Summary
En metod för massa spektrometriska analys av endogena peptider i mänskliga cerebrospinalvätska (CSF) presenteras. Genom att anställa molekylvikt cut-off filtrering, kromatografiska före fraktionering, massa spektrometriska analys och en efterföljande kombination av peptid identifiering strategier, var det möjligt att expandera den kända CSF peptidome nästan tio gånger jämfört till tidigare studier.
Abstract
Det här protokollet beskriver en metod som utvecklats för att identifiera endogena peptider i mänskliga cerebrospinalvätska (CSF). För detta ändamål, en tidigare utvecklade metod baserad på molekylvikt cut-off (MWCO) filtrering och massa spektrometriska analys kombinerades med ett offline hög-pH omvänd fas HPLC före fraktionering steg.
Sekretion i CSF är den viktigaste smittvägen för borttagning av molekyler skjul av celler i det centrala nervsystemet. Således återspeglas många processer i det centrala nervsystemet i CSF, gör den en värdefull diagnostisk vätska. CSF har en komplex sammansättning, som innehåller proteiner som sträcker sig över ett koncentrationsintervall 8-9 storleksordningar. Förutom proteiner, har tidigare studier också påvisat förekomsten av ett stort antal endogena peptider. Medan mindre flitigt studerade än proteiner, kan dessa också hålla potentiella intresse som biomarkörer.
Endogena peptider skildes från CSF proteinhalten genom MWCO filtrering. Genom att ta bort en majoritet av proteinhalten från provet, är det möjligt att öka den provvolymen studerade och därmed också det totala beloppet för de endogena peptiderna. Komplexiteten i filtermediat peptid blandningen åtgärdades genom att inkludera en omvänd fas (RP) HPLC före fraktionering steg vid alkaliskt pH före LC-MS-analys. Fraktioneringen kombinerades med en enkel sammanfogning stödordning där 60 fraktioner var poolade in 12, analys tidsförbrukning skulle därmed kunna minskas medan fortfarande i stor utsträckning undvika samtidig eluering.
Automatiserad peptid identifiering utfördes med hjälp av tre olika peptid och protein identifiering programvara program och därefter kombinerar resultaten. De olika programmen var kompletterande snarare än jämförbara med mindre än 15% av identifiering av överlappade mellan tre.
Introduction
Biomarkörer i ryggmärgsvätska (CSF) för närvarande omvandla forskning till neurodegenerativa sjukdomar. I Alzheimers sjukdom, den vanligaste neurodegenerativa sjukdomar, som påverkar över 60 miljoner människor världen över1,2, en biomarkör triplet bestående av peptid amyloid beta, mikrotubuli-stabiliserande proteinet tau, och en fosforyleras tau form, kan upptäcka sjukdomen med hög känslighet och specificitet och har inkluderats i den diagnostiska forskning kriterier3. I andra neurodegenerativa sjukdomar som Parkinsons sjukdom och multipel skleros, har proteomiska studier identifierat ett flertal biomarkör kandidater, av vilka några är för närvarande under utvärdering i kliniska studier4,5 ,6.
Tillsammans med proteiner innehåller CSF också ett överflöd av endogena peptider7,8,9,10,11,12. Som utgör klyvningsprodukter av många brain-derived proteiner, representera dessa peptider också en potentiellt viktig källa av sjukdom biomarkörer. För att öka lagret av identifierade endogena peptider i human CSF och aktivera CSF endopeptidomic analyser i kliniska studier, utvecklades en metod för provberedning och LC-MS-analys (ett kort protokoll system har inkluderats i figur 1 ). Tillämpningen av denna metod i en färsk studie resulterade i identifiering av nästan 16,400 endogena CSF peptider i CSF samlingsprover från flera individer av icke-specifik diagnos, expanderar den kända CSF endopeptidome tiofaldig13. Metoden kan eventuellt användas tillsammans med isobariska märkning metod för kvantifiering.
