Dissociation mécanique : méthode pour obtenir des cellules viables à partir d’un tissu

Tout d’abord, pesez un fragment de tissu et mesurez sa longueur, sa largeur et sa hauteur. Placer le tissu dans un plat de culture avec un milieu de culture et le couper en petits morceaux à l’aide d’un scalpel. Transférer le tout dans un tube C pour homogénéisation à l’aide d’une pipette Pasteur.

Placez le tube dans un dissociateur mécanique et exécutez les cycles au besoin. L’appareil utilise des forces mécaniques pour extraire des cellules individuelles viables de l’échantillon de tissu tout en maintenant l’intégrité cellulaire, y compris les protéines de surface. Décanter l’homogénéisation à travers une passoire cellulaire fixée sur un tube de centrifugeuse.

Réinhomogènez le tissu restant et filtrez l’homogénéisation à travers la passoire cellulaire dans le tube. Centrifugeuse l’homogénéisation et enlever le supernatant. Maintenant, résuspendez la pastille cellulaire dans le milieu de culture et transférez une petite quantité de la suspension cellulaire à un tube contenant la tache bleue trypan.

Après coloration, transférer les cellules sur une glissade de l’hémocytomètre. Comptez les cellules viables transparentes. Les cellules mortes prennent la tache, car leur membrane cellulaire n’est pas intacte. Dans le protocole suivant, nous effectuerons la dissociation non enzymatique du tissu humain frais pour l’analyse quantitative et qualitative des cellules CD45+.

- Commencez par peser l’échantillon de tissu, puis en mesurant la longueur, la largeur et la hauteur du tissu. Ensuite, transférez le fragment de tissu dans une petite boîte de Pétri contenant 1 millilitre du milieu cellulaire hématopoïétique défini chimiquement, sans sérum et approprié et utilisez un scalpel stérile pour couper les échantillons en petits morceaux de 1 à 2 millimètres carrés. Ensuite, transférer le contenu du plat dans un dissociateur mécanique C-tube et rincer le plat et le scalpel avec 2 millilitres de milieu.

Ajouter le lavage au tube C, puis exécuter le programme de dissociateur mécanique 8,01 deux fois de suite pour homogénéiser doucement les fragments de tissu en une seule suspension cellulaire. Après le deuxième cycle, décanter l’homogénéisation à travers une passoire cellulaire de 40 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, utilisez la même pipette Pasteur de laver la boîte de Pétri pour transférer tout liquide restant dans le tube C dans la passoire cellulaire.

Ensuite, utilisez une micropipette de 1 millilitre pour transférer le liquide filtré dans un tube conique de 15 millilitres et rincer le tube C avec 3 millilitres supplémentaires de milieu. Transférer ce lavage à travers la passoire cellulaire dans le tube de 50 millilitres. Déplacez ensuite doucement le tissu non homogénéisé autour de la passoire avec une pointe propre de 1 millilitre pour presser la quantité maximale de liquide résiduel emprisonné dans le tissu dans le tube de 50 millilitres. Placez maintenant la passoire cellulaire à l’envers sur le tube C d’origine et rincez la passoire avec 3 millilitres de plus de milieu de sorte que le tissu non homogénéisé retotte dans le tube C.

Rehomogenize le tissu pendant deux cycles plus comme juste démontré, puis versez le deuxième homogénéiser à travers la passoire cellulaire à nouveau. Rincer le tube C avec encore 3 millilitres de milieu. Filtrez ensuite le supernatant à travers la passoire et pressez le liquide résiduel hors du tissu, comme il vient de le démontrer. À ce stade, un volume d’environ 2,5 millilitres de suspension à cellule unique devrait être présent dans le tube de 15 millilitres, et environ 9 millilitres devraient être observés dans le tube de 50 millilitres.

Pour séparer le tissu supernatant des cellules, première centrifugeuse des deux tubes d’homogénéité pendant 15 minutes à 600 Gs à température ambiante. Décanter le supernatant du tube de 15 millilitres dans un tube de 1,5 millilitre, le plaçant à 4 degrés Celsius, et jeter le supernatant du tube de 50 millilitres. Puis appuyez doucement sur chaque tube sur une surface dure pour briser chacune des boulettes cellulaires.

Resuspendait la pastille cellulaire lâche dans le tube de 50 millilitres avec 500 microlitres de milieu et transférait les cellules dans le tube de 15 millilitres pour résuspendre la deuxième pastille. Rincez ensuite le tube de 50 millilitres avec 500 microlitres de milieu et transférez le lavage dans le tube de 15 millilitres pour une récupération maximale des cellules. Après avoir compté le nombre de cellules viables par exclusion bleue trypan, pelleter la suspension cellulaire.

Enfin, tournez vers le bas le supernatant de tissu réservé. Ensuite, transférez soigneusement le supernatant à au moins un tube propre sans toucher ou déranger la pastille et rangez-la à 80 degrés Celsius négatifs pour une analyse future en aval.