Summary
Bu yöntem, ubiquitin zincir topolojislerindeki küresel değişikliklerin değerlendirilmesini açıklar. Değerlendirme, kütle spektrometresi tabanlı hedefli proteomik yaklaşımın uygulanmasıyla gerçekleştirilir.
Abstract
Bir proteom içindeki her yerde bulunan zincir topolojilerinin küresel profilinin değerlendirilmesi, çok çeşitli biyolojik soruları yanıtlamak için ilgi çekicidir. Burada özetlenen protokol, bir zincire dahil edilen ubiquitin'in triptik sindirimi sonrasında kalan di-glisin (-GG) değişikliğinden yararlanır. Bu topoloji karakteristik peptitleri ölçerek her bir ubiquitin zincir topolojisinin göreceli bolluğu belirlenebilir. Bu peptitleri paralel reaksiyon izleme deneyi ile ölçmek için gereken adımlar, ubiquitin zincirlerinin stabilizasyonu dikkate alınarak bildirilmektedir. Ağır kontrollerin hazırlanması, hücre lizisi ve sindirim, uygun kütle spektrometresi kurulumu ve veri analizi iş akışı ile birlikte açıklanmaktadır. Protokolün en iyi duruma getirilmesi sonuçların nasıl etkileyebileceğine ilişkin örnekler eşliğinde, ubiquitin topolojisinde pertürbasyonlarla bir örnek veri kümesi sunulmaktadır. Bir kullanıcı, özetlenen adımları izleyerek, biyolojik bağlamı içinde her yerde bulunan topoloji manzarasının küresel bir değerlendirmesini gerçekleştirebilecektir.
Introduction
Biyolojinin fenotipik kontrolünün başlıca iticileri oldukları için protein fonksiyonu ve stabilitesinin yakın düzenlenmesi son derece önemlidir. Bir proteinin işlevi iki bileşenden oluşturulur: içsel polipeptid dizisi ve herhangi bir posttranslational modifikasyon (PTM). Glikosilasyon, fosforilasyon, asetilasyon ve metilasyon1dahil olmak üzere çeşitli kimyasal PTM'ler tanımlanmıştır. 1975'te Goldstein ve ark.2 küçük bir protein tanımladı ve her yerde bulunan doğası nedeniyle her yerde olarak adlandırdı. Ubiquitin protein bozulmasında önemli bulunmuştur3. Bununla birlikte, o zamandan beri ubiquitin'in bir sinyal molekülü olarak işlevinin protein stabilitesinin düzenlenmesinin çok ötesine uzandığı tespit edilmiştir. Ubiquitin sinyali, protein stabilizasyonu, otofaji, hücre döngüsü kontrolü ve protein kaçakçılığı4gibi çok çeşitli diğer biyolojik işlevlerde yer almaktadır.
Diğer PTM'ler genellikle belirli bir site için ikili (yani protein modifiye edilir veya değiştirilmeden bırakılır) iken, ubiquitin bir proteini hem monomer hem de polimerik zincir olarak değiştirebilir ve ekli her yerde bulunur. Ayrıca, bu poliubiquitination zinciri, sekiz bağlantı sitesinden birine bağlı önceki ubiquitin'in her yerde bulunması ile çeşitli topolojilerde gelişebilir5,6. Ubiquitin, ubiquitin'in C-terminusunun yedi lizin kalıntılarından birine bağlı olduğu çok çeşitli enzip enzymatic bir işlemle transfer edilir (K06, K11, K27, K29, K33, K48 veya K63) veya önceki her yerde bulunanın N terminali (M1 veya doğrusal her yerde bulunma olarak adlandırılır)5,6. Bu zincir topolojisi, modifikasyonun altındaki proteinin kaderinin anahtarıdır. Örneğin, K48 veya K11 bağlantılı bir zincirle yapılan değişiklik, proteozomdaki değiştirilmiş proteinin bozulmasına yol açarken, NF-kB sinyalinin aktivasyonu için doğrusal bir zincir gereklidir. Bu nedenle, bu zincir topolojilerinin göreceli dağılımı çok çeşitli biyolojik sorularla ilgilidir.
Kütle spektrometresi (MS) kullanımı, antikor bazlı veya benzeşim tabanlı etkileşimlere dayanmadığı için her yerde zincir topoloji analizine özel bir fayda sağlar7,8, birçoğu sınırlı özgüllüğe sahiptir ve çeşitli zincir türleri arasında ayrım yapmaz. Farklı bir algılama olasılığı genetiği değiştirilmiş her yerde mutantlar kullanmaktır. Burada, belirli bir lizin, ubiquitin tarafından modifikasyonu destekleyemeyen arginin ile değiştirilir. Substrat proteininde ubiquitin zinciri oluşumunun olmaması daha sonra belirli bir topoloji için kanıt olarak yorumlanır9.
