Summary
En metode for masse spectrometric analyse av endogene peptider i menneskelig cerebrospinalvæske (CSF) vises. Ved å bruke molekylvekt cut-off filtrering, brukt kromatografiske før fraksjoneres, masse spectrometric analyse og en påfølgende kombinasjon av peptid identifikasjon strategier, var det mulig å utvide den kjente CSF peptidome nesten ti-fold sammenlignet tidligere studier.
Abstract
Denne protokollen beskriver en metode utviklet for å identifisere endogene peptider i menneskelig cerebrospinalvæske (CSF). For dette formålet, en tidligere utviklet metode basert på molekylvekt cut-off (MWCO) filtrering og masse spectrometric analyse ble kombinert med en frakoblet høy pH omvendt fase HPLC pre fraksjoneres trinn.
Sekresjon i CSF er den viktigste veien for fjerning av molekyler skur av celler i det sentrale nervesystemet. Dermed gjenspeiles mange prosesser i sentralnervesystemet i CSF, gjengi det en verdifull diagnostiske væske. CSF har en sammensatt komposisjon, som inneholder proteiner som dekker mange konsentrasjon av 8-9 størrelsesordener. Foruten proteiner, har tidligere studier også vist tilstedeværelsen av et stort antall endogene peptider. Mens mindre grundig studert enn proteiner, kan dette også holde interesse som biomarkers.
Endogene peptider ble skilt fra CSF proteininnholdet gjennom MWCO filtrering. Ved å fjerne et flertall av proteininnhold fra prøven, er det mulig å øke eksempel volumet studerte og dermed også totalbeløpet av endogene peptider. Kompleksiteten i filtrert peptid blandingen ble behandlet ved å inkludere en omvendt fase (RP) HPLC pre fraksjoneres trinn på alkaliske pH før LC-MS analyse. Fraksjoneres ble kombinert med en enkel sammenkjeding ordning der 60 fraksjoner var samlet i 12, analyse tidsforbruk kan dermed reduseres og fortsatt i stor grad unngå co elueringsrør.
Automatisert peptid identifikasjon ble utført ved hjelp av tre forskjellige peptid/protein identifikasjon programmer og deretter kombinere resultatene. De ulike programmene var utfyllende heller enn sammenlignbare med mindre enn 15% av identifikasjoner overlappet mellom tre.
Introduction
Biomarkers i cerebrospinalvæske (CSF) er for tiden transformere forskning til nevrodegenerative lidelser. I Alzheimers sykdom, de vanligste nevrodegenerative lidelsen, påvirker over 60 millioner mennesker verden over1,2, en biomarkør trilling bestående av peptid amyloid beta, microtubule-stabilisere protein tau, og fosforylert tau skjemaet kan oppdage sykdommen med høy sensitivitet og spesifisitet og er inkludert i diagnostiske forskning kriterier3. I andre nevrodegenerative sykdommer, som Parkinsons sykdom og multippel sklerose, har proteomic studier identifisert flere biomarkør kandidater, hvorav noen er for tiden under evaluering i kliniske studier4,5 ,6.
Sammen med proteiner inneholder CSF også en overflod av endogene peptider7,8,9,10,11,12. Disse peptider utgjør cleavage produkter av mange hjerne-avledet proteiner, og representerer også en potensielt viktig kilde av sykdom biomarkers. For å øke beholdningen av identifiserte endogene peptider i menneskelig CSF og aktivere CSF endopeptidomic analyser i kliniske studier, utviklet en metode for eksempel forberedelse og LC-MS analyse (en kort Protokollskjemaet har blitt inkludert i figur 1 ). Anvendelsen av denne metoden i en fersk studie resulterte i identifikasjon av nesten 16,400 endogene CSF peptider i grupperte CSF prøver fra flere personer i ikke-spesifikk diagnose, utvide den kjente CSF endopeptidome tidoble13. Metoden kan eventuelt brukes i forbindelse med isobar merking tilnærming for kvantifisering.
Eksempel forberedelse
Den viktigste kilden til protein masse CSF er plasma bestanddeler (albumin og immunglobuliner) forbi blod hjernen barriere14,15. Deres høy overflod vanskeliggjør påvisning av lav-rikelig, hjerne-avledet eksempel komponenter. Endogene peptider kan lett skilles fra høy-rikelig proteiner, og dermed slik at et betydelig større volum av CSF peptid ekstrakt som skal brukes for LC-MS analyse, og dermed gjør påvisning av lavere-rikelig peptider.
I protokollen presenteres her, ble molekylvekt cut-off (MWCO) filtrering brukt til å skille CSF peptider fra protein fraksjon; en metode som har blitt brukt i flere tidligere studier8,,9,,10,,11,,12,,16. Filtrering trinnet ble etterfulgt av en frakoblet RP HPLC pre fraksjoneres trinn utført over høy pH mobile fase gradering. Ved å utføre to RP HPLC trinn i tandem, med pH blir den største forskjellen, forskjellen i selektivitet mellom de to trinnene skyldes hovedsakelig endret peptid oppbevaring av ulike peptid kostnad stater. Bruk av høy-pH peptid pre fraksjoneres før LC-MS Sure forhold har vist seg effektiv i øke peptid identifikasjon17,18, og selv å være overlegen for dette formålet i komplekse biologiske prøver i forhold til mer ortogonale separasjon modus19, som sterke katten-ion exchange (SCX) og RP20. Til forkorte tiden analyse, ble en sammenkobling ordningen brukt, samle alle 12th brøkdel (f.eks, brøker 1, 13, 25, 37 og 49) som på grunn av høy løse makt RP HPLC fortsatt i stor grad unngått co elueringsrør av peptider fra forskjellige brøker i LC-MS trinn20,21.
Peptid identifikasjon
Peptid identifikasjon i peptidomic studier er forskjellig fra proteomic studier i at noen enzym cleavage kan angis søk i databasen, og som en konsekvens, identifikasjon priser er vanligvis lavere11. En fersk studie13 viste at de identifikasjon prisene for endogene peptider med Sequest og maskott ble betydelig forbedret når standard scoring algoritme av respektive programmet ble endret ved hjelp av adaptiv scoring algoritmen kaffetrakter, som angir at optimal scoring algoritmer for endogene peptider avvike fra det tryptic peptider13. At studien identifikasjon basert på automatisk peptid de novo sekvensering programmvre TOPPER (BSI) ble funnet for å være utfyllende til to fragment ion fingeravtrykk-baserte søkemotorer, identifisert som resulterer i et betydelig større antall peptider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen beskrevet nedenfor er en raffinert versjon av den som brukes i en tidligere studie hvor mye endogene peptider ble identifisert i menneskelig CSF15. Oppdateringer til den originale protokollen innebærer mindre endringer i kjemisk forbehandling av CSF og optimalisering på graderingen som brukes frakoblet høy pH RP HPLC før fraksjoneres.
Etiske Betraktninger
Alle studier av svensk pasienten og kontroll materialer har blitt godkjent av etiske komiteer: St. Göran (ref. 2005-554-31/3). CSF prøver fra Amsterdam demens kohort og prøver samlet på Rikshospitalet Neurology, Neurosurgery og London ble brukt til forskning med skriftlig samtykke fra alle deltakende pasienter og godkjenning fra regionale komiteer. Materialet her benyttes hovedsakelig besto av venstre over CSF fra prøver tatt for diagnose og det var de identifiserte før inkluderes i våre studier. Det er ingen mulighet for å spore tilbake prøven noen personlige donor eller givere.
1. utvinning av menneskelig cerebrospinalvæske (CSF):
- Ekstra CSF gjennom lumbale punktering (må utføres av en utdannet lege) bruker en standardisert protokollen22.
- Fjerne celle rusk og andre ikke-løselig materiale med sentrifugering 2500 x g for 20 min.
- Visuelt inspisere CSF prøver for misfarging som kan indikere blod forurensning som følge av punktering blødning. Betydelig høyere protein konsentrasjonen i blodet og tilstedeværelsen av proteaser kan sterkt påvirke analytisk resultatene.
2. pre-behandling av CSF (1,5 mL eksempel volum, ingen kvantifisering):
- Tine 1,5 mL av CSF dele ved romtemperatur (RT), overføre innholdet til 10 mL polypropylen rør og legge 80 µL av 1 M Triethylammonium bikarbonat (TEAB) som bufring agent.
- Legge til 0,65 mL 8 M guanidinium hydroklorid (GdnHCl) (aktiv konsentrasjon GdnHCl: 2,4 M) og vortex forsiktig på RT for 10 min.
Merk: En chaotropic agent, GdnHCl, både påvirker løsemiddel viskositet og samhandler med polypeptid kjeden, som resulterer i protein unfolding blir energisk gunstige23. Dermed GdnHCl oppløser protein aggregater og øker utvinningen av endogene peptider i påfølgende filtrering. - Legge til 60 µL 200 mm vandig tris(2-carboxyethyl) phosphine hydroklorid (TCEP) (aktiv konsentrasjon TCEP: 6 mM) og Inkuber ved 55 ° C i 1 time å redusere cystein disulphides.
- Legge til 35 µL av 400 mM iodoacetamide (IAA) (aktiv konsentrasjon IAA: 4 mM) og Inkuber på RT i mørket i 30 minutter til alkylate cysteinene. Tillegg av en alkyl gruppe sikrer at cystein rester ikke spontant danne nye disulfidbroer når som helst under påfølgende eksempel forberedelse.
- Legg 3,25 mL de-ionisert vann og vortex kort å fortynne prøven før MWCO filtrering, som resulterer i et totalt eksempel volum på 5,5 mL. Dette trinnet serverer å fortynne GdnHCl til under 1 M som en høyere konsentrasjon er observert noen ganger forårsake utvasking av polymere stoffer fra filter enheter.
3. pre-behandling av CSF (10 x 150 µL eksempel volum, isobar merking-kvantifisering):
- Tine 150 µL av CSF dele fra 10 personer på RT og deretter overføre innholdet til personlige 1,5 mL lav-bindende mikro sentrifuge rør og Legg 8 µL av 1 M TEAB som bufring agent.
- Legge til 65 µL av 8 M GdnHCl (aktiv konsentrasjon GdnHCl: 2,4 M) og vortex forsiktig på RT for 10 min.
- Legge til 6 µL 200 mm vandig TCEP (aktiv konsentrasjon TCEP: 6 mM) og inkubasjon ved 55 ° C i 1 time å redusere cystein disulphides.
- Legge til 3,5 µL 400 mM vandig IAA (aktiv konsentrasjon IAA: 6 mM) og Inkuber på RT og mørke 30 min alkylate cysteinene.
- Forberede isobar merking kit (f.eks., Tandem masse Tag 10plex isobar merking reagens). Tillate isobar merking-reagens hetteglass nå RT før du åpner dem for å unngå unødvendige reagens hydration, legge til 41 µL av HPLC-klasse acetonitrile (AcN) og oppløses av mild agitasjon for 5 min.
- Overføre 30 µL isobar merking-reagens løsning til tilsvarende prøven og ruge 1t på RT under mild agitasjon. Isobar merking reagensen inkluderer en NHS-ester gruppe som reagerer med de primære aminer tilstede på peptid N-termini og lysin rester.
- Legge til 8 µL av 5% hydroksylamin (aktiv konsentrasjon hydroksylamin: 0,16%) og rist forsiktig på RT for 20 min å slukke merking reaksjonen. Siden separat merket prøvene er kombineres, at merking er reaksjon slukket. Tillegg av en overflod av Amin grupper i form av hydroksylamin, den gjenværende isobar merking reagensen kan reagere og dermed gjengitt inert.
- Kombinere innholdet i hver av de 10 individuelt merket prøvene i et enkelt 15 mL polypropylen rør.
- Legge 6,4 mL de-ionisert vann til kombinert utvalg og vortex kort å redusere AcN konsentrasjonen fra 12% til 3% og GdnHCl konsentrasjonen GdnHCl til under 1 M en høyere konsentrasjon er observert noen ganger forårsake utvasking av polymere stoffer fra filter-enheter.
4. molekylvekt cut-off filtrering
- For å fjerne potensialet forurensning, tilstanden i MWCO filtre ved å legge 10 mL vandig 1 M GdnHCl, 25 mM TEAB og sentrifugering i 15 min på 2500 x g og RT, forkaste gjennomflytsenhet (FT).
- Laste hele prøven volumet på filteret (5 mL ikke-merket CSF (trinn 2.5) eller 10 mL isobarically merket CSF (trinn 3.9)) og sentrifuge for 30 min på 2500 x g og RT, forlate gjennomflytsenhet (FT) i beholderen samling. Resultatet av for filtrering er at peptider og små proteiner er atskilt fra større proteiner og gjenværende celle rusk. Dette trinnet kan sees som peptidomic tilsvarende bruk av proteolytisk fordøyelsen av protein generere peptider proteomic eksperimenter.
- Laste 5 mL av 25 mM TEAB (vannbasert) på filtre og sentrifuger i 15 min på 2500 x g og RT, for å øke utvinningen av peptider.
- Vortex de kombinerte FTs fra de to forrige trinnene (totalt 10 mL av ikke-merket eller 15 mL isobarically merket prøve), og fortsetter å prøve forsuring.
5. de salting og eksempel opprydding av Solid fase utvinning
- Syre filtrerte prøven fra trinn 4.4 før solid fase ekstraksjon (SPE). Forsuring utføres for å forbedre stoff (peptid) interaksjon med den stasjonære fasen av SPE-patronen.
- For ikke-merkede utvalget (volum 10 mL): legge til 550 µL av 1% Trifluoroacetic acid (TFA) - totalvolum på prøven: 10.55 mL 0,05% TFA.
- Isobar-merket-eksempel (volum 15 mL): legge til 20 mL 0,1% TFA syre og lavere AcN konsentrasjon fra 3% til 1% - totalvolum på prøven: 30 mL med 0,066% TFA.
Merk: TFA legges også for dens funksjon som en ion-sammenkobling reagens, som forbedrer oppbevaring av peptider ikke selv i stand til å tilstrekkelig sterk hydrofobe interaksjon med emballasjematerialet av SPE kassetten skal beholdes. - Hvis pH > 3, sjarmere prøven med 20% fosforsyre til eksempel pH er < 3.
- Tilstand SPE blekkpatronene ved tillegg av 1 mL av 84% AcN 0,1% formic acid (FA) og kast FT. gjentas én gang. Condition patron filter er nødvendig for å fjerne uønskede stoffer som ellers ville elute sammen med peptider i de etterfølgende trinnene; Videre condition øker permeabilitet av filteret.
- Equilibrate SPE kassetten med tillegg av 1 mL av 0,1% TFA, forkaste FT. Gjenta en gang. Sikre at filteret ikke kjører tørr etter siste balanse trinn - holde et lite volum på filteret. Balanse patron filter utføres for å forberede seg til å beholde peptider ved å fjerne hydrofobe stoffet (acetonitrile) forlot fra condition trinn.
- Laste hele prøven volumet (10.55 mL for ikke-merkede eksempler eller 30 mL for isobarically merket prøver), i flere deler om nødvendig, og la FT kjøre inn avfall. Kontroller at kassetten ikke kjøres tørr mellom eksempel lasting runder eller etter siste eksempel volumet er lastet - holde et lite volum på filteret.
- Passerer 1 mL av 0,1% TFA over filtrene fjerner salter og reagenser og forkaste FT. Gjenta en gang. Sikre at kassetten ikke kjører tørr etter hver vask trinn - holde en liten mengde væske på kassetten.
- Sted 1.5 mL lav bindende mikro sentrifuge rør under kassetten og elute prøven ved å sende 1 mL av 84% AcN, 0,1% FA over kassetten.
- Fjern løsemidlene fra de saltet utvalget av fordampning i et vakuum sentrifuge kjøre uten aktive oppvarming til tørr, lagre ved-80 ° C eller fortsette umiddelbart til høy pH fraksjoneres.
6. frakoblet høy pH reversere fase HPLC prøve fraksjoneres
-
Forbered vandig høy-pH (HpH) mobile phases:
HpH Buffer A: Rent vann
HpH Buffer B: 84% AcN
HpH Buffer C: 25 mM NH4OH
HpH lasting buffer: 2,5 NH4OH, 2% AcN
Merk: HpH lasting bufferen brukes som transport løsning og prøve buffer - Nytt oppløse prøven i 16 µL HpH lasting buffer av mild agitasjon for 20 min
- Legg 15 µL prøven på et såkalt HPLC-system med en intern brøkdel kollektoren for 96-dyptgående brønn plater konfigurert i henhold til Batth et al. 20 med mindre endringer. Smuldre vekk på en strøm av 100 µL/min over en pH-stabil separasjon kolonne (C18 3.5 µm, 2,1 x 250 mm) og samle en brøk per min over lineær 60 min gradering.
- Bruk følgende gradient tid-punkter: t = 0 min, B = 1%, C = 10%. t = 4 min, B = 1%, C = 10%, start brøkdel samling; t = 76 min, B = 70%, C = 10%. slutten brøkdel samling; t = 76,5 min, B = 85%, C = 10%. t = 80 min., B = 85%, C = 10%. t = 80.5 min, B = 1%, C = 10% og t = 90 min., B = 1%, C = 10%.
- Samle brøker gjentagelser i 12 brønner i et sirkulært mønster, dermed lenke sammen brøker linjeavstand av 12 min, som resulterer i 12 fraksjoner, hver med 6 konkatenert sub fraksjoner.
- Fjerne løsemiddelet fra prøvene av vakuum sentrifugering RT og 3000 rpm til tørr og lagre prøvene ved-80 ° C før LC-MS analyse.
7. LC-MS
-
Forbered vandig mobile phases:
Buffer A: 0,1% FA
Buffer B: 0,1% FA, 84% AcN
Lasting buffer: 0,05% TFA, 2% AcN
Merk: Lasting bufferen brukes som transportløsning, prøve buffer og mobile fase for lasting pumpen. - Nytt oppløse hver av 12 fraksjoner av tillegg av 6 µL lasting buffer og rister på RT for 20 min
- Load 5 µL prøve på en nano-flow HPLC, i kolonnen fellekonfigurasjon (felle kolonne: 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å porestørrelse, 3 µm partikkelstørrelse, separasjon kolonne: C18, 75 µm x 500 mm, 100 Å porestørrelse, 2 µm partikkelstørrelse , og utføre peptid separasjon på en strømningshastighet på 150 nL/min bruker følgende graderingen: t = 0 min, B = 2%. t = 10 min, B = 2%. t = 11 min, B = 7%. t = 100 min, B = 26%. t = 170 min., B = 45%. t = 175 min, B = 80%. t = 181 min, B = 2% og t = 210 min, B = 2%.
-
Utføre MS om høyoppløselige hybrid masse spectrometer koblet til HPLC via en nano-ESI grensesnitt. Registrere fullstendig skanning spectra i MS modus på en oppløsning av 120 000 (2.0e5 AGC mål) over m/z området 350-1400.
- Opererer på masse spectrometer i data-avhengige vinningen måte, Velg MS-/ MS spectra fra topp ti mest intense toppene med m/z > 150 og intensitet området 1.0e4-1.0e5 for fragment ion analyse. Isolere forløper ioner ved hjelp av en quadrupole isolasjon vindu av 1 m/z, maksimal injeksjon tid på 100 ms og RF linsen på 60%.
- Bruke dynamisk ekskludering med en utelukkelse tid 15 s og en m/z toleranse for ±10 ppm. Utfør fragmentering i høyere-kollisjon energi dissosiasjon (HCD) cellen og Registrer MS-/ MS oppkjøp i orbitrap på en oppløsning på 50 000 (5.0e4 AGC målverdi).
8. peptid identifikasjon
-
For peptid identifikasjon sende de resulterende *.RAW-filene fra massen spectrometric analysen til en Proteomikk søkemotor bruker følgende innstillinger:
Merk: I våre tidligere studie15, tre søkemotorer; Maskot v2.4 og Sequest HT TOPPER v7.5 ble brukt parallelt og innstillingene som er angitt her var ansatt for alle tre søkemotorer, med mindre annet er angitt. Fleste av justerbare innstillinger er universelle for peptid/protein identifikasjon og bør ha tilsvarende innstillinger i en gitt søkemotor.
Spekteret velgeren:
Min. forløper masse: 350 Da
Max. forløperen masse: 5000 Da
Søk type: Full
Signal/støy terskelen: 1,5
Sekvensen databasesøk
Database: UniProt_SwissProt [version2015_11]
Systematikk: Homo sapiens
Enzym: ingen
Max. savnet cleavages: 0
Apparatet (bare maskot): ESI-felle
Min. peptid lengde (bare SequestHT): 6
Max. peptid lengde (bare SequestHT): 144
Forløperen masse toleranse: 15 ppm
Fragment masse toleranse: 0,05 Da
Statisk endringer: Carbamidomethyl (C); [Hvis merket] TMT10plex (N-Term)
Dynamiske endringer: oksidasjon (M). [Hvis merket] TMT10plex (K)
Peptid-spektrum kamp (PSM) validator
Kaffetrakter (maskot og Sequest HT bare) eller lokkefugl Fusion (bare TOPPER)
Målrette FDR: 0,01
Validering basert på: q-verdi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden beskrevet her er brukt og evaluert i tre studier før innføringen av prøven før fraksjoneres (tabell 1). Den første studien brukes frakoblet LC for småblødninger CSF fraksjoner på en MALDI mål plate og resulterte i 730 identifiserte endogene peptider11. I de to følgende studiene, ble isobar merking ansatt. I en sak/kontroll studie for identifikasjon og karakterisering av potensielle biomarkers i CSF endopeptidome og proteom samtidig24, og i andre studien isobar merking ble brukt til overvåking behandling effekter i vivo av en γ-secretase hemmer på peptid uttrykket i CSF over 36 h16. I tilfelle/kontroll studien 437 endogene peptider ble identifisert, 64 som betydelig endret i konsentrasjon mellom individer med Annonsen og sunn kontroller. Tredje, behandling studie, identifisert 1798 endogene peptider, 11 av de overvåkede peptidene kan vises til reagerer på behandlingen.
I den fjerde studien var målet å øke antall identifiserte CSF peptider, spesielt å identifisere lavere-rikelig peptider. Derfor peptid før fraksjoneres av HpH-RP kromatografi fulgte, og en 10 ganger større CSF eksempel volum ble brukt, noe som resulterer i identifisering av 16,395 peptider. I denne studien ble ikke isobar merking utført. I tillegg til prøve fraksjoneres, de siste studie ansatt en kombinert peptid identifikasjon tilnærming, mens i de tre første studiene bare en enkelt databasesøk ble utført, vil noen grad kontoer for større antall peptider identifisert. Sammenligne resultatene av individuelle søkemotorer (maskot, Sequest HT eller TOPPER) fra de siste studie viser at brukes algoritmer er til dels komplementære siden et relativt lite beløp, mindre enn 15% (2440), av peptider identifisert av alle tre søkemotorer (figur 2). Videre de novo-sekvensering søk motor TOPPER var det mest effektive identifiserende endogene peptider, men mer enn 5400 peptider ikke ville ha blitt identifisert hvis bare TOPPER hadde blitt brukt (figur 2). Bruk av flere søkemotorer på samme materialet har potensial flere tester problemer og dette var adressert til en test av identifikasjon korrekthet13. Ervervet MS-/ MS rådata, samt alle resultatene i proteomic søk fra siste rettssaken har blitt gjort tilgjengelig i stolthet datalager via ProteomeXchange med ID PXD004863.
Figur 1: en Protokollskjemaet visualisere de viktigste trinnene i metoden. Utvinning av cerebrospinalvesken av lumbale punktering etterfulgt av sentrifugering å fjerne ikke-løselig materiale, 2) tillegg av GdnHCl til prøven å dissociate peptid-protein aggregat, øke utvinningen av endogene peptider; reduksjon og alkylation av cystein disulphides; isobar merking for peptid kvantifisering (valgfritt) 3) molekylær vekt filtrering å skille de endogene peptidene fra proteiner, 4) solid fase utvinning fjerne salter og andre polar forurensninger, 5) RP HPLC pre fraksjoneres, alkaliske Mobile fase gradering og sammensetning av hver 12th brøk, 6) RP HPLC--MS-/ MS, surt mobile fase gradient, hver konkatenert fraksjon kjøre fortløpende, 7) peptid identifikasjon av MS-/ MS data fra alle 12 analyse tekster som sendes en enkelt prøve til søkemotorer, senere peptid IDer ble sammenliknet og et sammendrag av alle unike peptid IDer ble utført. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Studien Sammendrag | TMT merking (j/n) | HpH-RP fraksjoneres (j/n) | Tilsvarende volumet av CSF per MS-analyse (µl) | Antall identifiserte peptider | Kommentar | Referanse |
| Utforskende CSF peptidome analyse | n | n | 500 | 730 | Frakoblet LC MALDI målet forberedelse, MALDI-MS; evaluering av MWCO filtre | 4 |
| Kvantitativ sammenligning av CSF peptider; eksempler fra 8 annonse + 8 Ctrl | y | n | 200 | 437 | HPLC-ESI MS; kombinert peptidomic og proteomic protokollen | 25 |
| AD gamma secretase hemmer behandling studie | y | n | 300 | 1798 | HPLC-ESI MS; CSF utdraget for seks tidspunkt etter behandling | 17 |
| Utvide CSF peptidome | n | y | 750-1000 | 18.031 | HPLC-ESI MS; kombinasjonen av peptid identifikasjon programvare | 15 |
Tabell 1: En samling av nyere studier utført av gruppen som bruker molekylvekt filtrering og masse spectrometric analyse for identifikasjon av endogene peptider i menneskelig CSF.
Figur 2: et diagram som sammenligner peptid identifikasjon resultatene innhentet fra hver av de tre søkemotorene maskot, Sequest HT og TOPPER. Totalt 16,395 endogene peptider ble identifisert. De novo-sekvensering søkemotor TOPPER identifisert 10,967 endogene peptider; fragment-ion fingeravtrykk-baserte søkemotorer maskot og Sequest HT identifisert 8118 og 7304 endogene peptider henholdsvis. Identifikasjon konsensus mellom alle tre søkemotorer utgjorde 2440 endogene peptider eller 14,8%. Det var en relativt stor identifikasjon overlapping mellom maskot og Sequest HT, tilsvarende 70% av de samlede peptid-IDer. TOPPER hadde en relativt liten identifikasjon overlapper med både maskot og Sequest HT; 20.5% og 18.9% henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Innføringen av en høy-pH RP HPLC pre fraksjoneres trinn til en tidligere utviklet protokoll for utvinning av endogene peptider ved molekylvekt ultrafiltrasjon11 redusert relative eksempel kompleksitet og tillatt dermed for 5-fold større eksempel volum studier. Dette, i sin tur økt konsentrasjonen av undergruppe av peptider i hver fraksjon og bedre dermed sjansene for å oppdage lav rikelig peptider.
Ved å utføre en identifikasjon strategi for endogene peptider som ansatt tre proteomic programvare parallelt, var det mulig å utvide den kjente CSF endopeptidome mer enn 10 ganger. Totalt 16,395 endogene peptider ble identifisert i en foreløpig rettssak på en gruppert CSF utvalget materialet. Blant identifikasjonene var et stort antall endogene peptider fra proteiner som tidligere nevnt i sammenheng med nevrodegenerative lidelser. Flere peptider i ovennevnte studiene er som blir evaluert som biomarkers i vårt laboratorium. Denne prosessen innebærer flere tiltak, blant annet verifisering av peptidene identiteter av skyter CSF med syntetiske analoger merket med tunge isotoper, etablering av målrettet masse spectrometric analyser, vurdere peptid stabilitet under lagring og fryse-Tin sykluser, og analysere forskjellige kliniske kohorter.
Endringer ble gjort i den originale protokollen for å unngå introduksjon av miljøgifter (trinn 2,5 og 3,5) av en høy konsentrasjon av GdnHCl i eksemplet under MWCO-filtrering. En oppdatering til pre fraksjoneres gradient (trinn 6.3.1) ble gjort, kapasitet langvarig, lineær gradient brukes.
De viktigste årsakene til analytt tap i protokollen her beskrevet kan tilskrives de to RP brukt kromatografiske trinnene som MWCO filtrering og SPE eksempel rydde opp trinn.
Peptid grunn samspill med MWCO-filter eller proteiner beholdt, under filtrering er vanskelig å unngå og kan være en kilde til inter sample variant.
Videre oppstå selektiv tap sannsynligvis i RP-brukt kromatografiske trinnene. Siden peptid hydrophobicity er pH-avhengig, kan utføre to påfølgende RP brukt kromatografiske trinn på høyt og lavt pH, henholdsvis føre til tap av undergruppe av peptider som er for hydrofile på pH ≥9 må oppbevares på kolonnen, og tilsvarende et sekund delsett for hydrofile på pH ≤3 skal beholdes.
Sammenlignet med tidligere brukte metodene ansettelse av pre-fraksjoneres har ført til en 10 ganger økning i identifikasjon av endogene peptider. Det har tillatt for vellykket påvisning av en rekke tidligere uidentifiserte peptider og er derfor et verdifullt verktøy i studiet og utforskning av CSF-peptidome, og muligens andre komplekse biologiske prøver også.
Kombinert med multiplex isobar merking protokollen skal brukes til ytterligere for å identifisere biomarkør kandidater til ulike nevrodegenerative lidelser i CSF, blod og hjernen vev.
Varierende utvinning i forberedelsene eksempel bidrar til analytiske variasjonen for analyse av CSF proteiner og peptider ved LC-MS. utfører isobar merking av peptider på et tidlig stadium i prøven forberedelse synker påvirkning av slike variasjon sterkt. Sammenlignet med tidligere rapportert eksempel forberedelse protokoller, økte gjennomføringen av høy pH tilbakeførte fase peptid pre fraksjoneres antallet identifiserte peptider webserverantallet 5. Identifikasjon av endogene peptider fra MS/MS-data ble betydelig forbedret når kombinere ulike peptid identifikasjon programvare, bruke forskjellige søkealgoritmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen konkurrerende interesser, økonomiske eller andre, mellom forfattere har rapportert.
Acknowledgments
Mange takk til Tanveer Batth og kolleger for råd konfigurere metoden før fraksjoneres.
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra svenske Forskningsrådet, Wallström og Sjöblom Foundation, pistolen og Bertil Stohne Foundation Stiftelse, Magnus Bergwall Foundation, Åhlén Foundation, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen for Gamla Tjänarinnor, Knut og Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen og FoU-Västra Götalandsregionen.
De viktigste mottakerne av midler til dette prosjektet var Kaj Blennow, Henrik Zetterberg og Johan Gobom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
- Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
- Höglund, K., et al. Alzheimer's disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
- Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
- Yuan, X., Desiderio, D. M. Human cerebrospinal fluid peptidomics. J Mass Spectrom. 40 (2), 176-181 (2005).
- Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
- Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
- Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).
- Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
- Hansson, K. T., et al. Expanding the cerebrospinal fluid endopeptidome. Proteomics. 17 (5), (2017).
- Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
- Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
- Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).
- Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
- Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
- Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
- Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).
