقابل C1، النقاط الصفراء علامة محيط الفص antennal؛ انظر الجدول 2 لتقدير النتائج). تم تحديد العيوب متعددة في الهوائيات وفصوص antennal الحيوانات ضربة قاضية سيم (انظر ميسور وآخرون 21. لمزيد من التفاصيل). على سبيل المثال، اليرقات ضربة قاضية سيم والشرانق تفتقر إلى التعبير عن ORCO، وتلزم مستقبل مساعد لجميع مستقبلات الرائحة في الخلايا العصبية مستقبلات الشم (الشكل 6). تم الكشف عن انخفاض مستويات النص ORCO في الأفراد تتغذى على سيم 430 ( الشكل 6A3، B3) أو سيم 718 (الشكل 6A4، B4) ضربة قاضية (KD) الشيتوزان / الجسيمات النانوية سيرنا (مقارنة مع الحيوانات البرية نوع في الشكل 6A1، B1 والسيطرة الشيتوزان / سيرنا الحيوانات التي تتغذى على جسيمات متناهية الصغر في الشكل 6A2، B2). فقدان ORCO التعبير النمط الظاهري لوحظ في L4 اليرقات (الشكل 6A1-A4) واستمرت من خلال 24H على الأقل بعد تشكيل العذراء (الشكل 6B1-B4).

الرقم 5
الشكل 5. سيم ضربة قاضية تظهر يرقات معيب السلوك رائحة جاذبة. وفي التهجين في الموقع كشفت انخفاض مستويات RNA سيم في هوائيات (B2، B3) والعقول (C2، C3) من سيم 430 وسيم 718 الحيوانات ضربة قاضية (مقارنة للسيطرة على تغذية في B1، C1)، والتي فشلت في الاستجابة لجاذبة الخميرة الرائحة (A). انظر النص لمزيد من التفاصيل. موجهة نهايات القريبة من الهوائيات صعودا في B1-B3. هو المنحى التصاعدي في ظهري C1-C3. = شريط نطاق 25 ميكرون. هذا الرقم ظهر أصلا في ميسور وآخرون 21. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6. فقدان ORCO التعبير في A. تطوير تم الكشف عن هوائي بعوض التالية ضربة قاضية من سيم. انخفاض مستويات ORCO نسخة في الأفراد الحديدد مع سيم 430 (A3، B3) أو سيم 718 (A4، B4) ضربة قاضية (KD) الشيتوزان / الجسيمات النانوية سيرنا (مقارنة مع الحيوانات البرية في نوع A1، B1 والسيطرة الشيتوزان / سيرنا الحيوانات التي تتغذى على جسيمات متناهية الصغر في A2، B2). انظر النص لمزيد من التفاصيل. = شريط نطاق 25 ميكرون. تم تجميع هذا الرقم من الصور التي نشرت في ميسور وآخرون 21. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ينجذب لا جذبت
سيرنا ن # الحيوانات طبيعي معتدل باطل # الحيوانات طبيعي معتدل باطل
سيطرة 195 196 (100٪) 196 (100٪) 0 0 0 0 0 0
سيم 430 دينار كويتي 176 63 (35٪) 48 (76٪) 15 (24٪) 0 113 (64٪) 20 (18٪) 12 (11٪) 81 (71٪)
سيم 718 دينار كويتي 177 66 (37٪) 44 (66٪) 22 (34٪) 0 111 (63٪) 20 (18٪) 9 (8٪) 82 (74٪)

الجدول المستوى 2.الصورة من سيم ترتبط مع أداء اليرقات في مقايسة السلوكي الخميرة. ملخص المترجمة من النتائج التي تم الحصول عليها في أربع الخميرة الرائحة جاذبة تكرار التجارب هو مبين. العدد الإجمالي للحيوانات (ن) يشير إلى عدد من اليرقات الفردية التي تم اختبارها في هذه المقايسات السلوكية. عدد اليرقات الفردية (# الحيوانات) التي تم جذبها (اليسار، الحيوانات التي تطرق بيليه الخميرة وحصلت على درجة من 1) أم لا جذب (اليمنى. الحيوانات التي لم يتطرق بيليه الخميرة وحصل على درجة من 0) تحت كل حالة (التحكم، وسيم 430 دينار كويتي، أو