Her yerde bulunan proteinlerin MS tabanlı tanımlanması, ubiquitin C-terminusunun, MS analizi için numunelerin proteolitik hazırlanması sırasında tripsin tarafından tanınan ve C-terminal çift glisini ayıran 74 pozisyonunda bir arginin kalıntısı içermesi gerçeğine dayanmaktadır. Bu GlyGly (-GG), substrat proteininin lizin kalıntısının ε-amino grubuna bağlı kalır. Ubiquitin topoloji analizi için, modifikasyon ubiquitin yedi lizin kalıntılarından birinde meydana gelir. Bu, topolojilerin her birine özgü, GG tarafından değiştirilen bir lizin kalıntısı taşıyan yedi anahtar peptit kümesi oluşturur (Şekil 2). Örneğin, K06 topolojisi ile, amino asit dizisindeki 6 pozisyonundaki lizin, bu lizine eklenen 114 Da'nın -GG modifikasyonu ile triptik sindirimden korunacaktır.
MS tarafından önceden belirlenmiş belirli peptitlerin tanımlanması, hedeflenen proteomik veya daha spesifik olarak hedeflenen peptit alımı10olarak adlandırılır. Kullanılan kütle spektrometresinin performansına bağlı olarak iki yöntem geliştirilmiştir. Bunlar, çoklu reaksiyon izleme (MRM) ve paralel reaksiyon izleme (PRM) olarak da adlandırılan seçilmiş reaksiyon izlemedir (SRM). SRM, öncü m/z ve ürün iyon m/z'den oluşan geçişlerin seçimini içerir. Tersine, PRM yalnızca öncül m/z gerektirir. Seçim sonrası, ürün iyonlarının tam bir anket taraması yapılır. Bu, ölçüm11'denönce belirli kütle spektrometresinde nicellik için uygun ürün iyonlarının seçilmesinin gerekli olmaması avantajına sahiptir. Hem SRM hem de PRM, cihaza bağlı olarak zamanlanabilir. Planlama, peptitler kromatografik sistemden tanımlanmış saklama sürelerinde elde olduğu için, belirli bir iyonun analiz için dahil edileceğini bir zaman penceresi atama uygulamasıdır. Herhangi bir zamanda sorgulanan iyonların sayısını azaltmak, o sırada planlanan iyonların sorgulanma sıklığını arttırır, böylece veri doğruluğunu artırır.
Genel olarak, ubiquitin topolojisi için hedeflenen proteomik uygulaması, hedeflenen diğer proteomik deneylerle aynıdır. Bununla birlikte, iki temel fark önemlidir: Birincisi, her yerde bulunan zincirlerin stabilitesi göz önünde bulundurulmalıdır. Hücre lizisi üzerinde zincirleri hızla bozan birden fazla güçlü deubiquitinating enzim (DUB) vardır. Her yerde bulunan spesifik proteazlar iki kategoriye ayrılır: tiyoesterazlar ve metalloproteazlar. Ubiquitin-hidrolazların çoğu tiyoesterazdır ve aktif merkezlerinde sistein kalıntısı taşır. Bu sistein kalıntısını alklating atederek, inaktive edilebilirler. Bu nedenle, N-etirilimid (NEM) gibi alkilleştirici ajanlar içeren ubiquitin stabilizasyon tamponlarının ve yüksek oranda denatüre edici kimyasalların kullanılması ve numunelerin soğutulması başarılı bir analiz için hayati öneme sahiptir. İkincisi, diğer hedeflenen deneylerin aksine, peptit seçimi sabittir. Tipik bir hedefli deneyde, iyi kromatografik ve iyonlaşma performansı için proteotipik bir peptit seçilebilir. K48 gibi bazı topoloji karakteristik peptitler için bu özellikler iyidir, diğerleri için ise daha az arzu edilir. Örneğin, tipik bir ters faz kurulumunda K33 kromatografisi, gerilmiş bir elüsyon profilinin oluşumu nedeniyle zayıftır ve K27 peptidinin zayıf iyonlaşma özellikleri görünürlüğünü MS12azaltır.
Bu protokolde, PRM tarafından biyolojik bir numunenin ubiquitin topoloji değerlendirmesinin nasıl gerçekleştirildiğini açıklıyoruz. Prosedür için örnek veriler, birkaç farklı hücre tipinde MG-132 inhibitör tedavisi kullanılarak proteazomun pertürbasyonu kullanılarak sunulmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ağır peptit standardının hazırlanması
- Satın alınan ağır peptitlerin tedarikçisine ve kalitesine bağlı olarak, ağır peptitlerin seyreltilmesi gerekecektir. Bu protokol, Tablo 1'de bildirilen peptit dizilerini, Lizin (13C6 15 N2-lizin) veya Arginin(13C615 N4-arginin) olarak değiştirilmişC-terminalamino asit ile birlikte kullandı.