Provberedning
Den huvudsakliga källan till protein massan i CSF är plasma beståndsdelar (e.g. albumin och immunglobuliner) passerar över de blod hjärn barriären14,15. Deras höga överflöd försvårar upptäckten av låg-riklig, brain-derived urval komponenter. Endogena peptider kan lätt separeras från hög-riklig proteinerna, vilket innebär att en betydligt större volym CSF peptid extrakt användas för LC-MS analys, vilket möjliggör detektering av nedre-riklig peptider.
I protokollet presenteras här, användes molekylvikt cut-off (MWCO) filtrering för att skilja de CSF peptiderna från proteinfraktion; en metod som har använts i flera tidigare studier8,9,10,11,12,16. Det filtrering steget följdes av en offline RP HPLC före fraktionering steg utförs över en hög-pH mobil fas övertoning. Genom att utföra två RP HPLC steg parallellt, med pH är den huvudsakliga skillnaden, skillnaden i selektivitet mellan de två stegen resultat främst från förändrad peptid innehållande till följd av olika peptid laddningstillstånd. Tillämpningen av hög-pH peptid före fraktionering före LC-MS under sura förhållanden har visat sig vara effektiv för att öka peptid identifiering17,18, och även att vara överlägsen för detta ändamål i komplexa biologiska prover jämfört med mer ortogonala separation lägen19, såsom stark katt-jonbyte (SCX) och RP20. För att förkorta tid som analys, användes en sammanfogning systemet, sammanslagning varje 12th bråkdel (t.ex., bråk 1, 13, 25, 37 och 49), som på grund av hög lösa driver av RP HPLC fortfarande till stor del undvikas samtidig eluering av peptider från olika fraktioner i LC-MS steg20,21.
Peptid identifiering
Peptid identifiering i peptidomic studier skiljer sig från proteomiska studier däri ingen enzym klyvning kan anges i databasen sökningen, och följaktligen identifiering priser är oftast lägre11. En senare studie13 visade att de identifiering priserna för endogena peptider erhålls med Sequest och maskot förbättrades avsevärt när standard scoring algoritm av respektive programmet ändrades använder adaptiv scoring algoritmen bryggare, som visar att optimal scoring algoritmer för endogena peptider skiljer sig från tryptic peptider13. Genom att studien identifiering baserat på automatisk peptid de novo sekvensering med programvaran toppar (BSI) befanns vara ett komplement till de två fragment ion fingeravtryck-baserade sökmotorerna, identifieras vilket resulterar i en betydligt större uppsättning peptider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet beskrivs nedan är en förfinad version av den som används i en tidigare studie där en stor mängd endogena peptider identifierades i human CSF15. Uppdateringar till den ursprungliga protokollet innebär mindre ändringar kemisk förbehandling av CSF samt optimering på toningen som används för offline hög-pH RP HPLC före fraktionering.
Etiska överväganden
Alla studier av svenska patient- och material har godkänts av etiska kommittéer: St. Göran (ref. 2005-554-31/3). CSF prover från Amsterdam demens kohorten och prover som tagits vid National Hospital för neurologi och neurokirurgi, London användes för forskning med skriftligt medgivande från alla deltagande patienter och godkännande från regionala etikkommittéerna. Materialet här utnyttjas huvudsakligen bestod av överblivna CSF från prover för diagnos och det var avidentifierade innan de ingår i våra studier. Det finns ingen möjlighet att spåra tillbaka provet till någon enskild givare eller grupp av givare.
1. utvinning av mänskliga cerebrospinalvätska (CSF):
- Extrahera CSF genom lumbalpunktion (måste utföras av en utbildad läkare) med hjälp av ett standardiserat protokoll22.
- Ta bort cellfragment och andra icke-lösliga material genom centrifugering vid 2500 x g i 20 min.
- Inspektera visuellt CSF prover för missfärgningar som kan tyda på blod föroreningar som härrör från punktering blödning. Betydligt högre protein koncentrationen i blodet och förekomsten av proteaser kan kraftigt påverka analysresultaten.
2. förbehandling av CSF (1,5 mL provvolymen, ingen kvantifiering):
- Tina 1,5 mL CSF alikvoter vid rumstemperatur (RT), överför innehållet till 10 mL polypropylene rören och tillsätt 80 µL av 1 M Triethylammonium bikarbonat (TEAB) som en buffert agent.
- Lägg till 0,65 mL 8 M guanidinium hydroklorid (GdnHCl) (aktiv koncentration GdnHCl: 2,4 M) och vortexa försiktigt på RT i 10 min.
Obs: Chaotropic agenten, GdnHCl, både påverkar lösningsmedel viskositet och interagerar med kedjan polypeptid, vilket resulterar i protein utspelas som energetically gynnsamma23. Således GdnHCl upplöser protein aggregat och ökar återhämtningen av endogena peptider under efterföljande filtreringen. - Tillsätt 60 µL av 200 mM av vattenhaltigt tris(2-carboxyethyl) fosfin hydroklorid (TCEP) (aktiv koncentration TCEP: 6 mM) och inkubera vid 55 ° C för 1 h att minska cystein svavelämnen.
- Tillsätt 35 µL av 400 mM iodoacetamide (IAA) (aktiv koncentration IAA: 4 mM) och inkubera vid RT i mörker för 30 min att alkylate cysteines. Tillägg av en alkylgrupp säkerställer att cystein rester spontant inte kan bilda nya disulphide överbryggar vid någon punkt under efterföljande provberedning.
- Lägg till 3,25 mL avjoniserat vatten och vortex kort att späda provet före MWCO filtrering, vilket resulterar i en total provvolymen 5,5 ml. Detta steg tjänar till att späda ut GdnHCl till under 1 M som en högre koncentration har observerats att ibland orsaka läckage av Polymera substanser från filter enheter.
3. förbehandling av CSF (10 x 150 µL provtagningsvolym, isobariska märkning-kvantifiering):
- Tina 150 µL CSF alikvoter från 10 individer på RT och därefter överföra innehållet till individuella 1,5 mL låg-bindande micro centrifugrör och tillsätt 8 µL av 1 M TEAB som buffring agent.
- Tillsätt 65 µL av 8 M GdnHCl (aktiv koncentration GdnHCl: 2,4 M) och vortexa försiktigt på RT i 10 min.
- Tillsätt 6 µL av 200 mM av vattenhaltigt TCEP (aktiv koncentration TCEP: 6 mM) och inkubation vid 55 ° C för 1 h att minska cystein svavelämnen.
- Lägg till 3,5 µL 400 mM aqueous IAA (aktiv koncentration IAA: 6 mM) och inkubera vid RT och mörker i 30 min för att alkylate cysteines.
- Förbereda den isobariska märkning kit (t.ex., Tandem Mass Tag 10plex isobariska märkning reagens). Låt de isobariska märkning-reagens flaskorna att nå RT innan du öppnar dem för att undvika onödiga reagens återfuktning, tillsätt 41 µL av HPLC-grad acetonitril (AcN) och upplösa vaggning för 5 min.
- Överföra 30 µL isobariska märkning-reagens lösning till motsvarande provet och inkubera i 1 h på RT under försiktig skakning. Isobariska märkning reagenset innehåller en NHS-ester-grupp som reagerar med de primära aminesna som är närvarande vid peptiden N-termini samt med lysin rester.
- Tillsätt 8 µL av 5% hydroxylamin (aktiv koncentration hydroxylamin: 0,16%) och skaka försiktigt på RT för 20 min att släcka märkning reaktionen. Eftersom de separat märkta proverna är att kombineras, se till att märkningen är reaktion kylda. Genom tillsats av ett överflöd av amine grupper i form av hydroxylamin, återstående isobariska märkning reagensen tillåts att reagera och således återges inert.
- Kombinera innehållet i varje 10 individuellt märkta prov i ett enda 15 mL polypropylen rör.