سيم 718 KD الشيتوزان / سيرنا التي تغذيها جسيمات متناهية الصغر) وترد، ويتم تضمين النسب المئوية من إجمالي الحيوانات التالي أرقام الخام. تم تقييم ضربة قاضية من سيم من خلال التهجين في الموقع في العقول وهوائيات الحيوانات جذب (يسار) أو لم يجذب (يمين) إلى الخميرة. العدد الخام / نسبة الأفراد مع عادي (مماثلة لwildtype مستويات النص سيم)، لاغية (لا سيم نسخة ملاحظتها)، أو متوسطة (خفض ولكن ليس النوع البري) يشار إلى مستويات سيم. فقدان سيم ترتبط بشكل جيد مع عدم وجود جاذبية للالخميرة. هذا الجدول ظهرت أصلا في ميسور وآخرون 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد استخدم / التدخل منهجية جسيمات متناهية الصغر RNA الشيتوزان الموصوفة هنا لاستهداف الجينات بشكل فعال خلال نمو اليرقات في A. الغامبية (أرقام 2 و 3) وA. الزاعجة المصرية (أرقام 4، 5، 6، الجدولين 1 و 2). الشيتوزان النانوية يمكن أن تكون على استعداد مع إما طويلة الرنا المزدوج الجديلة أو سيرنا، وكلاهما قد استخدمت بنجاح في البعوض كما يتضح من نتائج ممثلة الموصوفة هنا. توليف الرنا المزدوج الجديلة هو اقل كلفة من شراء سيرنا، ولكن هو أكثر كثيفة العمالة. إذا الشيتوزان / يستخدم سيرنا، ويمكن التأكد من الظواهر مع الرناوات siRNAs متعددة، مما يسمح لضمان أفضل أن النمط الظاهري كشف ليس بسبب استهداف خارج الموقع. أيضا، فإن الإنتاج التجاري من الرناوات siRNAs بشكل جماعي قد تسهل أفضل توسيع الشيتوزان / التدخل RNA إسكات لأنواع محددة مكافحة البعوض إلى الميدان. هذا بالطبع سوف يتطلب التغلب على obstaجسيمات مثل التكلفة والتسليم.

على الرغم من أننا قد حققنا نجاحا جيدا مع هذا البروتوكول، ويجب أن يكون الأمثل منهجيات لكل الجينات. لهذا السبب، فإننا ننصح باختبار الرناوات siRNAs متعددة، أو ربما سيرنا واحد والرنا المزدوج الجديلة طويلة، في بداية مشروع جديد. وبمجرد تحديد الظواهر وأكد مع اثنين على الاقل من الرناوات siRNAs متميزة المقابلة لجين من الفائدة، قد يكون من المفيد أن الجمع بين هذه الرناوات siRNAs لزيادة النمط الظاهري انتفاذ (الشكل 4). توقيت وأيضا مدة الشيتوزان / التدخل الوقت التغذية RNA يمكن أن يكون الأمثل لكل دراسة. A. الغامبية تزدهر عندما يتغذى فقط مع الشيتوزان / التدخل الغذاء RNA كما هو موضح هنا. ومع ذلك، في التجارب التي انجزنا حتى الآن، A. وقد الزاعجة المصرية لم تحقق نجاحا جيدا من دون تغذية تكميلية، وهي مشكلة تغلبنا بنقلهم إلى اتباع نظام غذائي من الغذاء الطبيعي بعد 4 ساعات من الشيتوزان / التدخل التغذية RNA. تجريب الشيتوزان / التدخلتسليم RNA في ركيزة الغذائية المختلفة، ونحن لم يحاولوا حتى الان، قد تحايل على هذه المشكلة. لقد وجدنا أن 4 ح الوجبات اليومية على مدار عدة أيام تؤدي إلى توازن جيد بين ضربة قاضية والتغذية الكافية، ولكن تعديل مدة الرضاعة يمكن مواصلة النظر كما تريد. أيضا، والطور اليرقي الذي يبدأ / تابع الشيتوزان / التدخل RNA التغذية جسيمات متناهية الصغر يمكن تكييف لكل تجربة حسب الفترة الحرجة التنموية التي يتم فيها فحص وظيفة الجين، والميزة الرئيسية لهذا البروتوكول.

