Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Chitosan / interfererende RNA Nanopartikel medieret gendæmpning i Disease Vector myggelarver

Published: March 25, 2015 doi: 10.3791/52523
Automatic Translation
*1, *2,3, 3,4, 1, 3,4, 5, 2,3,4
1Division of Biology, Kansas State University, 2Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, 3Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame, 4Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 5Department of Entomology, Kansas State University
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en fremgangsmåde til at inhibere gen-funktion i smittebærende myg ved anvendelse af chitosan / interfererende RNA nanopartikler, der indtages af larver.

Abstract

Vector myg påføre mere menneskelige lidelser end nogen anden organisme - og dræbe mere end en million mennesker hvert år. Myg genomprojekter lettet forskning i nye facetter af myg biologi, herunder funktionelle genetiske undersøgelser i den primære afrikanske malaria vektor Malariamyg og dengue og gul feber vektor Aedes aegypti. RNA interferensfri (RNAi-) medieret gendæmpning er blevet anvendt til at målrette gener af interesse i begge disse smittebærende myg arter. Her beskriver vi en procedure for udarbejdelse af chitosan / interfererende RNA nanopartikler, der er kombineret med mad og indtages af larver. Denne teknisk ligetil, high-throughput, og relativt billig metode, som er kompatibel med langt dobbeltstrenget RNA (dsRNA) eller små interfererende RNA (siRNA) molekyler, er blevet anvendt til vellykket knockdown af et antal forskellige gener i A. gambiae og A. aegyptilarver. Efter larver fodringer, knockdown, som er verificeret gennem QRT-PCR eller in situ hybridisering, kan vare i det mindste ved den sene puppestadiet. Denne metode kan anvendes på en bred vifte af myg og andre insekter, herunder landbruget skadedyr, såvel som andre ikke-modelorganismer. Ud over sin anvendelighed i forskningslaboratoriet i fremtiden, chitosan, en billig, ikke-toksisk og biologisk nedbrydelig polymer, potentielt kunne anvendes i marken.

Introduction

Blood fodring vektor myg af Anopheline og Aedine slægter overføre smitstoffer, der er ansvarlige for flere af de værste svøber i menneskeheden. Det anslås 3,4 milliarder mennesker er i risiko for at få malaria, som er ansvarlig for mere end en halv million dødsfald om året på verdensplan. Malaria skyldes smitte med Plasmodium sp. Parasitter, som transmitteres til mennesker via stik fra inficerede myg i Anopheles slægten, herunder hovedstol afrikanske vektor Malariamyg ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ 2014) 1. Aedes aegypti er den primære mosquito vektor til dengue virus, der forårsager dengue feber, en uspecifik febril sygdom, som er den mest udbredte og betydelig arboviral sygdom i verden. Dengue virus er i øjeblikket en trussel mod> 2,5 milliarder mennesker i troperne, med en årlig incidence på ca. 50 millioner tilfælde resulterer i ~ 24.000 dødsfald om året ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2. På trods af den ødelæggende globale virkninger af myg-bårne sygdomme på menneskers sundhed, er effektive midler til at forebygge og behandle disse sygdomme mangler. Mosquito kontrol er i øjeblikket den bedste metode sygdomsforebyggelse.

Potentialet til styring leddyr sygdomme ved genmanipulation af insekter er blevet anerkendt i mere end fire årtier 3. Transgene stammer af A. aegypti manipuleret til at have en repressible kvinde-specifik flyve fænotype har for nylig gjort mulighederne for at anvende transgene vektor kontrolstrategier en realitet 4-6. Disse fremskridt har udfordret forskere at identificere nye genetiske mål for vektor kontrol og supplerende middel til at manipulere genfunktion i vektor myg. Ændring af genekspression dnder udvikling, som det var tilfældet i kvindedominerede flyve myg 4, kan fremme opklaringen af nye vektor kontrolstrategier. Men hovedsagelig på grund af tekniske udfordringer, funktionerne af meget få gener er blevet karakteriseret under udviklingen af A. gambiae, A. aegypti eller andre myg arter.

Siden opdagelsen i C. elegans 7 RNA-interferens (RNAi), som er konserveret i dyr, planter og mikroorganismer, er blevet udbredt anvendt til funktionelle genetiske undersøgelser i en lang række organismer, herunder insekter 8,9. RNAi er initieret af Dicer, som spalter lang dsRNA i korte 20-25 nucleotid lange siRNA'er der fungerer som sekvensspecifik interfererende RNA. siRNA'er stilhed gener, som er komplementære i rækkefølge ved at fremme udskrift omsætning, spaltning, og afbrydelse af oversættelse 9. Lange dsRNA molekyler (typisk 300-600 bp) eller brugerdefinerede siRNA'er rettet mod en particular sekvens kan anvendes i forskningslaboratoriet til silencing helst gen af ​​interesse. Ved at styre når interfererende RNA leveres, kan forskerne styre det tidspunkt, hvor gendæmpning indviede. Denne fordel er nyttigt, da det kan bruges til at overvinde udfordringer såsom udviklingsmæssige letalitet eller sterilitet, som kan hæmme produktion og vedligeholdelse af stammer, der bærer arvelige mutationer, et dyrt og arbejdskrævende proces, som endnu ikke er tilgængelig i alle insektarter. Selvom graden af gendæmpning af RNAi kan variere fra gen gen, væv til væv og dyr til dyr, er RNAi vid udstrækning anvendes til funktionel analyse af gener i myg og andre insekter 8,9.

