Summary
인간의 뇌 척추 액체 (CSF)에 내 인 성 펩 티 드의 질량 spectrometric 분석 하는 방법을 제시 합니다. 채용 함으로써 분자량 컷오프 필터링, 크로마 사전 분류, 대량 spectrometric 분석 및 펩 티 드 식별 전략의 후속 조합, 그것은 거의 10 배 비해 알려진된 CSF peptidome 확장 가능 이전 연구입니다.
Abstract
이 프로토콜 인간의 뇌 척추 액체 (CSF)에 내 인 성 펩 티 드를 식별 하기 위해 개발 하는 방법을 설명 합니다. 이 위해 이전 개발된 방법 분자량 컷오프 (MWCO) 여과에 기반 하 고 대량 spectrometric 분석 오프 라인 높은 pH 역 상 HPLC 사전 분류 단계와 결합 되었다.
CSF로 분 비 중추 세포에 의해 창 고 분자의 제거를 위한 주요 통로 이다. 따라서, 중앙 신경 시스템에 많은 프로세스 CSF, 그것에 게 귀중 한 진단 유체 렌더링에 반영 됩니다. CSF는 8-9 배나의 농도 범위에 걸쳐 있는 단백질을 포함 하는 복잡 한 구성, 있다. 단백질, 게다가 이전 연구 또한 내 인 성 펩 티 드의 많은 수의 존재를 증명 하고있다. 단백질 보다 덜 광범위 하 게 공부 하는 동안이 또한 생체로 잠재적인 관심을 고정할 수 있습니다.
내 인 성 펩 티 드 MWCO 여과 통해 CSF 단백질 함량에서 분리 되었다. 샘플에서 대부분의 단백질 콘텐츠를 제거 하 여 공부 샘플 볼륨 및 그로 인하여 또한 내 인 성 펩 티 드의 총 금액 증가 가능 하다. 침투 펩 티 드 혼합물의 복잡성 역 위상 LC MS 분석 전에 알칼리 pH에서 (RP) HPLC 사전 분류 단계를 포함 하 여 해결 했다. 분류는 결합 되었다 60 분수 12에 풀링된 했다 간단한 연결 계획, 분석 시간 소비 함으로써 감소 될 수 있었다 아직도 크게 공동 차입을 피하고 있는 동안.
자동화 된 펩 티 드 식별 3 가지 펩타이드/단백질 식별 소프트웨어 프로그램을 사용 하 고 이후 결과 결합 하 여 수행 되었다. 다른 프로그램 보완 보다는 세 사이 겹쳐 식별의 15%와 비교 했다.
Introduction
뇌 척추 액체 (CSF)에서 생체 신경 퇴행 성 질환으로 현재 연구를 변형 시키고 있다. 전세계1,2, 펩 티 드 아 밀 로이드 베타 단백질 타우 microtubule 안정화의 구성 된 바이오 마커 triplet 사람들은 Alzheimer의 질병, 60 백만 이상에 영향을 미치는 가장 일반적인 신경 장애, 그리고 phosphorylated 타우 형태, 높은 감도와 특이성, 질병을 검색할 수 있습니다 및 진단 연구 조건3에 포함 되었습니다. 다른 신경 퇴행 성 질환, 파 킨 슨 병, 다 발성 경화 증 등에서 proteomic 연구의 일부는 현재 임상 연구4,5 에서에서 평가 받고 있다 수많은 바이오 마커 후보 식별 6.
CSF에는 단백질, 함께 내 인 성 펩 티 드7,8,9,10,,1112의 풍부한을 또한 포함 되어 있습니다. 많은 두뇌 파생 된 단백질의 분열 제품 구성, 이러한 펩 티이 드 또한 질병 biomarkers의 잠재적으로 중요 한 소스를 나타냅니다. 인간 CSF에서 확인 된 내 인 성 펩 티 드의 재고 증가 및 CSF endopeptidomic 분석 임상 연구에 사용, 방법 개발 샘플 준비 및 LC MS 분석 (간단한 프로토콜 스키마에에서 포함 된 그림 1 ). 최근 연구에서이 방법의 응용 확대 알려진된 CSF endopeptidome ten-fold13일반적인 진단의 몇몇 개인에서 풀링된 CSF 샘플에 거의 16,400 생 CSF 펩 티 드의 식별에 결과. 메서드를 선택적으로 정량화를 위한 isobaric 라벨 방식으로 함께에서 사용할 수 있습니다.
샘플 준비
CSF 단백질 질량의 주요 소스는 플라즈마 성분 (알 부 민 및 면역 글로불린) 혈액 두뇌 방 벽14,15위에 통과. 그들의 높은 풍부 낮은 풍부 하 고, 두뇌 파생 샘플 구성 요소 검색에 지장을 초래할 수 있습니다. 내 인 성 펩 티 드를 쉽게 따라서 낮은 풍부한 펩 티 드의 탐지 하도록 LC MS 분석에 사용할 CSF 펩타이드 추출의 훨씬 더 큰 볼륨을 수 있도록 높은 풍부한 단백질에서 분리 수 있습니다.
여기에 제시 된 프로토콜에서 분자량 (MWCO) 잘라 여과 단백질 분수;에서 CSF 펩 티 드를 분리 사용 되었다 몇몇 이전에 사용 된 방법8,,910,11,,1216공부 한다. 여과 단계는 높은 pH 모바일 위상 그라데이션을 통해 오프 라인 RP HPLC 사전 분류 단계에 선행 되었다. 주요 구별 되 고 ph에 두 RP HPLC 단계를 수행 하 여 두 단계 사이의 선택의 차이 다른 펩 티 드 충전 상태 결과로 변경 된 펩 티 드 보존에서 주로 발생 합니다. 산 성 조건 하에서 LC-MS 전에 높은 pH 펩 티 드 사전 분류의 응용 프로그램 펩 티 드 식별17,18, 증가에 되도록 우수한이 목적을 위해 복잡 한 생물 학적 효과 입증 샘플 더 직각 분리 모드19, 강한 고양이-이온 교환 (SCX)와 RP20에 비해. 분석 시간 단축, 연결 체계를 사용 되었다, 모든 12번째 분수 (예를 들어, 분수 1, 13, 25, 37, 및 49), RP HPLC의 높은 분해능으로 인해 여전히 크게 다른 펩 티 드의 공동 차입을 피할 수 있는 풀링 LC-MS에서 분수20,21단계.
펩 티 드 식별
Peptidomic 연구에서 펩 티 드 식별이 다릅니다 proteomic 연구의 아무 효소 분열 데이터베이스 검색에 지정할 수 있으며 식별 요금은 일반적으로 낮은11는 결과적으로. 최근 연구13 했다 내 인 성 펩 티 드로 얻은 Sequest 및 마스코트에 대 한 식별 요금 각각 소프트웨어 프로그램의 알고리즘을 득점 하는 기본 적응 점수를 사용 하 여 수정 된 때에 상당히 개선 했다 여과기, 내 인 성 펩 티 드에 대 한 최적의 점수 알고리즘 tryptic 펩 티 드13의 다 나타내는 알고리즘입니다. 연구, 식별 소프트웨어 봉우리 (BSI)를 사용 하 여 자동 펩타이드 de novo 연속에 따라 두 조각 이온 지문 기반 검색 엔진에 무료 발견 했다, 그의 훨씬 더 큰 집합에서 결과 확인 펩 티 드입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
아래에 설명 된 프로토콜은 많은 양의 내 인 성 펩 티 드 인간 CSF15에 발견 했다 이전 연구에서 사용 되는 것의 세련 된 버전입니다. 원래 프로토콜에 대 한 업데이트 CSF의 화학 사전 처리에 사소한 변경 뿐만 아니라 오프 라인 높은 pH RP HPLC 사전 분류에 사용 되는 그라데이션의의 최적화를 포함 한다.
윤리적인 고려 사항
스웨덴 환자 및 제어 자료의 모든 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다: 세인트 예란 (참고 2005-554-31/3). 암스테르담 치 매 코 호트에서 CSF 샘플 및 신경과 신경외과, 런던 국립 병원에서 수집 된 샘플 모든 참여 환자 로부터 서 면된 동의와 승인 지역 윤리 위원회에서 연구를 위해 사용 되었다. 여기 주로 활용 자료 진단 목적 샘플에서 왼쪽 위에 CSF 이루어져 있고 우리의 연구에 포함 되 고 전에 취소 확인 했다. 다시 개별 기증자 또는 기증자의 그룹 샘플 추적의 아무 가능성도 있다.
1. 인간의 뇌 척추 액체 (CSF)의 추출:
- 허리 빵 꾸 (훈련 된 의사에 의해 수행 되어야 합니다)를 통해 CSF를 추출22표준화 된 프로토콜 사용 하 여.
- 20 분 동안 2500 x g에서 원심 분리 하 여 세포 파편 및 다른 비 녹는 물자를 제거 합니다.
- 시각적으로 혈액 오염 펑크 출혈에서 결과 나타낼 수 있는 변색에 대 한 CSF 샘플을 검사 합니다. 혈액과 프로 테아의 존재에서 상당히 높은 단백질 농도 분석 결과 크게 영향을 미칠 수 있습니다.
2. 사전 처리의 CSF (1.5 mL 샘플 볼륨, 아니 부 량):
- 녹여 실 온 (RT)에서 CSF aliquots의 1.5 mL, 10 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 내용을 전송 및 버퍼링 요원으로 1 M Triethylammonium 중 탄산염 (TEAB)의 80 µ L를 추가.
- 0.65 mL 8 M guanidinium 염 산 염 (GdnHCl)를 추가 (활성 농도 GdnHCl: 2.4 M) 및 10 분에 대 한 실시간에 부드럽게 소용돌이.
참고: chaotropic 에이전트, GdnHCl, 모두 용 매 점도 영향을 미치는 고 단백질 전개 되는 정력적으로 호의 베푸는23결과 polypeptide 사슬 상호 작용. 따라서, GdnHCl 단백질 집계를 녹이 고 여과 하는 동안 내 인 성 펩 티 드의 복구를 증가 한다. - 60 µ L의 수성 200 m m의 추가 tris(2-carboxyethyl) phosphine 염 (TCEP) (활성 농도 TCEP: 6 m m)과 시스테인 아를 줄이기 위해 1 h 55 ° C에서 품 어.
- 400 m m iodoacetamide (IAA)의 35 µ L를 추가 (활성 농도 IAA: 4 m m)와 알 시스테인을 30 분 동안 어둠 속에서 RT에서 품 어. 알 킬 그룹의 추가 시스테인 잔류물 형성할 수 없습니다 자연스럽 게 새로운 이황화 다리 어떤 시점에서 후속 견본 준비 동안을 보장 합니다.
- -이온된 수와 짧게 MWCO 여과, 5.5 mL의 총 샘플 볼륨 결과 전에 샘플을 희석 하는 소용돌이의 3.25 mL를 추가 합니다. 이 단계 높은 농도 때로는 필터 장치에서 고분자 물질의 침 출을 관찰로 1m 아래에 GdnHCl을 희석 하는 역할.
3. 사전 처리 CSF (10 x 150 µ L 샘플 볼륨, Isobaric 라벨 정량화)의:
- RT에서 10 개인에서 CSF aliquots의 150 µ L를 녹여 이후 개별 1.5 mL 낮은 바인딩 마이크로 원심 관에 콘텐츠를 전송 하 고 버퍼링 요원으로 1 M TEAB의 8 µ L를 추가.
- 8 M GdnHCl의 65 µ L를 추가 (활성 농도 GdnHCl: 2.4 M) 및 10 분에 대 한 실시간에 부드럽게 소용돌이.
- 수성 TCEP의 200 m m의 6 µ L를 추가 (활성 농도 TCEP: 6 m m)과 시스테인 아를 줄이기 위해 1 h 55 ° C에 외피.
- 3.5 µ L 400 m m 수성 IAA를 추가 (활성 농도 IAA: 6 m m)와 알 시스테인 RT 30 분 동안 어둠 속에서 품 어.
- Isobaric 라벨 키트를 준비 (예., 탠덤 질량 태그 10plex isobaric 라벨 시 약). RT 시 약 불필요 일 분을 방지, HPLC 급 이기 (AcN)의 41 µ L을 추가 하 고 5 분에 대 한 부드러운 교 반에 의해 해산을 그들을 열기 전에 도달 isobaric 라벨-시 약 병을 허용 합니다.
- Isobaric 라벨-시 약 해결책의 30 µ L 해당 샘플을 전송 하 고 부드러운 동요에서 RT에 1 시간에 품 어. Isobaric 라벨 시 뿐만 아니라 리 진 잔류물 펩 티 드의 N termini에 1 차 아민으로 반작용 하는 NHS 에스테 르 그룹을 포함 합니다.
- 5 %hydroxylamine 8 µ L를 추가 (활성 농도 hydroxylamine: 0.16%) 라벨 반응을 풀기 위해 20 분에 대 한 실시간에 부드럽게 흔들어. 별도로 이라는 샘플 결합 될 수 있기 때문에, 확인 라벨 반응 침묵 이다. Hydroxylamine 형태의 아민 그룹의 풍요로 움의 추가에 의해 나머지 isobaric 라벨 시 약 반응을 허용 되 고 따라서 비활성 렌더링 됩니다.
- 각 단일 15 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 10 이라는 개별적으로 샘플의 내용을 결합 합니다.
