Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
أولا، وزن جزء من الأنسجة وقياس طوله واتساعه وارتفاعه. ضع الأنسجة في طبق ثقافة مع وسيط الثقافة والزهر إلى قطع صغيرة باستخدام مشرط. نقل كل شيء إلى أنبوب C للتجانس باستخدام ماصة باستور.
ضع الأنبوب في مفكك ميكانيكي وتشغيل دورات كما هو مطلوب. يستخدم الجهاز قوى ميكانيكية لاستخراج خلايا واحدة قابلة للحياة من عينة الأنسجة مع الحفاظ على سلامة الخلايا ، بما في ذلك البروتينات السطحية. فك المتجانس من خلال مصفاة خلية ثابتة على أنبوب الطرد المركزي.
إعادة توجيه الأنسجة المتبقية وإجهاد المتجانس من خلال مصفاة الخلية في الأنبوب. الطرد المركزي المتجانس وإزالة supernatant. الآن، resuspend بيليه الخلية في وسط الثقافة ونقل كمية صغيرة من تعليق الخلية إلى أنبوب يحتوي على بقعة زرقاء تريبان.
بعد تلطيخ، نقل الخلايا على شريحة مقياس الدم. عد الخلايا الشفافة قابلة للحياة. الخلايا الميتة تأخذ وصمة عار، كما غشاء الخلية ليست سليمة. في البروتوكول التالي، سوف نقوم بإجراء انفصال غير أنزيمي للأنسجة البشرية الطازجة للتحليل الكمي والنوعي لخلايا CD45+.
- ابدأ بوزن عينة الأنسجة ثم قياس طول الأنسجة وعرضها وارتفاعها. ثم نقل جزء الأنسجة إلى طبق بتري صغير يحتوي على 1 ملليلتر من المناسبة المحددة كيميائيا، خالية من المصل، وسيط الخلية الدموية واستخدام مشرط عقيمة لنرد العينات إلى قطع صغيرة 1-2 ملليمتر مربع. بعد ذلك، نقل محتويات الطبق إلى أنبوب C التفكيك الميكانيكية وشطف الطبق والمشرط مع 2 ملليلتر من المتوسطة.
أضف الغسيل إلى الأنبوب C ثم قم بتشغيل برنامج التفكيك الميكانيكي 8.01 مرتين متتاليتين لتجانس شظايا الأنسجة برفق في تعليق خلية واحدة. بعد الدورة الثانية، التصق المتجانس من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. ثم استخدم نفس ماصة باستور من غسل طبق بتري لنقل أي سائل متبقي في أنبوب C إلى مصفاة الخلية.
بعد ذلك، استخدم ميكروبايت 1 ملليلتر لنقل السائل المصفى إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر وشطف الأنبوب C مع 3 ملليلتر إضافية من المتوسط. نقل هذا الغسيل من خلال مصفاة الخلية في أنبوب 50 ملليلتر. ثم قم بتحريك الأنسجة غير المتجانسة برفق حول المصفاة مع طرف نظيف 1 ملليلتر للضغط على أكبر قدر ممكن من السائل المتبقي المحاصرين في الأنسجة في أنبوب 50 ملليلتر. الآن ضع مصفاة الخلية رأسا على عقب على رأس أنبوب C الأصلي وشطف مصفاة مع 3 ملليلترات أخرى من المتوسطة بحيث يسقط الأنسجة غيروجينية مرة أخرى في أنبوب C.
إعادة تجانس الأنسجة لدورتين أكثر كما هو موضح للتو، ومن ثم صب التجانس الثاني من خلال مصفاة الخلية مرة أخرى. شطف C-أنبوب مع آخر 3 ملليلتر من المتوسطة. ثم تصفية supernatant من خلال مصفاة والضغط على السائل المتبقي من الأنسجة، كما أظهرت للتو. عند هذه النقطة، يجب أن يكون حجم ما يقرب من 2.5 ملليلتر من تعليق خلية واحدة موجودة في أنبوب 15 ملليلتر، وينبغي ملاحظة ما يقرب من 9 ملليلتر في أنبوب 50 ملليلتر.
لفصل الأنسجة الفائقة من الخلايا، والطرد المركزي الأول كل من أنابيب المتجانسة لمدة 15 دقيقة في 600 Gs في درجة حرارة الغرفة. تخلص من الناطقة الفائقة من أنبوب 15 ملليلتر في أنبوب 1.5 ملليلتر ، ووضعها في 4 درجات مئوية ، والتخلص من الناطقة الفائقة من أنبوب 50 ملليلتر. ثم اضغط بلطف كل أنبوب على سطح صلب لتفريق كل من الكريات الخلية.
Resuspended بيليه الخلية فضفاضة في أنبوب 50 ملليلتر مع 500 ميكرولتر من المتوسط ونقل الخلايا إلى أنبوب 15 ملليلتر لإعادة إنفاق بيليه الثاني. ثم شطف أنبوب 50 ملليلتر مع آخر 500 ميكرولتر من المتوسط ونقل الغسيل إلى أنبوب 15 ملليلتر لأقصى قدر من الانتعاش الخلية. بعد عد عدد الخلايا القابلة للحياة عن طريق استبعاد الأزرق تريبان، بيليه تعليق الخلية.
وأخيرا، تدور أسفل الأنسجة المحجوزة supernatant. ثم نقل بعناية supernatant إلى أنبوب واحد على الأقل نظيفة دون لمس أو إزعاج بيليه وتخزينها في السلبية 80 درجة مئوية لتحليل المصب في المستقبل.