Tre interfererende RNA levering strategier er blevet anvendt i myg: mikroinjektion, iblødsætning / topisk anvendelse og indtagelse. For en detaljeret historie og sammenligning af anvendelsen af disse tre teknikker i insekter, henvises til Yu et al 8. We har med succes brugt mikroinjektion 10 som et middel til at levere siRNAs at målrette udviklingsmæssige gener i A. aegypti embryoner, larver og pupper 11-14. Men denne arbejdskrævende levering strategi kræver både en mikroinjektion setup og en dygtig hånd. Desuden mikroinjektion er stressende for organismen, forstyrrende element, især når adfærdsmæssige fænotyper vil blive vurderet. Endelig kan mikroinjektion levering ikke udvides til området for vektor kontrol. Som et alternativ har iblødsætning organismen i interfererende RNA løsning også blevet et populært middel til at fremkalde gendæmpning, som det er praktisk og kræver lidt udstyr eller arbejdskraft. Opblødning er primært blevet anvendt i insektcellelinie studerer 8, men i en nylig undersøgelse blev knockdown opnået i A. aegypti larver nedsænket i en opløsning af dsRNA 15, hvor dyrene syntes at være indtagelsen. For undersøgelser med analyse af flere Experimental grupper eller fænotyper, iblødsætning er temmelig dyrt. Lopez-Martinez et al. 16 beskrevne rehydrering drevet RNAi, en ny tilgang til interfererende RNA levering, der involverer dehydrering i saltopløsning og rehydratisering med en enkelt dråbe vand indeholdende interfererende RNA. Denne tilgang har skåret omkostningerne i forbindelse med hele dyr fordybelse, men er dyrere end mikroinjektion og kan begrænses i sin anvendelse på arter, der kan tåle høje osmotiske tryk. Desuden er det vanskeligt at forestille sig, hvordan nedsænkning eller dehydrering / rehydrering nedsænkning metode kan tilpasses til vektor kontrol i marken. Af disse grunde, til post-embryonale undersøgelser, levering af interfererende RNA med indtaget mad er et levedygtigt alternativ strategi.

Selvom Indtagelse-strategier ikke virker på alle insektarter, måske især Drosophila melanogaster, har oral indgivelse af interfererende RNA blandet med mad fremmes gen silencing i en række insekter 8,17, herunder A. aegypti voksne 18. Vi beskrev chitosan nanopartikel-medieret RNAi i A. gambiae larver 19 og har med succes anvendt denne metode til reduktion af genekspression i A. aegypti larver 20,21. Her metode for denne RNAi procedure, som indebærer indfange af interfererende RNA ved polymer chitosan, er detaljeret. Chitosan / interfererende RNA nanopartikler dannes ved selvsamling af polykationer med interfererende RNA gennem de elektrostatiske kræfter mellem positive ladninger af aminogrupperne i chitosan og negative ladninger båret af phosphatgrupper på rygraden af interfererende RNA 19. Den beskrevne fremgangsmåde er kompatibel med både lange dsRNA molekyler (herefter benævnt dsRNA) eller dobbeltstrenget siRNA (i det følgende benævnt siRNA). Efter syntese chitosan / interfererende RNA nanopartikler blandes med larvernes mad og leveret tillarver ved indtagelse. Denne metode er relativt billig, kræver lidt udstyr og arbejdskraft 19, og letter high-throughput analyse af flere fænotyper, herunder analyse af adfærd 20,21. Denne metode, som kan tilpasses til gendæmpning undersøgelser i andre insekter, herunder andre sygdomsvektorer og insekt skadedyr i landbruget, kan potentielt anvendes til gen-silencing i en lang række andre dyrearter. Desuden kunne chitosan, en billig, ikke-toksisk og biologisk nedbrydelig polymer 22 potentielt anvendes i feltet for artsspecifik myg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mosquito Arter og avls-

  1. Vedligehold A. gambiae G3 og A. aegypti Liverpool IB12 stammer (som anvendes i de repræsentative undersøgelser nedenfor) eller andre stammer af renter i henhold til standard lab praksis eller som tidligere 23,24 beskrevet.

2. dsRNA og siRNA Design og Produktion

  1. Design primere til at konstruere lange dsRNA templates specifikke for genet af interesse. Bruge e-RNAi værktøj 25. Fremstil dsRNA ifølge den foretrukne metode eller som tidligere beskrevet 19.
    1. For en negativ kontrol, syntetisere dsRNA 19 svarende til sekvensen af grønt fluorescerende protein (GFP), β-galactosidase (β-gal), eller en anden genet ikke udtrykkes i myg. Hvis det ønskes, kan dsRNA 19 anvendes til at generere repræsentative resultater er sammenfattet nedenfor anvendes som en positiv kontrol. Store dsRNA opløst i RNAse-frit vand ved -80 °; C indtil brug.
  2. Alternativt design genspecifikke siRNA ifølge standard lab praksis eller som tidligere beskrevet 10. Forvrænge det sekvensen af ​​et knockdown siRNA at designe negativ kontrol siRNA, der ikke svarer til nogen mosquito genet. Køb brugerdefinerede siRNA'er, som er tilgængelige gennem en række velrenommerede leverandører.
    1. Hvis det ønskes, kan siRNAs 20,21 udnyttes til opnåelse af de repræsentative resultater er sammenfattet nedenfor anvendes som positive kontroller. Store siRNA opløst i RNAse-frit vand ved -80 ° C indtil brug.