- 결합 된 샘플을 짧게 AcN 농도 12%에서 3%를 줄이기 위해 소용돌이 드 이온된 수의 6.4 mL을 추가 하 고 GdnHCl 농도를 높은 농도로 1m 아래에 GdnHCl 때때로 고분자 물질의 침 출을 관찰 되었습니다. 필터 장치.
4. 분자량 컷오프 여과
- 오염 물질, 상태는 MWCO 수성 1 M GdnHCl, 25 mM TEAB 및 g와 RT x 2500에서 15 분 동안 centrifuging 10 mL 로드 하 여 필터링 하는 잠재력을 제거 하려면, 삭제는 자형 (피트).
- 필터의 전체 샘플 볼륨을 로드 (5 mL 비 셔 서 CSF (2.5 단계) 또는 10 mL isobarically 셔 서 CSF (단계 3.9)) x g와 RT, 2500에서 30 분 두고는 자형 (피트) 컬렉션 컨테이너에 대 한 원심과. 여과의 결과 펩 티 드 및 작은 단백질에서 더 큰 단백질 및 잔여 셀 구분 됩니다. 이 단계는 proteomic 실험에서 펩 티 드를 생성 하기 위해 단백질의 분해 소화의 사용에 해당 peptidomic로 볼 수 있습니다.
- 펩 티 드의 복구를 향상 시키기 위해 필터와 g x 2500에서 15 분 동안 원심 분리기에 (수성) TEAB와 RT, 25 m m의 5 mL을 로드 합니다.
- 소용돌이 앞의 두 단계 (비 분류의 총 10 mL 또는 15 mL isobarically 표시 샘플)에서 결합된 FTs 샘플 산성화를 진행.
5. 드 사용 및 샘플 정리 고체 상 추출 하 여
- 4.4 이전 고체 상 추출 (SPE) 단계에서 필터링 된 샘플 시 어 지 다. 산성화 SPE 카트리지의 고정 단계와 용액 (펩타이드) 상호 작용을 개선 하기 위해 수행 됩니다.
- 비 셔 서 샘플 (볼륨 10 mL): 추가 1 %Trifluoroacetic 산 (TFA)-샘플의 총 볼륨의 550 µ L: 0.05 %10.55 mL TFA.
- Isobaric 표시 샘플 (볼륨 15 mL): 추가 20 mL 0.1 %TFA 하 시 어 지 다 고 낮은 AcN 농도 3%에서 1%-샘플의 총 볼륨: 0.066 %30 mL TFA.
참고: TFA는 또한 그것의 기능에 대 한으로 추가 이온 쌍 시 약, 스스로 SPE 카트리지 유지를 포장 재료와 함께 충분히 강한 소수 성 상호 작용의 펩 티 드의 보존을 향상. - 만약 pH > 3, 적정 인산 20%와 샘플 샘플 pH는 때까지 < 3.
- 84 %AcN, 0.1% 개미의 산 (FA), 그리고 삭제는 피트를 한 번 반복의 1 mL의 추가 의해 SPE 카트리지를 조건. 카트리지 필터의 컨디셔닝 후속 단계;에서 펩 티 드 함께 elute 그렇지 않으면 것입니다 원치 않는 물질을 제거 하는 데 필요한 또한, 필터의 증가 침투성 컨디셔닝.
- 0.1의 1 mL의 추가 의해 SPE 카트리지 equilibrate %TFA, 피트 반복을 한 번 삭제. 필터는 마지막 평형 단계-후 건조 실행 되지 않습니다 확인 필터 위에 작은 볼륨을 유지. 카트리지 필터의 평형 조절 단계에서 왼쪽 (이기) 소수 성 물질을 제거 하 여 펩 티 드를 유지 하기 위해 필터를 준비 하기 위해 수행 됩니다.
- 필요한 경우, 여러 부분에서 전체 샘플 볼륨 (10.55 mL 비 표시 샘플 또는 isobarically 표시 샘플 30 mL), 로드 하 고 피트 낭비로 실행 하자. 카트리지 로드 라운드 샘플 사이 건조 실행 하거나 후 마지막 샘플 볼륨-필터 위에 작은 볼륨을 유지 하지 않는 확인 하십시오.
- 0.1%의 1 mL를 통과 소금 및 시 약을 제거 하 고 한 번 피트 반복을 삭제 하는 필터를 통해 TFA. 카트리지-각 세척 단계 후 건조 실행 하지 않습니다 카트리지 위에 액체의 작은 볼륨을 유지.
- 장소 1.5 mL 낮은 바인딩 마이크로의 카트리지 아래 튜브 원심 및 84%의 1 mL를 전달 하 여 샘플을 elute AcN, 0.1%는 카트리지를 통해 FA.
- 증발, 건조까지 활성 난방-80 ° C에서 저장 하거나 높은 pH 분별에 즉시 진행 하지 않고 실행 진공 원심 분리기에 의해 드 소금된 샘플에서 용 제를 제거 합니다.
6. 오프 라인 높은 pH 역 상 HPLC 샘플 분류
-
수성 고-pH (HpH) 모바일 단계 준비:
HpH 버퍼 a: 순수한 물
HpH 버퍼 b: 84% AcN
HpH 버퍼 c: 25 mM NH4오
HpH 로드 버퍼: 2.5 m m NH4오, 2 %AcN
참고: 드레싱 로딩 버퍼 전송 솔루션 및 샘플 버퍼로 사용 됩니다. - 다시 20 분에 대 한 부드러운 교 반으로 16 µ L 드레싱 로드 버퍼에 샘플을 분해
- 96 깊은 잘 격판덮개 Batth 그 외 여러분 에 따르면 구성에 대 한 내부 분수 수집기 15 µ L HPLC 시스템에 샘플을 로드 사소한 변경으로 20 . PH-안정 분리 열 (C18 3.5 µ m, 2.1 m m x 250 m m) 100 µ L/min의 흐름에서 fractionate 고 선형 60 분 그라데이션 이상의 당 분 한 분수를 수집 합니다.
- 다음 그라데이션 시간-포인트를 사용 하 여: t = 0 분, B = 1%, C = 10%; t = 4 분, B = 1%, C = 10%, 시작 분수 컬렉션; t = 76 분, B = 70%, C = 10%; 끝 분수 컬렉션; t = 76.5 분, B = 85%, C = 10%; t = 80 분, B = 85%, C = 10%; t = 80.5 분, B = 1%, C = 10%, t = 90 분, B = 1%, C = 10%.
- 따라서 분수 12 분, 12 분수, 그 결과 각각 6 연결 된 하위 분수를 포함 하 여 간격을 연결 하는 순환 패턴에서 12 우물에서 반복 분수를 수집 합니다.
- 건조까지 RT와 3000 rpm에서 진공 원심 분리에 의해 샘플에서 용 매를 제거 하 고 이전에 LC MS 분석-80 ° C에서 샘플을 저장할.
7입니다. LC-MS
-
수성 모바일 단계 준비:
버퍼 a: 0.1% FA
버퍼 b: 0.1 %FA, 84% AcN
로딩 버퍼: 0.05 %TFA, 2 %AcN
참고: 버퍼 로드 전송 솔루션, 샘플 버퍼 및 모바일 단계 로드 펌프에 대 한 사용 됩니다. - 다시 버퍼를 로드 하 고 20 분에 대 한 실시간에 떨고 6 µ L의 추가 의해 각각 12 분수의 분해
- 나노 흐름 HPLC, 함정 열 구성에 부하 5 µ L 샘플 (함정 열: 75 µ m x 2 cm, C18, 100 Å의 기 공 크기, 3 µ m 입자 크기; 분리 칼럼: C18, 75 µ m x 500 m m, 100 Å의 기 공 크기, 2 µ m 입자 크기 다음 그라디언트를 사용 하 여 150 nL/min 흐름 속도로 펩타이드 분리 수행: t = 0 분, B = 2%; t = 10 분, B = 2%; t = 11 분, B = 7%; t = 100 분, B = 26%; t = 170 분, B = 45%; t = 175 분, B = 80%; t = 181 분, B = 2%, 및 t = 210 분, B = 2%.
-
나노-ESI 인터페이스를 통해 HPLC에 연결 된 고해상도 하이브리드 질량 분석기에 MS를 수행 합니다. 350-1400 m/z 범위 120000 (2.0e5 AGC 대상)의 해상도 설정에서 MS 모드에서 스캔 전체 스펙트럼을 기록 합니다.
- 데이터 종속 획득 모드에서 질량 분 서 계, m/z > 150와는 강도 범위 1.0e4-1.0e5 조각 이온 분석에 대 한 내는 상위 10 개의 가장 강렬한 봉우리에서 MS/MS 스펙트럼을 선택. 선구자 이온 60%에 1 m/z의 사중 극 자 격리 창, 100 ms와 RF 렌즈의 최대 주입 시간을 사용 하 여 격리 합니다.
- 15 제외 시간 동적 제외 적용 s 및 ± 10 ppm의 m/z 허용. 더 높은 충돌 에너지 분리 (HCD) 셀에 조각화 수행 하 고 50000 (5.0e4 AGC 대상 값)의 해상도 설정에서 orbitrap에 MS/MS 인수를 기록.
8. 펩 티 드 식별
-
펩 티 드 식별에 대 한 결과.raw-파일 대량 spectrometric 분석에서 다음과 같은 설정을 적용 하는 proteomics 검색 엔진에 제출:
참고: 이전에 연구15, 3 개의 검색 엔진; 마스코트 v2.4, Sequest HT와 봉우리 v7.5 병렬로 사용 하 고 여기에 지정 된 설정을 별도로 지정 하지 않는 한 모든 3 개의 검색 엔진에 대 한 고용 했다. 조정 가능한 설정의 대부분 펩타이드/단백질 식별에 대 한 보편적 이며 어떤 특정된 검색 엔진에서 해당 설정을 해야.
스펙트럼 선택:
분 선구자 질량: 350 Da
최대입니다. 선구자 질량: 5000 다
스캔 유형: 전체
신호/노이즈 임계값: 1.5
시퀀스 데이터베이스 검색
데이터베이스: UniProt_SwissProt [version2015_11]
분류: 호모 사피엔스
효소: 없음
최대입니다. 분열을 놓친: 0
악기 (마스코트만): ESI-트랩
분 펩 티 드 길이 (SequestHT만): 6
최대입니다. 펩 티 드 길이 (SequestHT만): 144
선구자 대량 허용 오차: 15 ppm
대중의 관용을 조각: 0.05 다
정적 수정: Carbamidomethyl (C); [분류] 하는 경우 TMT10plex (N-용어)
동적 수정: 산화 (M); [분류] 하는 경우 TMT10plex (K)
펩 티 드-스펙트럼 일치 (PSM) 유효성 검사기
여과기 (마스코트 및 Sequest HT만) 또는 미끼 퓨전 (봉우리만)
루즈벨트 대상: 0.01
유효성 검사에 따라: q 값
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
여기 설명 하는 방법은 적용 되어 있으며 샘플 사전 분류 (표 1)을 도입 하기 전에 세 가지 연구에서 평가. 첫 번째 연구는 MALDI 표적 격판덮개에 CSF 분수를 안보에 대 한 오프 라인 LC를 사용 하 고 730 확인 된 내 인 성 펩 티 드11결과. 두 다음 연구에서 isobaric 라벨 고용 되었다. 케이스/제어에 주로 식별 및 CSF endopeptidome에 프로테옴 잠재적인 생체의 특성에 대 한 동시에 연구24, 두 번째 연구 isobaric labelling에 치료 효과 vivo에서 모니터링 사용 되었다 36 h16이상의 CSF에 펩 티 드 식에서 γ-secretase 억제제의. 케이스/제어 연구에 437 내 인 성 펩 티 드 확인 되었다, 64의 농도와 개인 사이 크게 변경 된와 건강 한 컨트롤. 셋째, 치료 연구, 식별 1798 내 인 성 펩 티 드, 11 모니터링된 펩 티 드의 치료에 응답 보일 수 있었다.
4 연구 목표 식별 낮은 풍부한 펩 티 드에 특히 확인 된 CSF 펩의 수를 증가 했다. 따라서, 드레싱-RP 크로마토그래피에 의해 펩 티 드 사전 분류 포함 되었고 10 큰 CSF 샘플 볼륨 사용 되었다 16,395 펩 티 드의 결과로. 이 연구에서 수행 되었다 아무 isobaric 라벨. 샘플 분류, 뿐만 아니라 가장 최근의 연구 결과 결합 된 펩 티 드 id를 고용 접근, 처음 세 개의 연구에만 단일 데이터베이스 검색을 수행 했다, 반면 펩 티 드의 큰 숫자에 대 한 몇 가지 범위 계정을 확인. 사용 된 알고리즘은 어느 정도 상대적으로 작은 금액부터 무료, 15% 미만 (2440), 펩 티 드의 나타냅니다 가장 최근의 연구에서 개별 검색 엔진 (마스코트, Sequest HT 또는 봉우리)에 의해 얻은 결과 비교 모든 3 개의 검색 엔진 (그림 2)으로 식별 됩니다. 또한, 데 노 보-5400 펩 티 드 것 하지 확인 된 경우에 봉우리 왔다 보다 식별 내 인 성 펩 티 드, 하지만 더 효율적인 사용 검색 엔진 봉우리는 가장 시퀀싱 (그림 2). 같은 자료에 몇 가지 검색 엔진의 응용 잠재력이 여러 테스트 문제 고 식별 정확성13의 테스트와 해결이. 가장 최근 재판에서 proteomic 검색에서 모든 결과 뿐 아니라 인수 원시 MS/MS 데이터 되었습니다 사용할 수 있는 식별자 PXD004863와 ProteomeXchange 통해 자부심 데이터 저장소에.
그림 1: 방법의 주요 단계를 시각화 하는 프로토콜 구조. 요 추 찔린 뒤에 비 수용 성 재료, 2를 제거 하는 원심 분리 하 여 척수의 추출) 추가의 GdnHCl 샘플을 해리 펩 티 드 단백질 집계, 증가 내 인 성 펩 티 드;의 복구를 감소와 시스테인 아;의 알 isobaric 펩 티 드 정량화 (선택 사항) 3에 대 한 라벨) 분자 무게 여과 내 인 성 펩 티 드 단백질, 4에서에서 분리) 소금 및 다른 극 지 오염 물질, 5 제거 하 고체 상 추출) RP HPLC 사전 분류, 알칼리 성 모바일 위상 그라데이션 및 모든 12번째 분수의 연결 6) RP HPLC-MS/MS, 산 성 모바일 위상 그라데이션, 각 연결 된 분수 실행 연속적으로, 7)으로 모든 12 분석 실행에서 MS/MS 데이터를 제출 하 여 수행 하는 펩 티 드 식별을 검색 엔진에, 연속적으로 펩 티 드 Id 비교 했다 단일 샘플 및 모든 독특한 펩 티 드 Id의 합계를 수행 했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 연구 요약 | TMT 라벨 (y/n) | 드레싱-라인란트 분류 (y/n) | MS 분석 (µ l) 당 CSF의 해당 볼륨 | 확인 된 펩 티 드의 수 | 댓글 | 참조 |
| 답사 CSF peptidome 분석 | n | n | 500 | 730 | 오프 라인 LC MALDI 대상 준비, MALDI MS; MWCO 필터의 평가 | 4 |
| CSF 펩 티 드;의 양적 비교 8 광고에서 샘플 + 8 Ctrl | y | n | 200 | 437 | HPLC ESI MS; 결합 된 peptidomic 및 proteomic 프로토콜 | 25 |
| 광고 감마 secretase 억제제 치료 연구 | y | n | 300 | 1798 | HPLC ESI MS; CSF 치료 후 6 시간 지점에서 추출 | 17 |
| CSF peptidome 확장 | n | y | 750-1000 | 18.031 | HPLC ESI MS; 펩 티 드 식별 소프트웨어의 조합 | 15 |
표 1: 분자량 여과 및 인간 CSF에 내 인 성 펩 티 드의 식별에 대 한 대량 spectrometric 분석 적용이 그룹에 의해 수행 하는 최근 연구의 편집.
그림 2: 마스코트, Sequest HT와 봉우리 3 개의 검색 엔진의 각각에서 펩 티 드 식별 결과 비교 하는 벤 다이어그램 얻은. 16,395 내 인 성 펩 티 드의 총 확인 되었다. 드 노 보-내 인 성 펩 티 드 10,967; 확인 검색 엔진 봉우리 시퀀싱 조각-이온 지문 기반 검색 엔진 마스코트 고 Sequest HT 8118 및 7304 내 인 성 펩 티 드 각각. 모든 3 개의 검색 엔진 사이 식별 합의 2440 내 인 성 펩 티 드, 또는 14.8%에 도달 했다. 비교적 큰 식별 겹치는 마스코트 및 Sequest HT, 그들의 결합 된 펩 티 드 식별의 70%에 해당 했다. 봉우리는 비교적 작은 식별 했다 마스코트와 Sequest HT; 중복 20.5%와 18.9% 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
높은 pH RP HPLC 사전 분류 하는 단계 내 인 성 펩 티 드의 복구에 대 한 이전 개발된 프로토콜 분자량 외11 의 상대 샘플 복잡성을 감소 및 그로 인하여 5-fold 더 큰 허용 공부를 해야 샘플 볼륨. 이, 차례로, 각 분수에 펩 티 드의 부분 집합의 농도 증가 하 고 그로 인하여 낮은 풍부한 펩 티 드는 검출의 기회를 향상.
동시에 3 개의 proteomic 소프트웨어 고용 내 인 성 펩 티 드에 대 한 식별 전략을 수행 하 여 알려진된 CSF endopeptidome 이상 10 확장 가능 했다. 16,395 내 인 성 펩 티 드의 총 시료 풀링된 CSF에 예비 시험에서 확인 되었다. 식별 중 많은 수의 내 인 성 펩 티 드 단백질 신경 장애의 맥락에서 언급 이전에서 파생 했다. 위의 연구에서 확인 된 몇 가지 펩 티 드 현재 우리의 실험실에서 생체로 평가 되 고 있다. 이 프로세스가 합성 analogues 무거운 동위 원소를 저장 하는 동안 펩타이드 안정성 평가 대상된 대량 spectrometric 분석 실험의 설립으로 분류 된 CSF를 급상승 하 여 펩 티 드의 id 확인을 포함 하 여 여러 단계를 포함 하 고 동결-해 동 주기, 및 분석 다른 임상 동료.
수정은 MWCO 여과 동안 샘플에서 GdnHCl의 높은 농도 결과로 오염 (2.5 및 3.5 단계)의 소개를 피하기 위하여 원래 프로토콜을 했다. 사전 분류 그라데이션 (6.3.1 단계)에 대 한 업데이트 되었다, 용량 장기, 선형 그라디언트 사용 됩니다.
여기 설명 된 프로토콜에서 분석 손실의 주요 원인 두 RP 컬럼에 단계 뿐 아니라 MWCO 여과와 SPE 샘플 단계 정리 인할 수 있다.
펩 티 드 MWCO 필터와 여과 동안에, 유지 하는 단백질 상호 작용으로 인해 손실을 피하기 어렵다 고의 원천이 될 수 있습니다 샘플 변형 인터.
추가 선택적 손실 가능성이 RP 컬럼에 단계에서 발생 한다. 펩 티 드 hydrophobicity pH에 종속적 이기 때문에, 높고 낮은 두 연속 RP 컬럼에 단계에서 수행 pH, 각각, 이어질 수 있습니다 너무 친수성 열과 마찬가지로 두 번째에 유지 하려면 pH ≥9에 있는 펩 티 드의 부분 집합의 손실 하위 집합을 유지 하려면 pH ≤3에 너무 친수성입니다.
내 인 성 펩 티 드의 식별에 10 증가를 주도하 고 있다 사전 분류의 고용 이전에 사용한 방법에 비해. 그것은 이전 미확인된 펩 티 드의 많은 수의 성공적인 탐지를 위한 허용 했다 고 따라서 CSF peptidome 그리고 다른 복잡 한 생물 학적 샘플 뿐만의 탐사 연구에 귀중 한 도구 다.
멀티플렉스 isobaric 라벨 프로토콜 추가 CSF, 혈액과 뇌 조직에서 다양 한 신경 질환에 대 한 바이오 마커 후보를 식별 하기 위해 적용 될 것입니다 함께.
샘플 준비 단계에서 다양 한 복구에 기여 CSF 단백질 및 펩 티 드의 분석을 위한 분석 변형 LC 양 수행 isobaric 라벨 펩 티 드의 샘플 준비 감소에서 초기 단계에 의해 등의 영향 변이 크게. 이전에 보고 된 샘플 준비 프로토콜에 비해, 높은 pH 반전된 단계 펩 티 드 사전 분류의 구현 5 요인에 의해 확인 된 펩 티 드의 수를 증가. MS/MS 데이터에서 내 인 성 펩 티 드의 id는 다른 검색 알고리즘을 채용 하 여, 다른 펩 티 드 식별 소프트웨어 프로그램을 결합 하는 때 크게 개선 되었다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
아니 경쟁 관심사, 금융 또는 기타, 작가 사이 보고 되었습니다.
Acknowledgments
많은 Tanveer Batth와 동료 조언 사전 분류 방법 설정에 대 한 감사 합니다.
이 작품에서 스웨덴 연구 위원회는 Wallström 및 Sjöblom 재단, 총 및 베 Stohne 기초 Stiftelse, 매 그 너 스 Bergwall 재단, Åhlén 재단, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen 염 자금에 의해 지원 되었다 Gamla Tjänarinnor는 크누트와 앨리스 발 렌 버그 재단, Frimurarestiftelsen을 FoU 서쪽 Götalandsregionen.
이 프로젝트에 대 한 자금 지원의 주요 받는 Kaj Blennow, 헨릭 Zetterberg와 요한 Gobom 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al.
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
- Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
- Höglund, K., et al. Alzheimer's disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
- Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
- Yuan, X., Desiderio, D. M.
- Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
- Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
- Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).
- Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
- Hansson, K. T., et al.
- Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
- Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
- Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).
- Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
- Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
- Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
- Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).
