Mekanisk dissociation: En metode til at opnå levedygtige celler fra et væv

Først vejer et vævsfragment og måler dets længde, bredde og højde. Placer vævet i en kultur parabol med en kultur medium og terninger det til små stykker ved hjælp af en skalpel. Overfør alt til et C-rør til homogenisering ved hjælp af en Pasteur-pipette.

Placer røret i en mekanisk dissociator og køre cykler efter behov. Apparatet bruger mekaniske kræfter til at udtrække levedygtige enkeltceller fra vævsprøven, samtidig med at cellulær integritet opretholdes, herunder overfladeproteiner. Homogenatet dekanteres gennem en cellesien, der er fastgjort på et centrifugerør.

Rehomogenize det resterende væv og stamme homogenate gennem cellen si i røret. Centrifuge homogenatet og fjern supernatanten. Resuspend cellepillen i kulturmediet og overfør en lille mængde celleaffjedring til et rør, der indeholder trypanblå plet.

Efter farvning overføres cellerne til et hæmocytometerdias. Tæl de gennemsigtige levedygtige celler. De døde celler tager pletten op, da deres cellemembran ikke er intakt. I den følgende protokol vil vi udføre ikke-enzymatisk dissociation af frisk humant væv til kvantitativ og kvalitativ analyse af CD45+ celler.

- Begynd med at veje vævsprøven og derefter måle vævets længde, bredde og højde. Overfør derefter vævsfragmentet til en lille petriskål, der indeholder 1 milliliter af det relevante kemisk definerede, serumfrie, hæmatopoietiske cellemedium, og brug en steril skalpel til at hakke prøverne i små 1 til 2 kvadratmillimeter stykker. Dernæst overføres skålindholdet til en mekanisk dissociator C-rør og skyl skålen og skalpel med 2 milliliter medium.

Tilsæt vask til C-røret og kør derefter 8.01 mekanisk dissociatorprogram to gange i træk for forsigtigt at homogenisere vævsfragmenterne til en enkelt celleaffjedring. Efter den anden cyklus dekanteres homogenatet gennem en 40-mikrometer celle si i et 50-milliliter konisk rør. Brug derefter den samme Pasteur-pipette fra vask af petriskålen til at overføre væske, der er tilbage i C-røret, til cellesien.

Brug derefter en 1-milliliter mikropipette til at overføre den filtrerede væske til et 15-milliliter konisk rør og skyl C-røret med yderligere 3 milliliter medium. Overfør denne vask gennem cellesien i 50 milliliterrøret. Derefter forsigtigt flytte unhomogenized væv omkring si med en ren 1-milliliter spids til at presse den maksimale mængde resterende væske fanget i vævet i 50-milliliter røret. Placer nu cellesien på hovedet oven på det originale C-rør og skyl sien med 3 flere milliliter medium, så det uhomogeniserede væv falder tilbage i C-røret.

Rehomogenize vævet i yderligere to cyklusser som netop demonstreret, og derefter hælde den anden homogenisere gennem cellen si igen. Skyl C-røret med yderligere 3 milliliter medium. Filtrer derefter supernatanten gennem sien og klem restvæsken ud af vævet, som det netop er påvist. På dette tidspunkt skal der være et volumen på ca. 2,5 milliliter enkeltcelleaffjedring i 15-milliliterrøret, og der skal observeres ca. 9 milliliter i 50-milliliterrøret.

For at adskille vævs-supernatanten fra cellerne skal begge rør homogeniseres første gang i 15 minutter ved 600 Gs ved stuetemperatur. Dekanter supernatanten fra 15-milliliterrøret i et 1,5 milliliter rør, placerer det ved 4 grader Celsius og kasserer supernatanten fra 50-milliliterrøret. Tryk derefter forsigtigt på hvert rør på en hård overflade for at bryde op hver af cellepillerne.

Genbrugte den løse cellepille i 50-milliliterrøret med 500 mikroliter medium og overfører cellerne til 15-milliliterrøret for at genbruge den anden pellet. Skyl derefter 50-milliliterrøret med yderligere 500 mikroliter medium og overfør vasken til 15-milliliterrøret for maksimal cellegenvinding. Efter at have talt antallet af levedygtige celler ved trypan blå udelukkelse, pellet cellen suspension.

Endelig spin ned reserveret væv supernatant. Overfør derefter forsigtigt supernatanten til mindst et rent rør uden at røre ved eller forstyrre pellet'en og opbevar den ved negative 80 grader Celsius til fremtidig downstream-analyse.