3. fremstilling af chitosan / interfererende RNA Nanopartikler

  1. Saml præfremstillet RT 100 mM natriumsulfat (100 mM Na 2 SO 4 i deioniseret H2O) og 0,1 M natriumacetat (0,1 M NaCI 2 H 3 O 2 -0.1 M eddikesyre, pH 4,5 i deioniseret H2O) buffere.
  2. Opløs chitosan (≥75%deacetyleret) i 0,1 M natriumacetatbuffer for at gøre 0,02% (w / v) brugsopløsning og holde opløsningen ved stuetemperatur før brug.
  3. Opløs dsRNA eller siRNA i 50 pi deioniseret H2O og føje det til 100 mM natriumsulfat buffer at lave en 100 pi opløsning af 32 ug af dsRNA / siRNA per 100 pi 50 mM natriumsulfat.
  4. Tilsæt 100 pi chitosanopløsning til dsRNA / siRNA-opløsning og derefter opvarme blandingen i et vandbad ved 55 ° C i 1 min. Opsætning af en kontrol ved at tilsætte 100 pi 50 mM natriumsulfat til 100 pi chitosanopløsning og følge samme procedure.
  5. Bland løsninger straks i 30 sek ved høj hastighed vortex ved stuetemperatur for at lette dannelsen af ​​nanopartikler.
  6. Centrifugeres blandingen ved 13.000 xg i 10 minutter ved stuetemperatur, hvorefter en pellet skal være synlig. Supernatanten overføres til et nyt 1,5 ml rør. Air-tørre pillen for ≈10 minutter ved stuetemperatur, før du bruger den til at forberede myg mad.
  7. Measure koncentrationen af ​​dsRNA / siRNA i supernatanten ved hjælp af supernatanten fra kontrollen (se 3.5) som en blank for at beregne den samlede mængde af dsRNA / siRNA, der forblev i supernatanten. Brug forskellen mellem grundbeløb for dsRNA / siRNA og beløb tilbage i supernatanterne at beregne procentdelen af ​​dsRNA / siRNA indfanget i nanopartiklerne. Denne belastningseffektivitet er normalt over 90%.
  8. Gentag den samme procedure, hvis flere nanopartikler er nødvendige. Anvende de tørrede nanopartikler straks. Virkningen af ​​kold opbevaring af partikler inden brug er ikke blevet evalueret.

4. Klargøring Mosquito Food indeholder Chitosan / interfererende RNA Nanopartikler

  1. Forbered 1 ml af en 2% agaroseopløsning (w / v) i deioniseret vand, smelte agarosen, og holde smeltet agaroseopløsning i en 55 ° C vandbad før brug.
  2. Bland fiskefoder flager (47% råprotein, min. Råt fedt 10%, max. Træstof 3%) og tørgær ved enforhold på 2: 1 (w / w). Grind blandingen til små partikler med en morter og støder (acceptabel gennem No. 50 USA standard test sigte). Brug jorden fødevarer, som bør være brunlig i farven, enten med det samme eller gemme den i en lukket beholder ved 4 C i flere uger.
  3. I et 1,5 ml rør, blande 6 mg jorden fødevarer med de tørrede nanopartikler fra afsnit 3.7 med en tandstikker.
  4. Tilsæt 30 pi 2% pre-smeltet agarose gel løsning på fødevare- nanopartikel blanding; røre omgående og grundigt ved hjælp af en tandstikker eller pipettespids.
  5. Brug gel indeholdende fødevarer og nanopartikler til straks fodre myggelarver. Alternativt, når gelen er fuldstændigt størknet ved stuetemperatur, opbevares gel ved 4 ° C og brug den næste dag eller ved -80 ° C til senere brug.

5. Fodring myggelarver med fødevarer, der indeholder Chitosan / interfererende RNA Nanopartikler

  1. Fodring A. gambiae myggelarver:
    1. Fjern en siNGLE gel pellet fra 1,5 ml rør ved hjælp af en tandstikker og skær den i 6 lige store skiver ved hjælp af en ren barberblad eller tandstikker.
    2. Transfer 20 tredje stadie larver til en 500 ml petriskål indeholdende 100 ml deioniseret vand.
    3. Feed myggelarver ved at tilføje en skive af gelen pellet (finthakket i mindre stykker) per petriskål gang om dagen i fire dage. Sørg for at overholde larver fodring på pillen, der bør reduceres betydeligt i størrelse eller helt fraværende ved den næste dag. Efter tid, vil myg udvikle sig sent fjerde stadium larver.
    4. Optag synlige fænotypiske ændringer i løbet af forsøget. Undersøg transkriptniveauer og andre fænotypiske ændringer som beskrevet i afsnit 6 i slutningen af ​​perioden på fire dag.
  2. Fodring A. aegypti myggelarver:
    1. Skær gel pellet i 6 lige store skiver ved hjælp af en ren barberblad eller tandstikker.
    2. Placer 50 aldersbetinget synkroniseres 24 timer efter æg klækning first instar larver i en petriskål i ≈40 ml deioniseret vand.
    3. Feed larver en skive per petriskål i 4 timer / dag, og derefter overføre larverne tilbage til den almindelige larvediæt 2: 1 ground fiskefoder flager og tørgær for resten af ​​dagen. Gentag dagligt hele fire larver instars.
    4. Undersøg transkriptniveauer og andre fænotypiske ændringer som beskrevet i afsnit 6 på de ønskede udviklingsmæssige tidspunkter.