- Ağır peptitleri karıştırın, karışımı% 50 asetonitril (ACN) ile seyrelterek her peptitle 10 μM'de bir peptit karışımı oluşturun.
- Peptit karışımının aliquotlarını oluşturun ve -80 ° C'de saklayın.
2. Numune hazırlama
- Örnek lizis
NOT: Numune hazırlama sırasında ubiquitin zincirlerinin stabilitesi göz önünde bulundurulmalıdır. Biyolojik numuneleri ve tamponları 4 °C'de soğutun ve numuneleri mümkün olduğunca hızlı bir şekilde ubiquitin stabilizasyon tamponu ekleyin.- Suda 1 M NH4HCO3 (amonyum bikarbonat) çözeltisi hazırlayın ve 1 M NaOH kullanarak pH'ı 8'e ayarlayın.
- Suda 200 mM N-etilmelamid (NEM) çözeltisi hazırlayın.
- 50 mM NH 4 HCO3/10 mM NEM'de8M üre kullanarak ubiquitin stabilizasyon tamponu hazırlayın.
NOT: 8 M ürenin 5 mL'lik bir çözeltisi, üre ile doymuş bir çözeltideyken suyun genişlemesi göz önüne alındığında 5 mL'den daha az su gerektirecektir.
DİkKAT: Ürenin yüksek sıcaklıklarda poliüre oluşturma eğilimi nedeniyle tamponu 50 °C'nin üzerinde hazırlamayın. - 0,5 μg/μL protein hedefleyen ubiquitin stabilizasyon tamponunda araştırılacak biyolojik numuneyi yeniden diriltmek ve hücreleri numune için uygun bir yöntemle üzmek. Bu protokoldeki hücre hatları için her darbe arasında buz üzerinde 10 s mola ile %70 şiddette ayarlanmış SFX 150 Branson sonifierli üç adet 10 sn darbeden oluşan sonication yöntemi kullanılmıştır.
- Masa üstü santrifüjde 4 °C'de 10 dakika boyunca 18.000 x g'da santrifüj örneği.
- Süpernatantı taze düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Numuneler gerekirse bu noktada -20 °C'de saklanabilir.
- Numune ve kontrollerin hazırlanması
- Numuneler donmuşsa, üreyi hızla eritmek için çözülürken karıştırın (örneğin, bir termomikser ile).
DİkKAT: Ürenin yüksek sıcaklıklarda poliüre oluşturma eğilimi nedeniyle 50 °C'nin üzerindeki sıcaklıkları kullanmayın. - Masa üstü santrifüjde 4 °C'de 10 dakika boyunca 18.000 x g'da santrifüj örneği.
- 20 μg numuneyi taze bir düşük bağlı mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hacmi ubiquitin stabilizasyon tamponu ile 50 μL'ye ayarlayın.
- Normalleştirilmiş bir ubiquitin stabilizasyon tamponu (50 μL) hacmi kullanarak negatif bir kontrol oluşturun. Bu örnekte, her peptitin ışık versiyonu bulunmamalı ve bu da başaklı ağır peptitlerden kaynaklanan herhangi bir ışık kirlenmesinin gözlemlenmesine izin vermemelidir. Bu negatif kontrol, bölüm 3.1'de açıklanan PRM'nin saklama süresi zamanlaması için de kullanılmıştır.
- Ayrıca ubiquitin stabilizasyon tamponu ve normalleştirilmiş ubiquitin stabilizasyon tampon hacmine (50 μL) ticari olarak mevcut zincir tiplerinin eklenmesi ile pozitif bir kontrol oluşturuldu. Genellikle K63, K48 ve M1 mevcuttur. Temsili sonuçlarda 20 ng K48, K63 ve M1 kullanılmıştır.
- Numuneler donmuşsa, üreyi hızla eritmek için çözülürken karıştırın (örneğin, bir termomikser ile).
- Azaltma, alkilasyon ve sindirim
- Suda 50 mM amonyum bikarbonat (NH4HCO3)çözeltisi hazırlayın ve numuneyi 1 M NaOH ile pH = 8 olarak ayarlayın.
- LB suyunda yetişen bir E. coli kültürü, bir pelet oluşturmak için 5 dakika boyunca 5.000 x g santrifüjlendi, daha sonra 5 μg / μL'de ubiquitin stabilizasyon tamponunda resüspenzyondan önce PBS ile 2x yıkandı.
- Her numuneye ve kontrole 1 μg E. coli lysate ekleyin. Bu protokol E. coli (DH10B) kullanır, ancak ubiquitin içermeyen herhangi bir karmaşık lisat kullanılabilir. Ubiquitin'in tüm ökaryotlar için ortak olduğunu unutmayın.
NOT: E. coli lysate matrisi kullanmak, plastik eşyalara nonspesifik yapışma nedeniyle peptit kaybını azaltır. Bu özellikle negatif kontrolde veya sınırlı protein içeriğine sahip örneklerde fark edilir ve K6312'ningözlemi üzerinde güçlü bir etkiye sahiptir. - MS sınıfı suda 500 mM tris (2-karboksitetil)fosfin (TCEP) çözeltisi hazırlayın (DTT alternatif olarak kullanılabilir).
- 50 mM'lik son konsantrasyona TCEP ilavesi ile numuneleri ve kontrolleri azaltın. Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika kuluçkaya yatırmadan önce kısa bir süre girdap. DTT kullanılırsa, sıcaklık 50 ° C'ye yükseltilmelidir.
DİkKAT: Ürenin yüksek sıcaklıklarda poliüre oluşturma eğilimi nedeniyle 50 °C'nin üzerindeki sıcaklıkları kullanmayın. - NH4HCO 3'te 550 mM kloroasetamid (CAA) çözeltisihazırlayın. Karanlıkta sakla.
- 55 mM'lik son konsantrasyona CAA ekleyerek numuneleri ve kontrolleri alkillatın. Karanlıkta RT'de 20 dakika kuluçkaya yatırmadan önce Vortex kısa bir süre.
NOT: CAA, bir lizin kalıntısında çift karbamidometil modifikasyon (114.0429) şansını azaltmak için azaltma maddesi olarak iodoasetamid yerine kullanılır -GG modifikasyonu (114.0429)13. - Protein içeriğine 1:25 (w/w) oranında numunelere endopeptidaz LysC ekleyin. 37 °C'de 3 saat kuluçkaya yaslanın.
- Numuneleri ve kontrolleri 200 μL 50 mM NH 4 HCO3pH =8 (1:5 v/v) ile seyreltin.
- Protein içeriğine 1:25 w/w oranında trypsin ekleyin. 37 °C'de 12 saat kuluçkaya yaslanın.
- Her numuneye ve kontrol numunesine 1:10 oran v/v'de MS sınıfı suya %10 formik asit (FA) çözeltisi ekleyin. C18 temizliğinden önce pH'ın <3) olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse daha fazla formik asit ekleyin.
- Her numune ve kontrole bölüm 1'de oluşturulan ağır peptit standardının 0,5 μL'lik kısmını ekleyin.
- Peptit temizliği
- Çeşitli üreticiler C18 temizleme ipuçları veya plakaları sunar. Kullanılan ürün için üreticinin talimatlarını izleyin ve eluted peptitleri vakumlu santrifüjde kurutun, MS analizine hazır.
3. LC-MS/MS tarafından analiz
- Ağır peptit standardı üzerinde ilk PRM analizini planlanmamış bir şekilde gerçekleştirin.
- Kurutulmuş numuneleri 10 μL MS yükleme tamponunda %2 ACN/%0,05 trifluoroasetik asit (TFA) olarak yeniden sunun.
- Bir HPLC'yi nano akış ms. Form lineer gradyanları için tasarlanmış ters fazlı C 18 analitik sütun (75 μm x 15 cm,2 μm 100 şC 18 boncuk) ile donatın. Burada analitik sütunun ömrünü korumak için bir kurbanlık tuzak sütunu (75 μm x 2 cm, 3 μm,100 şC 18 boncuk) kullanılmıştır ancak gerekli değildir.
- Analitik sütunun çıkışını yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresinde bir nano-ESI kaynağıyla birleşin.
- Kütle spektrometresi için uygun bir hedefli proteomik yöntem kullanın. Örneğin, bir Q-Exactive artı iki deneme yönteminde, Tam MS ve PRM deneyi arasında geçiş yapın. Tam MS deneyi için, Maksimum BT olarak 1e6 ve 240 ms AGC hedefiyle 120.000 çözünürlük kullanıldı. PRM deneyi için, aynı AGC hedefi ve maksimum BT, 60.000 daha düşük çözünürlükte ve 1,2 m/z izolasyon penceresi ile kullanıldı.
- HPLC otomatik örnekleyiciyi kullanarak analitik sütuna 200 ng negatif kontrol enjekte edin. Analitik sütundaki örneğe doğrusal bir degrade uygulayın ve ~45 dakikalık bir süre boyunca ACN konsantrasyonunu %2-25 arasında artırın.
NOT: Tipik ubiquitin topoloji karakteristik peptitlerin düşük hidrofilik doğası nedeniyle proteomik için % 25 ACN konsantrasyonu normalden daha düşüktür. Diğer peptitler ölçülecekse, iyi hedef ayrımı elde etmek için daha yüksek bir ACN konsantrasyonu isteilebilir. - Zamanlanmış bir ekleme listesi oluşturmak için bölüm 4.2'de açıklandığı gibi zamanlama çalıştırmasının sonuçlarını çözümleyin.
- Örneklerin analizi
- Bölüm 4.2'de oluşturulan zamanlanmış ekleme listesinin kullanımı dışında, kalan örnekleri zamanlama için açıklandığı gibi 3.1'de çalıştırın.
NOT: Sonraki örneklerde önceki çalıştırmadan taşıma algılanmamasını sağlamak için pozitif denetimden sonra bir boşluk çalıştırılmalıdır.
- Bölüm 4.2'de oluşturulan zamanlanmış ekleme listesinin kullanımı dışında, kalan örnekleri zamanlama için açıklandığı gibi 3.1'de çalıştırın.
4. Yazılım analizi
- Kullanılan MS için uygun biçimlendirmenin bir ekleme listesini oluşturun. Bu protokol, iyi belgelenmiş destek ve yardım sunan açık kaynaklı Skyline (sürüm 19.1.0.193) (https://skyline.ms) kullandı. İhracat yalıtım listesi olanağı kullanılarak birkaç kütle spektrometresi için bir ekleme listesi oluşturulabilir.
- Yeni bir Skyline belgesi açın.
- Ağır topoloji karakteristik peptitlere uygun ağır izotop modifikasyonlarını seçin. Ayarlar'da| Değişiklik sekmesinin altındaki Peptit Ayarları, olası değişikliği görmek için ad alanına tıklayın. Seçim, satın alınan ağır peptitlerin izotopik durumuna dayanır. Bu örnekte, C-terminusunda ağır bir Lizin(13C615N 2-lizin) veya ağır bir Arginin(13C615N4-arginin) taşıyan sentetik peptitler kullanılmıştır. Uygun etiketler: "Etiket:13C(6)15N(2) (C-terim K)" ve "Etiket:13C(6)15N(4) (C-terim R)".
- Ayarlar'ı seçin| Geçiş. Filtre sekmesinin altında Öncül Ücretler 2, 3, 4bulunur.
- Düzenle'yi seçerek peptit ekleyin| Ekle| Peptitler.
- Topoloji-karakteristik peptit dizisi ve bir protein adı (örneğin, "Chain–K63") dahil olmak üzere ilgili alanları doldurun.
- Hedefler panelinde gösterilen her peptidi genişletin. istenmeyen ücret durumlarını silin. Her topoloji karakteristik peptit için kullanılan kütle spektrometresi temel alınarak farklılık gösterebilecek tercih edilen şarj durumu ve çarpışma enerjisi Tablo 1'degösterilmiştir.
- Her topoloji karakteristik peptit için (GG'nin sıraya dahil edildiği M1 hariç) sırayı sağ tıklatın ve Değiştir 'iseçin. Ad alanını tıklatıp <Tümünü göster'i seçerek yapısal bir değişiklik olarak GG ekleyin ... > "GlyGly (K)"yi seçmeden önce.
- Yalıtım listesi dosyasını verin| İhracat| Yalıtım Listesi, enstrüman türünü seçin ve yöntem türünü Standartolarak ayarlayın. Tamam seçildiğinde, PRM yöntemi oluşturmak için kullanılabilecek bir *.csv dosyasını kaydetmek için bir istem açılır.
- Açık kaynaklı Skyline yazılımı kullanılarak burada açıklanan ağır peptit zamanlama çalıştırmasına dayalı zamanlanmış bir ekleme listesi oluşturun.
- Bölüm 4.1'de açıklandığı gibi bir hedef liste oluşturun.
- Dosya'yı seçerek zamanlama çalıştırmasını 3.1'de içe aktarın| İçeri aktar| Sonuçlar.
- Kimlikleri gözden geçirin. Her peptit için ağır sinyal, her ağır peptit girişi için kütleye tıklayarak gözlemlenebilir. Tepenin doğru tanınması genellikle otomatik olarak belirlenir, ancak yazılım x ekseni altında tıklat ve sürükle'yi kullanarak tepe noktasını seçerek manuel kürasyon gerektirebilir.
- Ağır varyantlar için seçilen saklama süreleri hafif versiyonlara da uygulanır, böylece PRM için bir zamanlama oluşturulur. Zamanlama penceresi Ayarlar altında değiştirilebilir| Peptit Ayarları Tahmin sekmesini kullanarak, Zaman Penceresinideğiştirerek .
- Zamanlanmış bir ekleme listesi artık Dosya kullanılarak dışa aktarılabilir| İhracat| Yalıtım listesi ve uygun enstrüman türünü seçme ve yöntem türünü Zamanlanmış olarakayarlama .
- Verileri analiz edin.
- Örnekleri bölüm 4.2'deki zamanlama çalıştırması analiziyle aynı şekilde içe aktarın.
