Disociación mecánica: un método para obtener células viables de un tejido

Primero, pesar un fragmento de tejido y medir su longitud, amplitud y altura. Coloque el tejido en un plato de cultivo con un medio de cultivo y lácelo en trozos pequeños usando un bisturí. Transfiera todo a un tubo C para homogeneizarlo con una pipeta Pasteur.

Coloque el tubo en un disociador mecánico y ejecute los ciclos según sea necesario. El aparato utiliza fuerzas mecánicas para extraer células individuales viables de la muestra de tejido mientras mantiene la integridad celular, incluidas las proteínas superficiales. Decantar el homogeneato a través de un colador celular fijado en un tubo centrífuga.

Rehomogenizar el tejido restante y colar el homogeneizado a través del colador celular en el tubo. Centrífuga el homogeneato y retire el sobrenadante. Ahora, resuspend el pellet celular en el medio de cultivo y transferir una pequeña cantidad de la suspensión celular a un tubo que contiene mancha azul trypan.

Después de la tinción, transfiera las celdas a una diapositiva del hemociclo. Cuente las celdas viables transparentes. Las células muertas toman la mancha, ya que su membrana celular no está intacta. En el siguiente protocolo, realizaremos la disociación no enzimática del tejido humano fresco para el análisis cuantitativo y cualitativo de las células CD45+.

- Comience pesando la muestra de tejido y luego midiendo la longitud, anchura y altura del tejido. A continuación, transfiera el fragmento de tejido a una pequeña placa de Petri que contenga 1 mililitro del medio celular hematopoyético definido químicamente, libre de suero y utilice un bisturí estéril para cortar las muestras en pequeñas piezas de 1 a 2 milímetros cuadrados. A continuación, transfiera el contenido del plato a un tubo C disociador mecánico y enjuague el plato y el bisturí con 2 mililitros de medio.

Agregue el lavado al tubo C y luego ejecute el programa de disociador mecánico 8.01 dos veces seguidas para homogeneizar suavemente los fragmentos de tejido en una sola suspensión celular. Después del segundo ciclo, decantar el homogeneato a través de un colador de células de 40 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, utilice la misma pipeta Pasteur del lavado de la placa de Petri para transferir cualquier líquido que permanezca en el tubo C en el colador celular.

A continuación, utilice un micropipette de 1 mililitro para transferir el líquido filtrado a un tubo cónico de 15 mililitros y enjuagar el tubo C con 3 mililitros adicionales de medio. Transfiera este lavado a través del colador celular al tubo de 50 mililitros. A continuación, mueva suavemente el tejido nohomogenizado alrededor del colador con una punta limpia de 1 mililitro para exprimir la cantidad máxima de líquido residual atrapado en el tejido en el tubo de 50 mililitros. Ahora coloque el colador celular boca abajo en la parte superior del tubo C original y enjuague el colador con 3 mililitros más de medio para que el tejido nohomogenizado caiga de nuevo en el tubo C.

Rehomogenizar el tejido durante dos ciclos más como se acaba de demostrar, y luego verter el segundo homogeneizado a través del colador celular de nuevo. Enjuague el tubo C con otros 3 mililitros de medio. A continuación, filtre el sobrenadante a través del colador y exprima el líquido residual del tejido, como se acaba de demostrar. En este punto, un volumen de aproximadamente 2,5 mililitros de suspensión de una sola célula debe estar presente en el tubo de 15 mililitros, y se deben observar aproximadamente 9 mililitros en el tubo de 50 mililitros.

Para separar el sobrenadante tisular de las células, primero centrífuga ambos tubos de homogeneato durante 15 minutos a 600 Gs a temperatura ambiente. Decantar el sobrenadante del tubo de 15 mililitros en un tubo de 1,5 mililitros, colocándolo en 4 grados Celsius, y desechar el sobrenadante del tubo de 50 mililitros. A continuación, toque suavemente cada tubo en una superficie dura para romper cada uno de los pellets celulares.

Resuspended el pellet de celda suelta en el tubo de 50 mililitros con 500 microlitros de medio y transferir las células al tubo de 15 mililitros para resuspend el segundo pellet. A continuación, enjuague el tubo de 50 mililitros con otros 500 microlitros de medio y transfiera el lavado al tubo de 15 mililitros para la máxima recuperación celular. Después de contar el número de células viables por exclusión azul trypan, peletizar la suspensión celular.

Finalmente, gire por el sobrenadante de tejido reservado. A continuación, transfiera cuidadosamente el sobrenadante a al menos un tubo limpio sin tocar o perturbar el pellet y guárdelo a 80 grados celsius negativos para futuros análisis aguas abajo.