التحقق من ضربة قاضية هو بالطبع حرج، ولكن قد يتطلب أيضا استكشاف الأخطاء وإصلاحها. لهذا السبب، قد يكون من المفيد للتحقق في وقت واحد إذا كان يتم إنشاء الظواهر من الفائدة حيث يتم تقييم كفاءة ضربة قاضية. للتجارب التصديق QRT-PCR، فمن الأهمية بمكان أن الاشعال والشروط PCR هي الأمثل. وعلاوة على ذلك، من المهم أن الحيوانات هي تنمويامتزامنة في بداية التجربة، والتعبير عن بعض النصوص يمكن أن تكون دينامية للغاية خلال التنمية ونظرا لإيقاعات الساعة البيولوجية 29. وعلاوة على ذلك، في حين أن هذه التقنية يولد بوضوح ضربة قاضية خارج القناة الهضمية، ونحن بداية فقط لتقييم الأنسجة تكون هذه التقنية فعالة، وهذا قد تختلف بين الأنواع. ولذلك سيكون من المفيد قياس ضربة قاضية في أنسجة معينة، والتي يمكن أن يتحقق عن طريق تشريح الأنسجة من الاهتمام من الحيوانات كلها لQRT-PCR المقايسات أو من خلال التهجين في الموقع (الأرقام 4-6) 20،21 والمناعية (الشكل 4) 20 المقايسات (انظر هاوجين وآخرون. 27 وكليمونز وآخرون 28، على التوالي، لاستكشاف هذه البروتوكولات). منذ ضربة قاضية تختلف من فرد إلى آخر، فإنه من المفيد لأداء فحوصات مزدوجة وضع العلامات لتقييم الظواهر في تركيبة مع مستويات ضربة قاضية (فيقوإعادة 4) 20، مما يسهل كثيرا توصيف النمط الظاهري. للدراسات السلوكية، ومستويات ضربة قاضية في الحيوانات الفردية يمكن ربط مع العروض السلوكية (الجدول 2) 20،21.

يلي الشيتوزان بوساطة التدخل تسليم RNA إلى A. بعوض اليرقات، يتم الكشف خفض التعبير الجيني في 24 ساعة للتنمية العذراء (أرقام 4 و 6) 20،21. على الرغم من أن مستويات التعبير الجيني لم يتم بعد تقييم بطريقة مفصلة بعد هذه النقطة من التنمية، وقد تم الكشف عن انخفاض مستويات التعبير الجيني في كل من 48 و 72 ساعة A. الشرانق بعوض (KM، غير منشورة). وسيكون من المفيد لمتابعة تحاليل أكثر تفصيلا من مستويات ضربة قاضية في مراحل متعددة من A. تطوير العذراء بعوض وكذلك لتقييم A. الغامبية الشرانق. أيضا سيكون من المثير للاهتمام أن تحديد ما إذا استمرت ضربة قاضية في البالغين واستكشاف بوساطة جسيمات متناهية الصغر فيterfering استراتيجيات تسليم RNA عن البعوض البالغ.

