Mechanische dissociatie: een methode om levensvatbare cellen uit een weefsel te verkrijgen

Weeg eerst een weefselfragment en meet de lengte, breedte en hoogte. Leg het weefsel in een kweekschaal met een kweekmedium en snijd het in kleine stukjes met behulp van een scalpel. Breng alles over naar een C-tube voor homogenisatie met behulp van een Pasteur pipet.

Plaats de buis in een mechanische dissociator en voer de cycli uit zoals vereist. Het apparaat gebruikt mechanische krachten om levensvatbare afzonderlijke cellen uit het weefselmonster te extraheren met behoud van cellulaire integriteit, inclusief de oppervlakte-eiwitten. Decanteer het homogenaat door een celzeef die op een centrifugebuis is bevestigd.

Rehomogeniseer het resterende weefsel en span het homogenaat door de celzeef in de buis. Centrifugeer het homogenaat en verwijder het supernatant. Resuspend nu de celkorrel in het kweekmedium en breng een kleine hoeveelheid van de celsuspensie over naar een buis met trypanblauwe vlek.

Breng de cellen na het kleuren over op een hemocytometerschuif. Tel de transparante levensvatbare cellen. De dode cellen nemen de vlek op, omdat hun celmembraan niet intact is. In het volgende protocol zullen we niet-enzymatische dissociatie van vers menselijk weefsel uitvoeren voor kwantitatieve en kwalitatieve analyse van CD45+ cellen.

- Begin met het wegen van het weefselmonster en meet vervolgens de lengte, breedte en hoogte van het weefsel. Breng vervolgens het weefselfragment over in een kleine petrischaal met 1 milliliter van het juiste chemisch gedefinieerde, serumvrije, hematopoëtische celmedium en gebruik een steriel scalpel om de monsters in kleine stukjes van 1 tot 2 vierkante millimeter te dobbelen. Breng vervolgens de inhoud van de schaal over in een mechanische dissociator C-buis en spoel de schaal en scalpel af met 2 milliliter medium.

Voeg de was toe aan de C-buis en voer vervolgens het 8.01 mechanische dissociatorprogramma twee keer achter elkaar uit om de weefselfragmenten voorzichtig te homogeniseren tot een enkele celsuspensie. Decanteer na de tweede cyclus het homogenaat via een celzeef van 40 micrometer in een conische buis van 50 milliliter. Gebruik vervolgens dezelfde Pasteur pipet van het wassen van de petrischaal om de resterende vloeistof in de C-buis in de celzeef over te brengen.

Gebruik vervolgens een micropipet van 1 milliliter om de gefilterde vloeistof over te brengen in een conische buis van 15 milliliter en spoel de C-buis af met nog eens 3 milliliter medium. Breng deze was door de celzeef in de buis van 50 milliliter. Beweeg vervolgens voorzichtig het ongehomogeniseerde weefsel rond de zeef met een schone punt van 1 milliliter om de maximale hoeveelheid resterende vloeistof die in het weefsel is opgesloten in de buis van 50 milliliter te persen. Plaats nu de celzeef ondersteboven op de originele C-buis en spoel de zeef af met nog 3 milliliter medium zodat het niet-gehomogeniseerde weefsel terugvalt in de C-buis.

Rehomogeniseer het weefsel voor nog twee cycli zoals zojuist aangetoond, en giet dan het tweede homogenaat weer door de celzeef. Spoel de C-tube af met nog eens 3 milliliter medium. Filter vervolgens het supernatant door de zeef en knijp de restvloeistof uit het weefsel, zoals zojuist is aangetoond. Op dit punt moet in de buis met 15 milliliter een volume van ongeveer 2,5 milliliter eencellige suspensie aanwezig zijn en in de buis met 50 milliliter ongeveer 9 milliliter.

Om het weefselsupernatans van de cellen te scheiden, centrifugeer eerst beide buizen homogenaat gedurende 15 minuten bij 600 G bij kamertemperatuur. Decanteer het supernatant uit de buis van 15 milliliter in een buis van 1,5 milliliter, plaats het op 4 graden Celsius en gooi het supernatant uit de buis van 50 milliliter. Tik vervolgens voorzichtig op elke buis op een hard oppervlak om elk van de celkorrels te breken.

Resuspendeerde de losse celkorrel in de buis van 50 milliliter met 500 microliter medium en breng de cellen over naar de buis van 15 milliliter om de tweede pellet te resuspenden. Spoel vervolgens de buis van 50 milliliter af met nog eens 500 microliter medium en breng de was over naar de buis van 15 milliliter voor maximaal celherstel. Na het tellen van het aantal levensvatbare cellen door trypan blauwe uitsluiting, pellet de cel suspensie.

Draai ten slotte het gereserveerde weefselsupernatant om. Breng het supernatant vervolgens voorzichtig over op ten minste één schone buis zonder de pellet aan te raken of te storen en bewaar het bij negatieve 80 graden Celsius voor toekomstige downstream-analyse.