기계적 해리: 조직에서 생존 가능한 세포를 얻는 방법

먼저 조직 조각의 무게를 측정하고 길이, 너비 및 높이를 측정합니다. 배양 배지가 있는 배양 접시에 조직을 넣고 메스를 사용하여 작은 조각으로 깍둑썰기합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 균질화를 위해 모든 것을 C-튜브로 옮깁니다.

튜브를 기계적 디스해리터에 놓고 필요에 따라 사이클을 실행합니다. 이 장치는 기계적 힘을 사용하여 조직 샘플에서 생존 가능한 단일 세포를 추출하는 동시에 표면 단백질을 포함한 세포 무결성을 유지합니다. 원심분리기 튜브에 고정된 세포 스트레이너를 통해 균질산염을 디캔팅합니다.

나머지 조직을 재균질화하고 세포 스트레이너를 통해 균질성을 튜브로 변형시킵니다. 균질액을 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 이제 배양 배지에 세포 펠렛을 재현탁하고 소량의 세포 현탁액을 트리판 블루 염색이 포함된 튜브로 옮깁니다.

염색 후 세포를 혈구계 슬라이드로 옮깁니다. 투명한 생존 가능한 세포를 세십시오. 죽은 세포는 세포막이 손상되지 않았기 때문에 얼룩을 흡수합니다. 다음 프로토콜에서는 CD45+ 세포의 정량적 및 정성적 분석을 위해 신선한 인체 조직의 비효소적 해리를 수행합니다.

- 조직 샘플의 무게를 측정한 다음 조직의 길이, 너비 및 높이를 측정하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 조직 조각을 화학적으로 정의된 적절한 혈청이 없는 조혈 세포 배지 1ml가 들어 있는 작은 페트리 접시에 옮기고 멸균 메스를 사용하여 샘플을 1-2제곱밀리미터 조각으로 깍둑썰기합니다. 다음으로, 접시 내용물을 기계식 해리기 C-튜브로 옮기고 접시와 메스를 2ml의 배지로 헹굽니다.

세척액을 C-튜브에 추가한 다음 8.01 기계적 해리기 프로그램을 두 번 연속으로 실행하여 조직 단편을 단일 세포 현탁액으로 부드럽게 균질화합니다. 두 번째 주기 후, 40마이크로미터 세포 여과기를 통해 균질산물을 50밀리리터 원추형 튜브로 디캔팅합니다. 그런 다음 페트리 접시를 세척할 때와 동일한 파스퇴르 피펫을 사용하여 C-튜브에 남아 있는 액체를 세포 여과기로 옮깁니다.

다음으로, 1ml 마이크로피펫을 사용하여 여과된 액체를 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 추가로 3ml의 배지로 C-튜브를 헹굽니다. 이 세척제를 셀 스트레이너를 통해 50ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 깨끗한 1ml 팁으로 균질화되지 않은 조직을 스트레이너 주위로 부드럽게 움직여 조직에 갇힌 잔류 액체의 최대량을 50ml 튜브에 짜냅니다. 이제 세포 여과기를 원래 C-튜브 위에 거꾸로 놓고 배지 3ml로 여과기를 헹구어 균질화되지 않은 조직이 C-튜브로 다시 떨어지도록 합니다.

방금 설명한 바와 같이 두 번 더 주기 동안 조직을 재균질화한 다음 세포 스트레이너를 통해 두 번째 균질화를 다시 붓습니다. C-튜브를 3ml의 배지로 더 헹굽니다. 그런 다음 여과기를 통해 상층액을 걸러내고 방금 설명한 것처럼 조직에서 잔류 액체를 짜냅니다. 이 시점에서 약 2.5ml의 단일 세포 현탁액 부피가 15ml 튜브에 존재해야 하며 약 9ml의 부피가 50ml 튜브에 존재해야 합니다.

세포에서 조직 상등액을 분리하기 위해 먼저 실온에서 600Gs에서 15분 동안 균질산염의 두 튜브를 모두 원심분리합니다. 15 밀리리터 튜브의 상층액을 1.5 밀리리터 튜브에 넣고 섭씨 4도에 놓고 50 밀리리터 튜브에서 상층액을 버립니다. 그런 다음 단단한 표면에서 각 튜브를 부드럽게 두드려 각 세포 펠릿을 분해합니다.

느슨한 세포 펠릿을 500 마이크로리터 배지로 50 밀리리터 튜브에 재현탁시키고 세포를 15 밀리리터 튜브로 옮겨 두 번째 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 50ml 튜브를 다른 500마이크로리터의 배지로 헹구고 세척액을 15ml 튜브로 옮겨 세포 회수를 극대화합니다. 트리판 블루 배제(trypan blue exclusion)에 의해 생존 가능한 세포의 수를 계수한 후, 세포 현탁액을 펠렛화합니다.

마지막으로, 예약된 조직 상층액을 스핀다운합니다. 그런 다음 펠릿을 건드리거나 방해하지 않고 상등액을 하나 이상의 깨끗한 튜브로 조심스럽게 옮기고 향후 다운스트림 분석을 위해 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.