أدخلت مواقع محددة نوكلياز استهداف الجينات النهج مؤخرا إلى A. بعوض وA. الغامبية والسماح توليد المستهدفة، والطفرات الوراثية في البعوض وغيرها من الكائنات نموذج غير وراثية 30،31. على الرغم من أن استخدام هذه الأساليب يسمح فقدان أكثر اتساقا وظيفة النمط الظاهري التحليلات وميزة على النهج رني، الكشف عن الطفرات التي تهم لا يزال طويلا إلى حد ما تستهلك وكثيفة العمالة. وعلاوة على ذلك، على الرغم من فقدان رني من الدراسات وظيفة تتطلب صيانة سلالات نوع البرية الوحيدة، والسلالات البعوض متحولة يجب أن تربى على حدة. صيانة الطفرات معقمة قاتلة أو الكبار المتنحية هي في الوقت الحاضر من التحديات، نظرا للنقص الحالي في موازنات ملحوظ في البعوض. وهكذا، في حين تكتسب في مواقع محددة الجينات نوكلياز تستهدف النهج بسرعة شعبية، الشيتوزان / التدخل RNA تستهدف قد يكون الأمثلالاختيار للمختبرات ليست مجهزة للحفاظ على سلالات البعوض وفي الحالات التي فقدان وظيفة الجين خلال تطوير تتعارض مع بقاء السلالة.

وبناء على النتائج التي توصلنا إليها، ونحن نتوقع أن الشيتوزان / التدخل RNA يمكن استخدامها على نطاق واسع لضربة قاضية للجينات كثيرة مختلفة خلال تطوير A. الغامبية، A. الزاعجة المصرية، فضلا عن غيرها من الحشرات، والكائنات الحية نموذج غير وراثية محتملة أخرى. إسكات الجينات ناجحة مع الشيتوزان / التدخل RNA تم الإبلاغ عنها في الأنواع المفصلية الأخرى، بما في ذلك الربيان monodon (الجمبري) 32. أظهرت دراسة حديثة أن الجسيمات النانوية تسهيل امتصاص الرنا المزدوج الجديلة، وبالتالي تعزيز كفاءة ضربة قاضية بالمقارنة مع تغذية مباشرة من الرنا المزدوج الجديلة في cornborer آسيا 33، والتي تؤكد إمكانية استخدام هذه التقنية في استهداف الآفات الزراعية. إمكانية استخدام الجسيمات النانوية سيرنا-كما العلاجات في البشر تجتذب قدرا كبيرا سالفائدة و في المجتمع الطبي. Giljohann وآخرون. 34 وصفت توليف وتوصيف متعددة التكافؤ تقارن جسيمات متناهية الصغر RNA والذهب، والتي لها ستة أضعاف يعد عمر النصف مقارنة لتحرير الرنا المزدوج الجديلة وأدخل بسهولة الخلايا. ديفيس وآخرون. 35 وصفت أول تجربة سريرية الإنسان التي تنطوي على إدارة النظامية من الرناوات siRNAs باستخدام نظام تسليم جسيمات متناهية الصغر لمرضى الأورام الصلبة، وإمكانية استخدام الشيتوزان / علاجات سيرنا وقد استعرضت مؤخرا 36. وهكذا، الشيتوزان / التدخل الجيني RNA استهداف تكنولوجيا هي تقنية المختبرات قيمة مع إمكانات لتطبيقات أوسع. الأبحاث المستقبلية سوف استكشاف تطبيقات إضافية لهذه التقنية. وعلاوة على ذلك، وتعديل المواد الكيميائية من الشيتوزان والبوليمرات الأخرى، وهي منطقة نشطة للبحث، قد يزيد من كفاءة التدخل تسليم RNA أو تسمح المستهدفة التسليم إلى أنسجة معينة 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.02 ml pipetteman Rainin PR20 for resuspension of interfering RNA
0.2 ml pipetteman Rainin PR200 for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
0.5 ml graduated tube  Fischer Scientific 05-408-120 for aliquoting resuspended interfering RNA
1 ml pipetteman Rainin PR1000 for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
1.5 ml graduated tube  Fischer Scientific 05-408-046 for preparation of interfering RNA/nanoparticles
1M Sodium Acetate, pH 4.5 TEKnova S0299 to prepare sodium acetate buffer
Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade BDH VWR BDH3092-500MLP to prepare sodium acetate buffer
Agarose Genetic Technology Grade MP Biomedicals LLC. 800668 to coat prepared interfering RNA/nanoparticles
Centrifuge Eppendorf AG 5415D to pellet interfering RNA/nanoparticles
Chitosan, from shrimp shells Sigma-Aldrich C3646-25G to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles
Dry Yeast Universal Food Corp NA to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
E-RNAi tool German Cancer Research Center NA for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
goldfish food Wardley Goldfish FLAKE FOOD to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
Heated water bath Thermo Scientific 51221048 to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC
Ice not applicable not applicable for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
Name Company Catalog Number Comments
Ice bucket Fisher Scientific 02-591-44 for storage of ice used during the procedure
liver powder MP Biomedicals LLC. 900396 to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment
Microwave oven A variety of vendors not applicable to prepare 2% agarose solution
petridish (100 x 15 mm) Fischer Scientific 875713 interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae
pH meter Mettler Toledo S220 for preparation of buffers
Razor blade Fischer Scientific 12-640 to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings
siRNA Thermo Scientific/Dharmacon custom for preparation of siRNA/nanoparticles
Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) BDH/distributed by VWR VWR BDH0302-500G to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended
Thermometer VWR 61066-046 to measure the water bath temperature
Tooth picks VWR 470146-908 for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets
Ultralow freezer A variety of vendors not applicable for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC
Vortex mixer Fischer Scientific 02-216-108 for preparation of chitosan/interfering RNA
Weight paper Fischer Scientific NC9798735 to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malaria. , World Health Organization. http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
  2. Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. http://www.cdc.gov/dengue/ (2014).
  3. Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).
  4. Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).
  5. Wise de Valdez, M. R., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).
  6. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).
  7. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  8. Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions. Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).
  9. Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).
  10. Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
  11. Clemons, A., et al. siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development. PLoS One. 6 (1), e16730 (2011).
  12. Haugen, M., et al. Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development. PLoS One. 6 (6), e21694 (2011).
  13. Nguyen, C., et al. Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti. EvoDevo. 4 (1), 9 (2013).
  14. Sarro, J., et al. Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).
  15. Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. J Insect Sci. 13, 69 (2013).
  16. Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae. Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).
  17. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).
  18. Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).
  19. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).
  20. Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a. PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215 (2013).
  21. Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC developmental biology. 14 (1), 9 (2014).
  22. Dass, C. R., Choong, P. F. Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy. Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).
  23. An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).
  24. Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
  25. Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).
  26. Patel, N. H. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. PA, K. rieg , Wiley-Liss. (1996).
  27. Haugen, M., et al. Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), Cold Spring Harb Protoc. (2010).
  28. Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).
  29. Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).
  30. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  31. Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs. Methods. 69 (1), 38-45 (2014).
  32. Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus. Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).
  33. He, B., et al. Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests). Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).
  34. Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).
  35. Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).
  36. Molinaro, R., et al. Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors. Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).
  37. Singha, K., et al. Polymers in small-interfering RNA delivery. Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 97، ناقلات البيولوجيا، والتدخل RNA،
الشيتوزان / التدخل RNA الجسيمات النانوية وساطة جين إسكات في الأمراض ناقل يرقات البعوض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, X., Mysore, K., Flannery, E., … More

Zhang, X., Mysore, K., Flannery, E., Michel, K., Severson, D. W., Zhu, K. Y., Duman-Scheel, M. Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (97), e52523, doi:10.3791/52523 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter