Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
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सबसे पहले, एक ऊतक टुकड़ा वजन और इसकी लंबाई, चौड़ाई, और ऊंचाई को मापने। एक संस्कृति माध्यम के साथ एक संस्कृति पकवान में ऊतक प्लेस और यह एक स्केलपेल का उपयोग कर छोटे टुकड़ों को पासा । पाश्चुर पिपेट का उपयोग करके समरूपता के लिए सब कुछ सी-ट्यूब में स्थानांतरित करें।
ट्यूब को एक यांत्रिक वियोजना में रखें और आवश्यकतानुसार चक्र चलाएं। उपकरण सतह प्रोटीन सहित सेलुलर अखंडता को बनाए रखते हुए ऊतक नमूने से व्यवहार्य एकल कोशिकाओं को निकालने के लिए यांत्रिक बलों का उपयोग करता है। एक अपकेंद्रित्र ट्यूब पर तय एक सेल छलनी के माध्यम से समरूप decant ।
शेष ऊतकों को फिर से होम्योपैथित करें और कोशिका छलनी के माध्यम से होमोजेनेट को ट्यूब में तनाव दें। समरूपता को अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेट को हटा दें। अब, संस्कृति माध्यम में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें और सेल निलंबन की थोड़ी मात्रा को ट्राइपैन ब्लू दाग युक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें।
धुंधला होने के बाद, कोशिकाओं को हीमोसाइटोमीटर स्लाइड पर स्थानांतरित करें। पारदर्शी व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें। मृत कोशिकाएं दाग को ऊपर ले जाती हैं, क्योंकि उनकी कोशिका झिल्ली बरकरार नहीं होती है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम सीडी 45 + कोशिकाओं के मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण के लिए ताजा मानव ऊतक का गैर-एंजाइमेटिक वियोजन करेंगे।
- ऊतक नमूने को तौलने और फिर ऊतक की लंबाई, चौड़ाई और ऊंचाई को मापने से शुरू करें। फिर ऊतक के टुकड़े को एक छोटे पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें उपयुक्त रासायनिक रूप से परिभाषित, सीरम-मुक्त, हेमेटोपोइटिक सेल माध्यम के 1 मिलीलीटर होते हैं और नमूनों को छोटे 1 से 2 वर्ग मिलीमीटर टुकड़ों में पासा करने के लिए बाँझ स्केलपेल का उपयोग करते हैं। इसके बाद, डिश की सामग्री को एक मैकेनिकल डिसोसिएटर सी-ट्यूब में स्थानांतरित करें और 2 मिलीलीटर मध्यम के साथ पकवान और स्केलपेल कुल्लाएं।
सी-ट्यूब में धोने जोड़ें और फिर 8.01 यांत्रिक वियोजन कार्यक्रम को उत्तराधिकार में दो बार चलाएं ताकि ऊतक के टुकड़ों को धीरे-धीरे एकल कोशिका निलंबन में समरूप बनाया जा सके। दूसरे चक्र के बाद, एक 50-मिलीलीटर शंकुदाता में एक 40 माइक्रोमीटर सेल छलनी के माध्यम से समरूप डिकेंट। फिर सी-ट्यूब में शेष किसी भी तरल को सेल छन्नी में स्थानांतरित करने के लिए पेट्री डिश को धोने से उसी पाश्चातर पिपेट का उपयोग करें।
इसके बाद, फ़िल्टर किए गए तरल को 15 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करने के लिए 1-मिलीलीटर माइक्रोपिपेट का उपयोग करें और सी-ट्यूब को अतिरिक्त 3 मिलीलीटर मध्यम के साथ कुल्ला करें। इस वॉश को सेल छन्नी के जरिए 50 मिलीलीटर ट्यूब में ट्रांसफर करें। फिर धीरे-धीरे एक साफ 1-मिलीलीटर टिप के साथ छलनी के चारों ओर अनहोजेनाइज्ड ऊतक को स्थानांतरित करें ताकि ऊतक में फंसे अवशिष्ट तरल की अधिकतम मात्रा को 50-मिलीलीटर ट्यूब में निचोड़ा जा सके। अब कोशिका छलनी को मूल सी-ट्यूब के शीर्ष पर उल्टा रखें और छलनी को 3 और मिलीलीटर मध्यम के साथ कुल्ला करें ताकि अहोमोजेनाइज्ड ऊतक सी-ट्यूब में वापस गिर जाए।
ऊतक को दो और चक्रों के लिए फिर से होम्योपैथित करें जैसा कि अभी प्रदर्शित किया गया है, और फिर सेल छलनी के माध्यम से दूसरा समरूप डालना। मध्यम के एक और 3 मिलीलीटर के साथ सी ट्यूब कुल्ला। फिर छलनी के माध्यम से सुपरनेट को फ़िल्टर करें और अवशिष्ट तरल को ऊतक से बाहर निचोड़ें, जैसा कि सिर्फ प्रदर्शन किया गया है। इस बिंदु पर, 15 मिलीलीटर ट्यूब में लगभग 2.5 मिलीलीटर एकल सेल निलंबन मौजूद होना चाहिए, और 50-मिलीलीटर ट्यूब में लगभग 9 मिलीलीटर देखा जाना चाहिए।
ऊतक सुपरनेट को कोशिकाओं से अलग करने के लिए, पहले कमरे के तापमान पर 600 जीएस पर 15 मिनट के लिए समरूप की दोनों ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें। 15 मिलीलीटर ट्यूब से सुपरनैट को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में डिकंट करें, इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें, और 50-मिलीलीटर ट्यूब से सुपरनैट्रट को त्यागें। फिर प्रत्येक ट्यूब को कोशिका छर्रों को तोड़ने के लिए एक कठिन सतह पर धीरे-धीरे टैप करें।
मध्यम के ५०० माइक्रोलीटर के साथ ५०-मिलीलीटर ट्यूब में ढीली कोशिका गोली को फिर से निलंबित कर दिया और दूसरी गोली को फिर से खर्च करने के लिए कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया । फिर मध्यम के एक और ५०० माइक्रोलीटर के साथ ५० मिलीलीटर ट्यूब कुल्ला और अधिकतम सेल वसूली के लिए 15 मिलीलीटर ट्यूब को धोने हस्तांतरण । ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन द्वारा व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या गिनने के बाद, सेल निलंबन को गोली मारें।
अंत में, आरक्षित ऊतक सुपरनिटेंट को स्पिन करें। फिर ध्यान से गोली को छूने या परेशान किए बिना कम से कम एक साफ ट्यूब में सुपरनैंट स्थानांतरित करें और इसे भविष्य के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए नकारात्मक 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