- Tüm örneklerin tamamen içe aktarilmesinden sonra, geçişlerin kürasyonu önerilir. Bu, parazit veya zayıf sinyal-gürültü oranlarıyla geçişlerin kaldırıldığı işlemdir. Kürasyondan önce ve sonra kromatogram örneği Şekil 4'te gösterilmiştir.
- Veriler artık ilgili grafiklere sağ tıklayıp Verileri kopyala'yı seçerek veya Dosya seçilerek dışa aktarılabilir| İhracat| Sonuçlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PRM tarafından her yerde yapılan zincir analizinin kullanımını göstermek için üç hücre çizgisi seçildi: bir fare melanom hücre hattı B16 ve iki yaygın insan hücresi hattı A549 (adenokarsinomik alveolar bazal epitel hücreleri) ve HeLa (serviks kanseri hücreleri). Bu kültürler, hasat öncesinde 4 saat boyunca 0, 10 veya 100 mM MG-132 ile tedavi edilmeden önce uygun medyada midexponential faza büyüdü. MG-132, ubiquitin konjuge proteinlerin proteazom14tarafından bozulmasını önleyen bir proteozom inhibitörüdür. Bu göz önüne alındığında, ubiquitin zincir analizini göstermek uygun bir test koşuludur. K48 zincirindeki sonuç artışı Şekil 3'tegörülebilir. Proteazom inhibitörü tedavisi K48 zincirlerinde bir artışa neden oldu15.
Girişte açıklandığı gibi, SRM veya MRM'den farklı olarak PRM, öncü iyon seçiminden sonra tam bir ürün iyon taraması gerçekleştirir. Bu, ürün iyonlarının çalıştırmadan önce belirtilmesi gerekmediği anlamına gelse de, çalıştırma sonrası küratörlüğünü yapmaları gerekir. Kürasyon, geçişlerin hedeflenen peptidi gerçekten temsil ettiği süreçtir. Şekil 4 kürasyondan önce ve sonra K48 için ürün iyon kromatogramını göstermektedir. Parazite bağlı olarak muhtemelen tutarsız bir elution profiline sahip bir sinyale sahip ürün iyonları çıkarıldı. Daha sonra sinyal-gürültü oranının bu tür geçişler için daha az elverişli olduğu göz önüne alındığında düşük yoğunluklu ürün iyonları kaldırıldı. Kürasyon sırasında seçilen en uygun geçişler genellikle deneyler arasında tutarlı olacaktır ve kullanılan kütle spektrometresi, kromatografik koşullar, analiz ayarları ve numunenin biyolojik arka planına bağlı olarak farklılık gösterebilir. Bu nedenle, her araştırma için geçişlerin uygun şekilde kürlenmesi gerekir. Daha fazla geçişin dahil edilmesi ve böylece teknik çoğaltmalar ile nicelik için daha temiz veriler arasında bir denge de gereklidir.
Bu deneyde tanımlanan her yerde zincir topolojilerinin her biri için tipik ürün iyon kromatogramları Şekil 5'te gösterilmiştir. K27 ve K29 burada atlandı çünkü bu biyolojik koşullar altında sinyal tespitin altındaydı. Burada gösterildiği gibi K33'ün elüasyon profili PRM analizi için yaygın olarak kabul edilenden çok daha genişti. Bununla birlikte, daha iyi elüsyon profillerine sahip peptitlerin alternatif seçimi ubiquitin zincir analizinde mümkün değildir ve bu profile dayalı bir yorum yapılmalıdır. K33 özellikle ilgi çekiciyse, değiştirilen kromatografik koşullar bu zincir tipinin nicelliğini artırabilir, ancak diğer zincir türlerinin zararına olabilir.
Bir PRM deneyi tasarlanırken, sinyalden gürültüye artırılarak nicelik için kullanılan ürün iyonlarının sinyalini en üst düzeye çıkarmak tercih edilir. Çarpışma enerjisinin optimizasyonu (yani, kütle spektrometresi tarafından öncü peptit iyonlarını ürün iyonlarına parçalamak için kullanılan enerji) sinyalin geliştirilebileceği bir araçtır16. Şekil 6'da gösterilen K63 ve M1'in gözlenen tepe alanlarına sahip tek bir numunenin tekrarlanan enjeksiyonlarına 14-28arasında bir çarpışma enerjisi aralığı uygulanmıştır. Görüldüğü gibi, K63 için 26'lık daha yüksek bir çarpışma enerjisi en uygunken, M1 için 18'lik daha düşük bir enerji idealdi. Her topoloji karakteristik peptit için çarpışma enerjisi ve değiştirilmemiş ubiquitin parçaları seçimi Tablo 1'degösterilmiştir. Bu çarpışma enerjilerinin, kullanılan kütle spektrometresi ve parçalanma yöntemine göre optimize edilmesi gerekebilir.