6. Bekræftelse af Gene Knockdown

  1. Relativ transkript kvantificering af QRT-PCR i A. aegypti og A. gambiae larver.
    1. Udføre og analysere qRT-PCR-assays med tre biologiske gentagelser på mindst 10 sammenlagte kontrol vs. eksperimentel larver som beskrevet 11,19,20, eller i henhold til standard lab procedure. Repræsentative resultater er medtaget nedenfor.
    2. Til analyse af en bestemt vævstype / kropsdel ​​(dvs.., Hjerne eller antenne), Perform QRT-PCR, som beskrevet i 6.1.1 efter dissektion at inddrive vævet af interesse (se for eksempel Mysore et al. 21).
  2. Bekræftelse af knockdown ved in situ-hybridisering
    1. Syntetisere digoxygenin-mærket antisense og sense kontrol riboprober henhold til standard lab praksis eller som beskrevet 26.
    2. Udfør in situ hybridisering pr Haugen et al. 27 Protokol om bekræftelse af knockdown som beskrevet tidligere 11,20 og diskuteret i repræsentative resultater afsnittet nedenfor.
  3. Bekræftelse af knockdown ved immunohistokemi
    1. Hvis antistoffer mod proteinet af genet målrettet er til rådighed, udføre immunohistokemi som tidligere beskrevet 28, som letter identifikation af enkeltpersoner med de største niveauer af knockdown til fænotype-analyse 20 som eksemplificeret i representative resultater nedenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A. gambiae:

Chitosan / dsRNA nanopartikler dannet på grund af den elektrostatiske vekselvirkning mellem aminogrupper af chitosan og phosphatgrupperne af dsRNA. Effektiviteten af ​​dsRNA inkorporering i nanopartikler er sædvanligvis over 90% som målt ved udtømning af dsRNA fra opløsningen. Atomic force mikroskopi billeder viser, at chitosan-dsRNA partikelstørrelse gennemsnit 140 nm i diameter, der spænder fra 100 til 200 nm (figur 1).

Figur 1
Figur 1. Nanopartikel dannelse af chitosan og interfererende RNA. Atomic force mikroskopi billede af chitosan / dsRNA nanopartikler (A) eller chitosan opløsning uden tilsætning af dsRNA (B). Størrelsen af ​​de billeder, var 1,0 um x 1,0 um. Scale bar = 250 nm.e.com/files/ftp_upload/52523/52523fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Fodring af disse partikler, som er kombineret med standard larve mad og indarbejdet i agarose understøtter normal larveudvikling. Vigtigere specifik knockdown af ektoderm afledt AgCHS1 transkripter samt mellemtarmen-specifik AgCHS2 (figur 2) er mulig 19, viser, at dsRNA taget op gennem indtagelse af nanopartikler initierer RNAi ud mellemtarmen. Knockdown effektivitetsgevinster ≈40-60% blev observeret (f.eks., Figur 2), og varierer mellem udskrifter.

Figur 2
Figur 2. transkriptionsniveauer af chitinsyntase 2 (AgCHS2) efter dsRNA indtagelse i <em> A. gambiae larver. Relative mRNA niveauer af AgCHS2 i larver fodret med nanopartikler med ds AgCHS2 eller kontrol ds GFP. Data er præsenteret som middelværdi ± SD fra tre uafhængige biologiske replikater. Forskellige bogstaver på søjlerne angiver signifikante forskelle baseret på parrede t-tests (P = 0,003).

Knockdown af AgCHS1 væsentligt reduceret samlede chitin indholdet af fjerde stadium larver og øget modtagelighed til chitinsyntese inhibitor insekticid, diflubenzuron 19 Knockdown af AgCHS2 forøgede signifikant virkning Calcofluor hvid og dithiothreitol som forstyrrede peritrophic matrix (PM) i fjerde stadium larver (figur 3), hvilket resulterer i øget dødelighed 17.

Figur 3
AgCHS2 indtages nanopartikler på A. gambiae peritrophic matrix (PM) permeabilitet. Calcofluor hvid eller DTT behandling forstyrrer PM af A. (A) Mosquito med intakt PM. (B) Mosquito med forstyrret PM, dextran blå lækker i mavens ceacae gambiae larver, som yderligere exuberated af AgCHS2 knockdown gennem indtagelse af chitosan / dsRNA nanopartikler 19..

A. aegypti:

Chitosan / siRNA nanopartikler blev anvendt til at målrette axon vejledning gen semaphorin-1a (sema1a) under A. aegypti larveudvikling 20. Knockdown af sema1a blev bekræftet ved in situ-hybridisering, der har konstateret reducerede niveauer af sema1a i ≈60% af larvestadium hjerne røvsmelteostpro- og ikke har kunnet påvise sema1a udtryk i ≈40% af knockdown dyrehjerner (figur 4C vs. B, gul pilespids angiver antennal lap). QRT-PCR-assays udført på puljede hele dyr afslørede, at denne teknik resulterede i 32 ± 10% reduktion i sema1a transkripter sammenlignet med kontrol-nanopartikler fodrede dyr (figur 4A; P <0,01 baseret på parret t-test, n = 5, hvor N er antallet af biologiske replikater). Knockdown i hjernen varede gennem mindst 24 timer af puppe udvikling, som det fremgår af tabet af anti-Sema1a antistof ekspression (figur 4E1 vs. D1), som blev anvendt til at identificere dyr med betydelig knockdown under larver og puppe olfaktoriske fænotype analyser. Larver og puppe antennal lap defekter (kvantificeret i tabel 1) blev påvist i sema1a knockdown larver og pupper (Figur 4E2, E3 vs. (fig 4E2 vs. D2, visualiseret med mAbnc82; overlejringer af begge signaler er vist i figur 4D3, E3). Sammenlignelige fænotyper blev genereret med to separate sema1a knockdown siRNAs, hvilket var med til at sikre, at de konstaterede overtrædelser var ikke resultatet af off-site målretning af enten siRNA. De højeste niveauer af knockdown blev genereret, når siRNA'er blev kombineret, en strategi, der kan anvendes til at forøge knockdown effektivitet (se Mysore et al. 20 for flere detaljer).

Figur 4
Figur 4. Chitosan / siRNA inducerede knockdown af sema1a i udviklingen olfaktoriske system A. aegypti. QRT-PCR (A) og in situ-hybridisering (B, C) ​​assays bekræftede knockdown af sema1a i larver fodret med en blanding af sema1a målretning siRNA 890 og siRNA 1198 chitosan / interfererende RNA nanopartikler versus kontrol nanopartikler. Tab af Sema1a udtryk resulterede i glomeruli, som er deformeret (E1-3 vs. D1-3). Se tekst for detaljer. Dorsal er op i alle paneler. Scale bar = 25 um. Dette tal oprindeligt udkom i Mysore et al 20. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Larver Pupper
siRNA n <strong> Vildtype AL defekter n Vildtype AL defekter
Kontrol 69 69 (100%) 0 (0%) 68 68 (100%) 0 (0%)
sema1a KD 77 42 (54,5%) 35 (44%) * 75 51 (68%) 24 (32%) *

Tabel 1. Kvantificering af antennal lap defekter efter sema1a knockdown. En samlet oversigt over de opnåede resultater for kontrol siRNA vs. sema1a knockdown (KD) siRNA 890 + siRNA 1198 chitosan nanopartikler-fodrede dyr fra i alt otte replikat eksperimenter udført i både larver ( venstre) og pupper (til højre) er vist. Den samledeer angivet antal individer vurderes (n) og numre / procentdele af dyr, der udviser vildtype morfologi vs. antennal lap (AL) defekter (olfaktoriske receptor neuron rettet fejl, defekt neurofile og glomeruli dannelse). Knockdown blev verificeret immunhistokemisk med anti-Sema1a antistoffarvning i en undergruppe af dyr (15 larver og 10 pupper), der viste de mest alvorlige defekter (angivet med *). Alle knockdown dyr evalueret på denne måde viste sig at have reduceret niveauer af Sema1a, mens Sema1a niveauer i kontrol-fodres dyrene ikke er blevet mærkbart ændret. Denne tabel oprindeligt udkom i Mysore et al 20.

I en anden undersøgelse 21, chitosan / siRNA nanopartikler blev anvendt til at målrette transkriptionsfaktoren målbevidst (SIM) under udviklingen af det olfaktoriske system. QRT-PCR assays med poolede hjerner dissekeret fra hele dyr viste, at sim knockdown hjerner havde i gennemsnit en 47% reductipå SIM transkripter i sammenligning med kontrol nanopartikler-fodrede dyr (P = 0,005 baseret på parret t-test). Sammenlignelige analyser med antenner afsløret i gennemsnit en reduktion i sim niveauer 77% med hensyn til kontrol-fodrede dyr (p = 0,002 baseret på parret t-test). Trods en vis variation i niveauerne af knockdown mellem væv og dyr blev sim transkripter ikke påvist gennem in situ hybridisering i ≈50% af knockdown dyrehjerner / antenner efter behandling med enten to forskellige knockdown siRNAs (Figur 5B2, B3, C2, C3 vs. B1, C1, tabel 2). I gær adfærdsmæssige analyser hvorunder individer, der blev tiltrukket af gær blev tildelt en score på 1, mens dyr, der ikke er blevet tiltrukket fik en score på 0, gennemsnitlige scorer for sim 430 eller SIM var si 718 knockdown dyrgnificantly lavere end kontrol-fodrede dyr i to replikate eksperimenter (figur 5A; P <0,001 baseret på parret t-test). Defekt lugt-tracking adfærd (figur 5A) korreleret med reducerede niveauer af SIM i antenner (Figur 5B2, B3 vs. B1) og hjerner (figur 5C2, C3 vs. C1, gule prikker markerer omkredsen af antennal lap; se tabel 2 til kvantificering af resultater). Flere fejl blev identificeret i antennerne og antennal kamre af sim knockdown dyr (se Mysore et al 21. For detaljer). For eksempel, sim knockdown larver og pupper manglede ekspression af Orco den obligat co-receptor for alle lugtstofreceptorer i olfaktoriske receptor neuroner (figur 6). Reducerede ORCO transkriptniveauer blev påvist hos personer fodret med sim 430 ( Figur 6A3, B3) eller SIM 718 (figur 6A4, B4) knockdown (KD) chitosan / siRNA nanopartikler (sammenlignet med vildtype dyr i figur 6A1, B1 og kontrollere chitosan / siRNA nanopartikler-fodrede dyr i figur 6A2, B2). Tabet af Orco ekspression fænotype observeret i L4 larver (figur 6A1-A4) varede gennem mindst 24 timer efter puppe dannelse (Figur 6B1-B4).