- Tillsätt 6,4 mL avjoniserat vatten till kombinerade provet och vortex kort att minska AcN koncentrationen från 12% till 3% och i GdnHCl koncentrationen GdnHCl till under 1 M som en högre koncentration har observerats att ibland orsaka läckage av Polymera substanser från filter enheter.
4. molekylvikt cut-off filtrering
- För att undanröja potentiella föroreningar, villkorar MWCO filtrerar efter lastning 10 mL vattenlösning 1 M GdnHCl, 25 mM TEAB och centrifugering för 15 min 2 500 x g och RT, kassera genomströmmande (FT).
- Ladda hela provvolymen på filtret (5 mL omärkt CSF (steg 2.5) eller 10 mL isobarically-märkt CSF (steg 3,9)) och centrifugera för 30 min 2 500 x g och RT, lämnar genomströmmande (FT) i behållaren samling. Resultatet av filtrering är att peptider och små proteiner skiljs från större proteiner och kvarvarande cellfragment. Det här steget kan ses som peptidomic som är likvärdig med förbrukning av proteolytisk nedbrytning av proteiner att generera peptider i proteomiska experiment.
- Ladda 5 mL 25 mM TEAB (vattenlösning) på filter och Centrifugera under 15 minuter vid 2500 x g och RT, för att öka återvinning av peptider.
- Vortex de kombinerade FTs från de två föregående stegen (totalt 10 mL av icke-märkta eller 15 mL isobarically-märkt prov), och gå vidare till exempel försurning.
5. de saltning och prov sanering genom fasta fasen extraktion
- Gör filtratet surt filtrerade provet från steg 4,4 före fasta fasen extraktion (SPE). Försurningen utförs för att förbättra solute (peptid) interaktion med den stationära fasen av SPE-patronen.
- För icke-märkt provet (volym 10 mL): Tillsätt 550 µL 1% trifluorättiksyra (TFA) - totala volym av provet: 10,55 mL med 0,05% transfettsyror.
- För isobariska-märkt provet (volym 15 mL): Tillsätt 20 mL 0,1% TFA syrsätt och sänka AcN koncentration från 3% till 1% - provets totala volym: 30 mL med 0,066 procent transfettsyror.
Obs: TFA läggs också för sin funktion som ett ion-ihopkoppling reagens, vilket förbättrar bibehållandet av peptider inte själva klarar tillräckligt starka hydrofoba interaktioner med förpackningsmaterialet av SPE patronen ska behållas. - Om pH > 3, titrera provet med 20% fosforsyra tills provet pH är < 3.
- Villkora SPE patronerna genom tillsats av 1 mL 84% AcN, 0,1% myrsyra (FA) och kassera FT. upprepas en gång. Luftkonditionering av patronfilter krävs för att ta bort oönskade ämnen som annars skulle eluera tillsammans med peptiderna i efterföljande steg; Ytterligare, luftkonditionering ökar permeabiliteten i filtret.
- Temperera SPE patronen genom tillsats av 1 mL 0,1% TFA, kassera FT. Upprepa en gång. Se till att filtret inte körs torr efter det sista Jämviktstiden steget - hålla en liten volym ovanpå filtret. Jämviktstiden av filtret patron utförs för att förbereda filtret för att behålla peptider genom att ta bort det hydrofoba ämnet (acetonitril) kvar från luftkonditionering steg.
- Ladda hela provvolymen (10,55 mL för omärkt prover eller 30 mL för isobarically-märkt prover), i flera delar om nödvändigt, och låt FT springa in i avfall. Se till att patronen inte köras torr mellan prov lastning rundor eller efter den sista provvolymen har lästs - hålla en liten volym ovanpå filtret.
- Passera 1 mL 0,1% TFA över filtren till avlägsna salter och reagenser och kassera FT. Upprepa en gång. Säkerställa att patronen inte körs torr efter varje tvätt steg - hålla en liten volym av vätska på toppen av patronen.
- Plats 1,5 mL låg bindande mikroföretag Centrifugera rören under kassetten och eluera provet genom att passera 1 mL 84% AcN, 0,1% FA över patronen.
- Ta bort lösningsmedlen från de saltade provet genom avdunstning i en vakuum centrifug som kör utan aktiv värme tills de är torra, förvaras vid-80 ° C eller omedelbart gå vidare till hög-pH fraktionering.
6. offline hög-pH Reverse Phase HPLC prov fraktionering
-
Förbereda aqueous hög-pH (HpH) mobila faser:
HpH buffert A: Rent vatten
HpH buffert B: 84% AcN
HpH buffert C: 25 mM NH4OH
HpH lastning buffert: 2,5 mM NH4OH, 2% AcN
Obs: HpH lastning buffert används som transport lösning och prov buffert - Lös åter upp provet i 16 µL HpH lastning buffert vaggning för 20 min
- Ladda 15 µL provet på en HPLC-system med en inre bråkdel insamlare för 96-deep-bra plåtar konfigureras enligt Batth o.a. 20 med mindre ändringar. Fractionate på ett flöde av 100 µL/min över en pH-stabil separation kolumn (C18 3,5 µm, 2,1 x 250 mm) och samla en fraktion per minut över en linjär 60 min toning.
- Använd följande gradient-punkter: t = 0 min, B = 1%, C = 10%; t = 4 min, B = 1%, C = 10%, start bråkdel samling; t = 76 min, B = 70%, C = 10%; slutet bråkdel samling; t = 76,5 min, B = 85%, C = 10%; t = 80 min, B = 85%, C = 10%; t = 80,5 min, B = 1%, C = 10% och t = 90 min, B = 1%, C = 10%.
- Samla in fraktioner upprepande i 12 brunnar i ett cirkulärt mönster, därmed sammanfoga fraktioner fördelade av 12 min, vilket resulterar i 12 fraktioner, vardera innehållande 6 konkatenerade sub fraktioner.
- Ta bort lösningsmedlet från prover av vakuum centrifugering vid RT och 3000 rpm tills de är torra och lagra proverna vid-80 ° C före LC-MS-analys.
7. LC-MS
-
Förbereda aqueous mobila faser:
Buffert A: 0,1% FA
Buffert B: 0,1% FA, 84% AcN
Lastning buffert: 0,05% TFA, 2% AcN
Obs: Lastning buffert används som transportlösning, prov buffert och Rörlig fas för lastning pumpen. - Åter lös varje av de 12 fraktionerna genom tillsats av 6 µL lastning buffert och skakar på RT för 20 min
- Last 5 µL prov på en nano-flow HPLC, verksamma i fällan kolumnen konfiguration (fälla kolumn: 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å porstorlek, 3 µm partikelstorlek; separation kolumn: C18, 75 µm x 500 mm, 100 Å porstorlek, 2 µm partikelstorlek , och utföra peptid separation med en flödeshastighet av 150 nL/min använder följande övertoningen: t = 0 min, B = 2%; t = 10 min, B = 2%; t = 11 min, B = 7%; t = 100 min, B = 26%; t = 170 min, B = 45%; t = 175 min, B = 80%; t = 181 min, B = 2%, och t = 210 min, B = 2%.
-
Utföra MS på högupplösta hybrid masspektrometer ansluten till HPLC via en nano-ESI-gränssnittet. Spela in fullständig genomsökning spectra i MS läge vid en upplösning av 120.000 (2.0e5 AGC mål) över m/z intervallet 350-1,400.
- Fungerar masspektrometer i data-beroende förvärv läge, Välj MS/MS spectra från topp tio mest intensiva topparna med m/z > 150 och inom den intensiteten intervall 1.0e4-1.0e5 för fragment jonanalys. Isolera föregångare joner med hjälp av ett quadrupole isolering fönster av 1 m/z, maximal injektion tid av 100 ms och RF linsen på 60%.
- Tillämpa dynamiska utslagning med en uteslutning tid 15 s och en m/z tolerans ±10 ppm. Utför fragmentering i cellen högre-kollision energi dissociation (HCD) och registrera MS/MS förvärv i orbitrap vid en upplösning för 50,000 (5.0e4 AGC målvärde).
8. peptid identifiering
-
För peptid identifiering skicka de resulterande .raw-filerna från massa spektrometriska analysen till en proteomik sökmotor tillämpa följande inställningar:
Obs: I vår tidigare studie15, tre sökmotorer; Maskot v2.4, Sequest HT och toppar v7.5 användes parallellt och de här angivna inställningar var anställda för alla tre sökmotorer, såvida inte annat anges. Majoriteten av de justerbara inställningarna är universella för peptid och protein identifiering och bör ha motsvarande inställningar i någon given sökmotor.
Spectrum selector:
Min. föregångare massa: 350 Da
Max. föregångaren massa: 5.000 Da
Skanningstyp: fullständig
Signal/brus tröskel: 1,5
Sequence database Sök
Databas: UniProt_SwissProt [version2015_11]
Taxonomi: Homo sapiens
Enzym: ingen
Max. missade Klyvningar: 0
Instrument (endast maskot): ESI-fällan
Min. peptid längd (endast SequestHT): 6
Max. peptid längd (endast SequestHT): 144
Föregångaren massa tolerans: 15 ppm
Fragmentera massa tolerans: 0,05 Da
Statiska ändringar: Carbamidomethyl (C); [Om märkta] TMT10plex (N-Term)
Dynamiska ändringar: Oxidation (M). [Om märkta] TMT10plex (K)
Peptid-spektrum match (PSM) validator
Plastknopp (maskot och Sequest HT endast) eller Decoy Fusion (endast toppar)
Rikta FDR: 0,01
Validering utifrån: q-värde
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den metod som beskrivs här har tillämpats och utvärderats i tre studier före införandet av provet före fraktionering (tabell 1). Den första studien används offline LC för spotting CSF fraktioner på en MALDI målplatta och resulterade i 730 identifierade endogena peptider11. De två följande studierna anställdes isobariska märkning. Främst i ett fall/kontroll studie för identifiering och karakterisering av potentiella biomarkörer i CSF endopeptidome och proteomet samtidigt24, och i den andra studien isobariska märkning användes till övervakning behandlingseffekter i vivo av en γ-sekretas hämmare på peptid uttrycket i CSF över 36 h16. I de fall/kontrollstudie identifierades 437 endogena peptider, 64 som signifikant i koncentration mellan individer med AD och friska kontroller. Tredje, behandlingsstudie, identifierade 1798 endogena peptider, 11 av de övervakade peptiderna kunde visas att svara på behandlingen.
I den fjärde studien var syftet att öka antalet identifierade CSF peptider, särskilt för att identifiera nedre-riklig peptider. Därför peptid före fraktionering av HpH-RP kromatografi ingick och en 10-faldig större CSF provvolymen användes, vilket resulterar i identifiering av 16,395 peptider. I denna studie utfördes ingen isobariska märkning. Förutom prov fraktionering, anställd i den senaste studien en kombinerad peptid identifiering närmar, medan i de tre första studierna utfördes endast en enda databas sökning, vilket till viss utsträckning konton för större antal peptider identifierade. Jämföra resultaten av individuella sökmotorer (maskot, Sequest HT eller toppar) från den senaste studien indikerar att använda algoritmer är i viss utsträckning kompletterande sedan en relativt liten summa, mindre än 15% (2440), av peptider är identifierade genom alla tre sökmotorer (figur 2). Ytterligare, de de novo-sekvensering Sök motor toppar var den mest effektiva i identifierande endogena peptider, men mer än 5.400 peptider inte skulle har identifierats om bara topparna hade varit används (figur 2). Tillämpningen av flera sökmotorer på samma material har potential flera test problem och detta var riktat till ett test av identifiering korrekthet13. MS/MS förvärvade rådata, liksom alla resultat som erhållits i proteomiska sökningar från den senaste studien har gjorts tillgängliga i PRIDE data databasen via ProteomeXchange med ID PXD004863.
Figur 1: ett protokoll system visualisera de viktigaste stegen i metoden. Utvinning av cerebrospinalvätska genom lumbalpunktion följt av centrifugering kan ta bort icke-lösliga material, 2) tillägg av GdnHCl till provet att separera peptid-protein aggregat, öka återvinning av endogena peptider; minskning och alkylering av cystein svavelämnen; isobariska märkning för peptid kvantifiering (valfritt) 3) molekylär vikt filtrering för att skilja de endogena peptiderna från proteinerna, 4) fast fas utvinning att avlägsna salter och andra polar föroreningar, 5) RP HPLC före fraktionering, alkaliska mobil fas lutning och sammanfogning av varje 12th bråkdel, 6) RP HPLC-MS/MS, sura mobil fas lutning, varje konkatenerade bråkdel kör efter varandra, 7) peptid identifiering utförs av MS/MS datasändning från alla 12 analys körs som en enda provet till sökmotorer, därefter peptid IDs jämfördes och en summering av alla unika peptid IDs utfördes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Rapportsammanfattning | TMT märkning (y/n) | HpH-RP fraktionering (y/n) | Motsvarande volym av CSF per MS-analys (µl) | Antal identifierade peptider | Kommentar | Referens |
| Explorativ CSF peptidome analys | n | n | 500 | 730 | Offline LC MALDI mål förberedelse, MALDI-MS; utvärdering av MWCO filter | 4 |
| Kvantitativ jämförelse av CSF peptider; prov från 8 AD + 8 Ctrl | y | n | 200 | 437 | HPLC-ESI MS; kombinerad peptidomic och proteomiska protokoll | 25 |
| AD gamma-sekretas hämmare behandlingsstudien | y | n | 300 | 1798 | HPLC-ESI MS; CSF utvinns vid sex tidpunkter efter behandling | 17 |
| Expandera den CSF peptidome | n | y | 750-1000 | 18.031 | HPLC-ESI MS; kombination av peptid identifiering mjukvaror | 15 |
Tabell 1: En sammanställning av senaste studier av denna grupp som gäller molekylvikt filtrering och massa spektrometriska analys för identifiering av endogena peptider i human CSF.
Figur 2: ett Venndiagram jämföra peptid identifiering resultaten erhålls från var och en av de tre sökmotorerna maskot, Sequest HT och topparna. Totalt 16,395 endogena peptider identifierades. De de novo-sekvensering sökmotor toppar identifierade 10,967 endogena peptider; fragment-Jon fingeravtryck-baserade sökmotorer maskot och Sequest HT identifierade 8118 och 7304 endogena peptider respektive. Identifiering samförståndet mellan alla tre sökmotorer uppgick till 2440 endogena peptider eller 14,8%. Det var en relativt stor identifiering överlappning mellan maskot och Sequest HT, motsvarande 70% av deras kombinerade peptid identifieringar. TOPPARNA hade en jämförelsevis liten identifiering överlappar både maskot och Sequest HT; 20,5% 18,9% respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Införandet av ett hög-pH RP HPLC före fraktionering steg till ett tidigare utvecklade protokoll för återvinning av endogena peptider med molekylvikt ultrafiltrering11 minskad relativ prov komplexitet och möjliggjorde därmed en 5 gånger större provvolymen studeras. Detta, i sin tur ökade koncentrationen av delmängden av peptider i respektive fraktion och förbättrat därmed chanserna att upptäcka låg rikligt peptider.
Genom att utföra en identifiering strategi för endogena peptider som anställd tre proteomiska mjukvaror parallellt, var det möjligt att expandera den kända CSF endopeptidome mer än 10-faldig. Totalt 16,395 endogena peptider identifierades i en preliminär prövning på en poolad CSF provmaterial. Bland identifiering av var ett stort antal endogena peptider härrör från proteiner som tidigare konstaterat i samband med neurodegenerativa sjukdomar. Flera peptider identifieras i ovanstående studier utvärderas för närvarande som biomarkörer i vårt laboratorium. Denna process omfattar flera steg, inklusive kontroller av peptiderna identiteter genom tillsatta CSF med syntetiska analoger märkt med tunga isotoper, inrättandet av riktade massa spektrometriska analyser, bedömningen av peptid stabilitet vid lagring och frysning-tining cykler och analysera olika kliniska kohorter.
Ändringar har gjorts till den ursprungliga protokollet för att undvika införandet av föroreningar (steg 2.5 och 3.5) till följd av en hög koncentration av GdnHCl i provet under MWCO-filtrering. En uppdatering på före fraktionering övertoningen (steg 6.3.1) gjordes, kapacitet långvarig, linjär övertoning används.
De främsta orsakerna till analyten förluster i protokollet här beskrivit kan hänföras till de två RP kromatografiska steg samt MWCO filtrering och SPE prov städa upp steg.
Peptiden förluster på grund av interaktion med MWCO-filter eller proteiner kvar på den, under filtreringen är svårt att undvika och kan vara en källa till inter prov variation.
Ytterligare uppstå selektiva förluster sannolikt i RP-kromatografiska steg. Eftersom peptiden vattenavvisande egenskaper är pH-beroende, kan utför två på varandra följande RP kromatografiska steg på högt och lågt pH, respektive, leda till förluster av en delmängd av de peptider som är alltför hydrofil vid pH ≥9 ska behållas på den kolumnen och likaså en sekund delmängd för hydrofil vid pH ≤ 3 ska behållas.
Jämfört med tidigare använda metoder anställningen av före fraktionering har lett till en 10-faldig ökning av identifiering av endogena peptider. Det har möjliggjort framgångsrika detektion av ett stort antal tidigare oidentifierade peptider och är därför ett värdefullt verktyg i studien och utforskning av de CSF peptidome, och möjligen andra komplexa biologiska prover samt.
Kombinerat med multiplexade isobariska märkning protokollet är avsett att tillämpas ytterligare för att identifiera biomarkörer kandidater för olika neurodegenerativa sjukdomar i CSF, blod och hjärna vävnad.
Varierande återhämtning i provberedningssteg bidrar till den analytiska variationen för analys av CSF proteiner och peptider genom LC-MS. utför isobariska märkning av peptider i ett tidigt skede i prov förberedelse minskar påverkan av sådana variationen avsevärt. Genomförandet av hög-pH med omvänd fas peptid före fraktionering jämfört med tidigare rapporterade prov förberedelse protokoll, och ökade antalet identifierade peptider med en faktor 5. Identifiering av endogena peptider från MS/MS-data förbättrades avsevärt när man kombinerar olika peptid identifiering programvara program, sysselsätter olika sökalgoritmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga konkurrerande intressen, finansiella eller andra, mellan författarna har rapporterats.
Acknowledgments
Stort tack Tanveer Batth och kolleger om råd i ställa in metoden före fraktionering.
Detta arbete stöds av finansiering från Vetenskapsrådet, Wallström och Sjöblom Foundation, Gun och Bertil Stohne Foundation Stiftelse, Stiftelsen Magnus Bergwall, Åhlén-stiftelsen, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla bidrag, Knut och Alice Wallenbergs stiftelse, Frimurarestiftelsen, och FoU-Västra Götalandsregionen.
De huvudsakliga mottagarna av finansiering för detta projekt var Kaj Blennow, Henrik Zetterberg och Johan Gobom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
- Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
- Höglund, K., et al. Alzheimer's disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
- Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
- Yuan, X., Desiderio, D. M. Human cerebrospinal fluid peptidomics. J Mass Spectrom. 40 (2), 176-181 (2005).
- Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
- Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
- Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).
- Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
- Hansson, K. T., et al. Expanding the cerebrospinal fluid endopeptidome. Proteomics. 17 (5), (2017).
- Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
- Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
- Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).
- Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
- Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
- Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
- Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).