Şekil 1: Her yerde bulunan eş zamanlının şematik gösterimi. Ubiquitin ilk olarak ATP'ye bağımlı bir şekilde bir E1 enzimi ile bağlanır. Aktive edilen ubiquitin daha sonra bir E2 enzimine aktarılır ve daha sonra ubiquitin'i substrat proteinine aktarmak için bir E3 ligaz ile birleştirilir. Bu işlem, substrat proteini üzerinde bir ubiquitin zinciri oluşana kadar birkaç kez tekrarlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ubiquitin topolojisi-karakteristik peptidin türetmesini gösteren diyagram. Post tryptic digestion yukarı akış bağlama bölgesi, aşağı akış ubiquitin'in -GG C terminali ile türetilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: B16 fare hücresi hattı ve A459 ve HeLa iki insan hücre hattı için MG-132 tedavisi altında K48 zincirinin karşılaştırılması. A459'da artan MG-132 konsantrasyonları K48 zincirlerinin stabilizasyonuna yol açtı. B16 ve HeLa hücrelerinde 10 mM veya 100 mM MG-132 ile tedavi altında bir artış görüldü. 10 mM'den 100 mM'ye kadar gözlenen azalma, B16 ve HeLa hücrelerinin MG-132'ye duyarlılığının artması ve hücre ölümüne yol açtığı ile açıklanabilir. Hata çubukları geçişlerin standart sapmalarını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: M1 topoloji karakteristik peptidinin ürün iyon kromatogramları, girişim veya düşük yoğunluk için geçişlerin kürasyonundan önce ve sonra. X eksenindeki saklama süresi dakika olarak gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Çeşitli topoloji karakteristik peptitlerin tipik ürün iyon kromatogramı ve iki modifiye edilmemiş ubiquitin peptidi. Dakikalar içinde elüasyon süresi ve her peptit için gözlenen kütle hatası, ilgili tepenin tepe noktasının üzerinde bildiriliyor. Noktalı çizgiler, tepe alanının belirlenmesi için pencereyi de gösterir. X eksenindeki saklama süresi dakika olarak gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: K63 ve M1 için bir dizi normalleştirilmiş çarpışma enerjileri üzerinde gözlenen tepe alanı. Farklı renkler, her geçişin katkıda bulunduğu iyon yoğunluğunu temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Zincir türü | Topoloji Karakteristik Peptit | Ücret durumu | Normalleştirilmiş Çarpışma Enerjisi |
| K06 | MQIFVK[GG]TLTGK | 3 | 18 |
| K11 | TLTGK[GG]TITLEVEPSDTIENVK | 3 | 18 |
| K27 | TITLEVEPSDTIENVK[GG]AK | 3 | 18 |
| K29 | AK[GG]IQDK | 2 | 22 |
| K33 | IQDK[GG]EGIPPDQQR | 3 | 18 |
| K48 | LIFAGK[GG]QLEDGR | 3 | 24 |
| K63 | TLSDYNIQK[GG]ESTLHLVLR | 4 | 26 |
| M1 (doğrusal) | GGMQIFVK | 2 | 18 |
| Değiştirilmemiş Ubqiuitin | ESTLHLVLR | 2 | 26 |
| Değiştirilmemiş Ubqiuitin | TITLEVEPSDTIENVK | 2 | 18 |
| Değiştirilmemiş Ubqiuitin | TLSDYNIQK | 2 | 18 |
Tablo 1: İnsan her yerde bulunan topoloji karakteristik peptitler, en gözlemlenebilir yük durumu ve olumlu normalleştirilmiş çarpışma enerjisi için diziler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir proteom içindeki ubiquitin durumunun analizi, çok çeşitli biyolojik sorular için giderek daha fazla önem taşımaktadır. Bir örneğin her yerde bulunma durumunun tanımı sadece her yerde bulunan proteinlerin profiline değil, aynı zamanda bu tür her yerde bulunanların topolojisine de odaklanmalıdır. Bu topolojinin burada açıklandığı gibi hedeflenen MS tarafından değerlendirilmesi, çok çeşitli biyolojik araştırmalarda rol oynar.