Figur 5
Figur 5. sim knockdown larver show defekt lugt-tiltrækkende adfærd. In situ hybridisering afslørede reducerede niveauer af sim RNA i antenner (B2, B3) og hjerne (C2, C3) i sim 430 og sim 718 knockdown dyr (sammenlign for at styre-fed i B1, C1), der har undladt at reagere på gær lugtstof lokkemiddel (A). Se tekst for detaljer. De proximale ender af antenner er orienteret opad i B1-B3. Dorsal er orienteret opad i C1-C3. Scale bar = 25 um. Dette tal oprindeligt udkom i Mysore et al 21. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Tab af Orco udtryk i udviklingslandene A. aegypti antenne efter knockdown af sim. reducerede niveauer af Orco udskrift blev påvist i individer fed med sim 430 (A3, B3) eller SIM 718 (A4, B4) knockdown (KD) chitosan / siRNA nanopartikler (sammenlign med vildtype dyr i A1, B1 og kontrollere chitosan / siRNA nanopartikler-fodrede dyr i A2, B2). Se tekst for detaljer. Scale bar = 25 um. Dette tal blev indsamlet fra billeder, der er offentliggjort i Mysore et al 21. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Tiltrukket Ikke tiltrukket
siRNA n # Dyr Normal Moderat Null # Dyr Normal Moderat Null
Kontrol 195 196 (100%) 196 (100%) 0 0 0 0 0 0
sim 430 KD 176 63 (35%) 48 (76%) 15 (24%) 0 113 (64%) 20 (18%) 12 (11%) 81 (71%)
sim 718 KD 177 66 (37%) 44 (66%) 22 (34%) 0 111 (63%) 20 (18%) 9 (8%) 82 (74%)

Tabel 2. Niveaus af sim korrelere med larver præstation i en gær adfærdsmæssige analyse. En samlet oversigt over resultaterne fra fire gær lugtstof tiltrækningsstof replikere eksperimenter er vist. Det samlede antal af dyr (n) angiver antallet af individuelle larver, der blev testet i disse adfærdsmæssige assays. Antallet af individuelle larver (# dyr), der blev tiltrukket (venstre, dyr, rørt gæren pellet og blev tildelt en score på 1) eller ikke tiltrukket (højre, dyr, der ikke rører gær pellet og modtog en score på 0) under hver betingelse (Control, sim 430 KD, eller sim 718 KD chitosan / siRNA nanopartikel-fed) er vist, og andel af den samlede dyr indgår efter de rå tal. Knockdown af sim blev vurderet ved in situ-hybridisering i hjerner og antenner dyr tiltrukket (venstre) eller ikke tiltrukket (højre) til gær. Denrå antal / procentdel af personer med normal (sammenlignelig med vildtype-sim transkriptniveauer) Null (ingen observerbar sim afskrift), eller moderat (reduceret, men ikke vild type) er angivet sim niveauer. Tab af sim korrelerede godt med manglende tiltrækning til gær. Denne tabel oprindeligt udkom i Mysore et al 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Chitosan / interfererende RNA nanopartikel metode beskrevet heri er blevet anvendt effektivt til at målrette gener under larveudvikling i A. gambiae (figur 2, 3) og A. aegypti (figur 4, 5, 6, tabel 1, 2). Chitosan nanopartikler kan fremstilles med enten lang dsRNA eller siRNA, som begge er blevet anvendt med succes i myg som det fremgår af repræsentative resultater, der er beskrevet heri. Syntese af dsRNA er billigere end at købe siRNA, men er mere arbejdskrævende. Hvis chitosan / siRNA bruges, kan fænotyper bekræftes med flere siRNA'er, giver mulighed for bedre sikkerhed for, at fænotype afsløret ikke skyldes off-site målretning. Ligeledes kan den kommercielle produktion af siRNA'er massevis bedre lette udvidelsen af ​​chitosan / interfererende RNA silencing for artsspecifik myg til feltet. Dette vil naturligvis kræve overvinde obstacykler som omkostninger og levering.

