Mekanisk dissosiasjon: En metode for å skaffe levedyktige celler fra et vev

Først veier du et vevsfragment og måler lengden, bredden og høyden. Legg vevet i en kulturrett med et kulturmedium og terning det til små stykker ved hjelp av en skalpell. Overfør alt til et C-rør for homogenisering ved hjelp av en Pasteur pipette.

Plasser røret i en mekanisk dissosiator og kjør sykluser etter behov. Apparatet bruker mekaniske krefter for å trekke ut levedyktige enkeltceller fra vevsprøven samtidig som cellulær integritet opprettholdes, inkludert overflateproteinene. Dekanter homogenatet gjennom en cellesil festet på et sentrifugerør.

Rehomogeniser det gjenværende vevet og spenne homogenatet gjennom cellesilen inn i røret. Sentrifuger homogenatet og fjern supernatanten. Nå, resuspend cellepellet i kulturmediet og overfør en liten mengde av celleopphenget til et rør som inneholder trypan blå flekk.

Etter farging, overfør cellene til et hemocytometer lysbilde. Tell de gjennomsiktige levedyktige cellene. De døde cellene tar opp flekken, da cellemembranen ikke er intakt. I følgende protokoll vil vi utføre ikke-enzymatisk dissosiasjon av friskt menneskelig vev for kvantitativ og kvalitativ analyse av CD45+-celler.

- Begynn med å veie vevsprøven og deretter måle vevets lengde, bredde og høyde. Overfør deretter vevsfragmentet til en liten petriskål som inneholder 1 milliliter av det passende kjemisk definerte, serumfrie, hematopoietiske cellemediet og bruk en steril skalpell for å terning prøvene i små 1 til 2 kvadrat millimeter stykker. Deretter overfører du parabolinnholdet til et mekanisk dissosiator C-rør og skyll parabolen og skalpellen med 2 milliliter medium.

Legg vasken til C-røret og kjør deretter 8.01 mekanisk dissosiatorprogram to ganger etter hverandre for å forsiktig homogenisere vevsfragmentene i en enkelt cellefjæring. Etter den andre syklusen, dekanter homogenatet gjennom en 40-mikrometer cellesil i et 50 milliliter konisk rør. Bruk deretter den samme Pasteur pipetten fra å vaske petriskålen for å overføre eventuell væske som er igjen i C-røret til cellesilen.

Deretter bruker du en mikropipette på 1 milliliter til å overføre den filtrerte væsken til et konisk rør på 15 milliliter og skyll C-røret med ytterligere 3 milliliter medium. Overfør denne vasken gjennom cellesilen inn i 50 milliliterrøret. Beveg deretter det upogeniserte vevet forsiktig rundt silen med en ren 1 milliliterspiss for å klemme den maksimale mengden gjenværende væske fanget i vevet inn i 50 milliliterrøret. Plasser nå cellesilen opp ned på toppen av det originale C-røret og skyll silen med 3 milliliter medium slik at det uphomogeniserte vevet faller tilbake i C-røret.

Rehomogenize vevet for to sykluser som nettopp demonstrert, og hell deretter det andre homogenatet gjennom cellesilen igjen. Skyll C-røret med ytterligere 3 milliliter medium. Filtrer deretter supernatanten gjennom silen og klem restvæsken ut av vevet, som nettopp demonstrert. På dette tidspunktet bør et volum på ca. 2,5 milliliter enkeltcellet suspensjon være til stede i 15 milliliterrøret, og ca. 9 milliliter skal observeres i 50 milliliterrøret.

For å skille vevet supernatant fra cellene, første sentrifuger begge rørene av homogenat i 15 minutter ved 600 G ved romtemperatur. Dekanter supernatanten fra 15 milliliterrøret til et 1,5 milliliterrør, plasser det ved 4 grader Celsius, og kast supernatanten fra 50 milliliterrøret. Trykk deretter forsiktig på hvert rør på en hard overflate for å bryte opp hver av cellepellets.

Resuspendert den løse cellepelleten i 50 milliliterrøret med 500 mikroliter medium og overfør cellene til 15 milliliterrøret for å resuspendere den andre pelletsen. Skyll deretter 50 milliliterrøret med ytterligere 500 mikroliter medium og overfør vasken til 15 milliliterrøret for maksimal cellegjenoppretting. Etter å ha talt antall levedyktige celler ved trypan blå ekskludering, pellet cellen suspensjon.

Til slutt, spinn ned det reserverte vevet supernatant. Overfør deretter supernatanten forsiktig til minst ett rent rør uten å berøre eller forstyrre pelletsen og lagre den på negative 80 grader Celsius for fremtidig nedstrømsanalyse.