Burada özetlenen protokolün küresel bir topoloji profili sağladığı anlaşılmalıdır. Aşağıdan yukarıya proteomik bir yaklaşımın kullanılması, ubiquitin peptitleri de dahil olmak üzere her yerde bulunan peptitlerin belirlenmesini sağlar. Ubiquitin peptidlerinin her yerde gözlemlenmesi, zincir topolojisinin belirlenmesine izin verir, ancak ubiquitin hedefine olan bağlantı kaybolur. Bu nedenle, herhangi bir protein üzerinde belirli bir zincir topolojisi belirlenemez, ancak küresel bir topoloji profili türetilir. Yöntem, daha hedefli sonuçlar sağlamak için bir zenginleştirme stratejisiyle de birleştirilebilir. Böyle bir zenginleşme, zincir istikrarını ve zincirlerin zenginleşme sonrası bolluğunu göz önünde bulundurmalıdır. Zincir topolojisinin tespiti, zenginleştirme stratejisinin sağladığı saflıkla sınırlıdır, çünkü kirletici bir proteinle bağlantılı bir ubiquitin topolojisini ilgi proteinine bağlı olanlardan ayırt etmek mümkün değildir. Başarılı bir analizi kolaylaştıran bu protokoldeki kritik adım, ubiquitin proteinini sindirirken ubiquitin zincirini korumanın dengelenmesidir. Bu, her yerde bulunanların enzimmatik sindirime karşı direnci ile birleştiğinde zincir kırılması eğilimi nedeniyle zordur. Ayrıca, bazı topoloji karakteristik peptitlerin sıvı kromatografik eşleştirilmiş kütle spektrometrik analizine daha az elverişli doğası göz önüne alındığında, bir destek matrisinin eklenmesi ve MS koşullarının dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi gerekir.
Bu protokolde, tüm her yerde bulunan zincir türlerinin aynı anda değerlendirilebileceği bir araç belirtmiş olsak da, protokolün belirli bir zincir topolojisine göre çeşitli yönlerini ayarlamak da mümkündür. Kromatografik koşulları manipüle etmek veya ağır peptit konsantrasyonlarını değiştirmek, bir araştırmanın doğruluğunu artırabilir, belirli bir zincir topolojisi için sonuçları iyileştirir ve araştırmayı önerilen biyolojik soruya uyarlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Yazarlar, temsili sonuçlarda açıklandığı gibi MG-132 tedavisi ile hücresel peletlerin oluşturulmasındaki yardımı için Céline Jeanty'ye ve protokolde kullanılan E. coli peletlerini temini için Elise Mommaerts'e teşekkür etmek istiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (ACN) | Merck | 100029 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC) | Fluka | 9830 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 16 | |
| Chloroacetamide (CAA) | Sigma | 22790 | |
| Eppendorf LoBind | Eppendorf | 22431081 | |
| Formic acid (FA) | Thermo Fisher Scientific | 85178 | |
| Heavy Peptides | JPT Peptide Technologies | ||
| HPLC | Dionex | Ulitimate 3000 | |
| LC Column | Thermo Fisher Scientific | 160321 | |
| Lys C | Wako | 125-05061 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q-Exactive Plus | |
| N-ethylmaleimide (NEM) | ACROS Organics | 156100050 | |
| Positive Control Chain K48 | Boston Biochem | UC-240 | |
| Positive Control Chain K63 | Boston Biochem | UC-340-100 | |
| Positive Control Chain M1 | Boston Biochem | UC-710B-025 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S5881 | |
| Sonifier | Branson sonifier | SFX 150 | |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigam | T6508 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Thermo Fisher Scientific | 77720 | |
| Trypsin | Promega | V1511A | |
| Urea | Sigma | 51456 | |
| Waters μElution C18 plates | Waters | 186002318 |
References
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
- Goldstein, G., et al. Isolation of a polypeptide that has lymphocyte-differentiating properties and is probably represented universally in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (1), 11-15 (1975).
- Glickman, M. H., Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: Destruction for the sake of construction. Physiol. Rev. 82, 373-428 (2002).
- Pickart, C. M., Eddins, M. J.
- Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A.
- Komander, D., Rape, M.
- Mattern, M., Sutherland, J., Kadimisetty, K., Barrio, R., Rodriguez, M. S. Using Ubiquitin Binders to Decipher the Ubiquitin Code. Trends in Biochemical Sciences. 44 (7), 599-615 (2019).
- Newton, K., et al. Ubiquitin chain editing revealed by polyubiquitin linkage-specific antibodies. Cell. 134 (4), 668-678 (2008).
- Spence, J., et al. Cell cycle-regulated modification of the ribosome by a variant multiubiquitin chain. Cell. 102 (1), 67-76 (2000).
- Borràs, E., Sabidó, E. What is targeted proteomics? A concise revision of targeted acquisition and targeted data analysis in mass spectrometry. PROTEOMICS. 17 (17-18), (2017).
- Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. PROTEOMICS. 15 (5-6), 880-890 (2015).
- Longworth, J., Dittmar, G. Assessment of Ubiquitin Chain Topology by Targeted Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1977, Clifton, N.J. 25-34 (2019).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
- Tawa, N. E., Odessey, R., Goldberg, A. L. Inhibitors of the proteasome reduce the accelerated proteolysis in atrophying rat skeletal muscles. The Journal of Clinical Investigation. 100 (1), 197-203 (1997).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- MacLean, B., et al. Effect of Collision Energy Optimization on the Measurement of Peptides by Selected Reaction Monitoring (SRM) Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (24), 10116-10124 (2010).