Selvom vi har haft god succes med denne protokol, skal metoder optimeres for hvert gen. Derfor anbefaler vi at teste flere siRNA'er, eller måske et siRNA og en lang dsRNA, ved begyndelsen af ​​et nyt projekt. Når fænotyper er identificeret og bekræftet med mindst to distinkte siRNA'er svarende til et gen af interesse, kan det være nyttigt at kombinere disse siRNAs at øge fænotype penetrans (figur 4). Timingen og også varigheden af chitosan / interfererende RNA fodring tid kan optimeres til hver undersøgelse. A. gambiae trives, når fodret kun med chitosan / interfererende RNA fødevarer som beskrevet heri. Men i de eksperimenter, vi har udført til dato, A. aegypti har ikke klaret sig godt uden supplerende ernæring, et problem, vi har overvundet ved at overføre dem til en diæt af normal mad efter 4 timer af chitosan / interfererende RNA fodring. Eksperimenter med chitosan / interfererendeRNA levering i en anden fødevare substrat, som vi endnu ikke har forsøgt, kan omgå dette problem. Vi har fundet, at 4 h daglige fodringer i løbet af flere dage resulterer i en god balance mellem knockdown og tilstrækkelig ernæring, men ændring af varigheden af ​​fodringen kunne videreføres som ønsket. Desuden kan larvernes stadium, hvor chitosan / interfererende RNA nanopartikel fodring initieres / fortsat skræddersys til hvert eksperiment afhængigt kritiske udviklingsmæssige periode, hvor genfunktion undersøges, en stor fordel i denne protokol.

Verifikation af knockdown er selvfølgelig kritisk, men kan også kræve fejlfinding. Af denne grund kan det være nyttigt at samtidig kontrollere, om fænotyper af interesse bliver genereret som knockdown effektivitet bliver vurderet. For QRT-PCR validering eksperimenter, er det afgørende, at primere og PCR-betingelser optimeres. Desuden er det vigtigt, at dyrene er udviklingsmæssigtsynkroniseres ved begyndelsen af eksperimentet, som ekspression af nogle transkripter kan være meget dynamisk under udviklingen og på grund af døgnrytmen 29. Desuden, mens denne teknik klart genererer knockdown over tarmen, vi er kun lige begyndt at vurdere de væv, som denne teknik er effektiv, og kan variere blandt arter. Det vil derfor være nyttigt at måle knockdown i bestemte væv, som kan opnås ved at dissekere væv af interesse fra hele dyr for QRT-PCR-analyser eller gennem in situ hybridisering (figur 4-6) 20,21 og immunhistokemi (Figur 4) 20 assays (se Haugen et al. 27 og Clemons et al. 28, henholdsvis for fejlfinding disse protokoller). Da knockdown varierer fra person til person, er det nyttigt at udføre dobbelt-mærkning assays til vurdering fænotyper i kombination med knockdown niveauer (FiguAd 4) 20, hvilket i høj grad letter fænotype karakterisering. For adfærdsmæssige undersøgelser, kan knockdown niveauer i enkelte dyr korreleres med deres adfærdsmæssige forestillinger (tabel 2) 20,21.

Efter chitosan-medieret interfererende RNA levering til A. aegypti larver, nedsættes genekspression detekteres ved 24 timer af puppe udvikling (figur 4, 6) 20,21. Selvom niveauer af genekspression er endnu ikke blevet vurderet på detaljeret vis ud over dette punkt i udviklingen, er påvist reducerede niveauer af genekspression i både 48 og 72 timer A. aegypti pupper (KM, upubliceret). Det ville være nyttigt at forfølge mere detaljerede analyser af knockdown niveauer på flere stadier af A. aegypti puppe udvikling, og at bedømme A. gambiae pupper. Det ville også være interessant at bestemme, om knockdown fortsætter hos voksne og udforske nanopartikel-medieret iterfering RNA levering strategier for voksne myg.

Stedspecifik nuklease gen målretningsmetoder nylig introduceret til A. aegypti og A. gambiae og tillader generation af målrettede, arvelige mutationer i myg og andre ikke-genetiske modelorganismer 30,31. Selvom brugen af ​​disse metoder giver mere ensartet tab af funktion fænotype analyser, en fordel i forhold RNAi metoder, screening for mutationer af interesse er stadig temmelig tidskrævende og arbejdskrævende. Selv RNAi tab af funktion studier kræver vedligeholdelse af kun vildtypestammer, mutant myg stammer skal være individuelt opdrættet. Opretholdelsen af ​​recessive letale eller voksne sterile mutationer i øjeblikket udfordrer betragtning af den nuværende mangel på afmærkede udligningsanordninger i myg. Således, mens site-specifik nuklease gen-targeting strategier er hurtigt stigende popularitet, chitosan / interfererende RNA målretning kan være den optimalevalg til laboratorier der ikke er udstyret til at opretholde myg stammer og i tilfælde, hvor tab af genfunktion under udviklingen er uforenelig med overlevelse af stammen.

Baseret på vores resultater, vi forventer, at chitosan / interfererende RNA kan bruges bredt til knockdown af mange forskellige gener under udviklingen af A. gambiae, A. aegypti, samt andre insekter og potentielt andre ikke-genetiske modelorganismer. Vellykket gendæmpning med chitosan / interfererende RNA er blevet rapporteret i andre leddyr arter, herunder Penaeus monodon (rejer) 32. En nylig undersøgelse viste, at nanopartikler fremme udbredelsen af dsRNA og dermed styrke den knockdown effektivitet i forhold til direkte fodring af dsRNA i den asiatiske cornborer 33, hvilket understreger potentialet for at bruge denne teknologi til at målrette landbruget skadedyr. Den mulige anvendelse af siRNA-nanopartikler som terapeutiske hos mennesker er at tiltrække en stor of interesse i den medicinske verden. Giljohann et al. 34 beskrev syntese og karakterisering af polyvalente RNA-guld nanopartikler konjugater, som har en seks-fold længere halveringstid end frie dsRNA og let trænger ind i celler. Davis et al. 35 beskrevne første humane kliniske forsøg med systemisk administration af siRNA'er bruger nanopartikel leveringssystem til patienter med solide tumorer, og muligheden for at anvende chitosan / siRNA terapeutiske blev for nylig revideret 36. Således chitosan / interfererende RNA gen-targeting teknologi er en værdifuld laboratorieteknik med potentiale for bredere anvendelser. Fremtidig forskning vil undersøge yderligere applikationer til denne teknik. Desuden kemisk modifikation af chitosan og andre polymerer, et aktivt forskningsområde, kan øge effektiviteten af interfererende RNA levering eller tillade målrettet levering til specifikke væv 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.02 ml pipetteman Rainin PR20 for resuspension of interfering RNA
0.2 ml pipetteman Rainin PR200 for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
0.5 ml graduated tube  Fischer Scientific 05-408-120 for aliquoting resuspended interfering RNA
1 ml pipetteman Rainin PR1000 for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
1.5 ml graduated tube  Fischer Scientific 05-408-046 for preparation of interfering RNA/nanoparticles
1M Sodium Acetate, pH 4.5 TEKnova S0299 to prepare sodium acetate buffer
Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade BDH VWR BDH3092-500MLP to prepare sodium acetate buffer
Agarose Genetic Technology Grade MP Biomedicals LLC. 800668 to coat prepared interfering RNA/nanoparticles
Centrifuge Eppendorf AG 5415D to pellet interfering RNA/nanoparticles
Chitosan, from shrimp shells Sigma-Aldrich C3646-25G to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles
Dry Yeast Universal Food Corp NA to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
E-RNAi tool German Cancer Research Center NA for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
goldfish food Wardley Goldfish FLAKE FOOD to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles
Heated water bath Thermo Scientific 51221048 to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC
Ice not applicable not applicable for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles
Name Company Catalog Number Comments
Ice bucket Fisher Scientific 02-591-44 for storage of ice used during the procedure
liver powder MP Biomedicals LLC. 900396 to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment
Microwave oven A variety of vendors not applicable to prepare 2% agarose solution
petridish (100 x 15 mm) Fischer Scientific 875713 interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae
pH meter Mettler Toledo S220 for preparation of buffers
Razor blade Fischer Scientific 12-640 to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings
siRNA Thermo Scientific/Dharmacon custom for preparation of siRNA/nanoparticles
Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4) BDH/distributed by VWR VWR BDH0302-500G to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended
Thermometer VWR 61066-046 to measure the water bath temperature
Tooth picks VWR 470146-908 for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets
Ultralow freezer A variety of vendors not applicable for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC
Vortex mixer Fischer Scientific 02-216-108 for preparation of chitosan/interfering RNA
Weight paper Fischer Scientific NC9798735 to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malaria. , World Health Organization. http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
  2. Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. http://www.cdc.gov/dengue/ (2014).
  3. Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).
  4. Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).
  5. Wise de Valdez, M. R., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).
  6. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).
  7. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  8. Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions. Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).
  9. Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).
  10. Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
  11. Clemons, A., et al. siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development. PLoS One. 6 (1), e16730 (2011).
  12. Haugen, M., et al. Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development. PLoS One. 6 (6), e21694 (2011).
  13. Nguyen, C., et al. Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti. EvoDevo. 4 (1), 9 (2013).
  14. Sarro, J., et al. Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).
  15. Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. J Insect Sci. 13, 69 (2013).
  16. Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae. Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).
  17. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).
  18. Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).
  19. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).
  20. Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a. PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215 (2013).
  21. Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC developmental biology. 14 (1), 9 (2014).
  22. Dass, C. R., Choong, P. F. Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy. Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).
  23. An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).
  24. Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
  25. Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).
  26. Patel, N. H. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. PA, K. rieg , Wiley-Liss. (1996).
  27. Haugen, M., et al. Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), Cold Spring Harb Protoc. (2010).
  28. Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).
  29. Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).
  30. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  31. Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs. Methods. 69 (1), 38-45 (2014).
  32. Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus. Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).
  33. He, B., et al. Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests). Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).
  34. Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).
  35. Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).
  36. Molinaro, R., et al. Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors. Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).
  37. Singha, K., et al. Polymers in small-interfering RNA delivery. Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).

Tags

Molekylærbiologi vektor biologi RNA-interferens, DsRNA siRNA knockdown indtagelse myg larver udvikling sygdom
Chitosan / interfererende RNA Nanopartikel medieret gendæmpning i Disease Vector myggelarver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, X., Mysore, K., Flannery, E., … More

Zhang, X., Mysore, K., Flannery, E., Michel, K., Severson, D. W., Zhu, K. Y., Duman-Scheel, M. Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (97), e52523, doi:10.3791/52523 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter