Mechanische Dissoziation: Eine Methode, um lebensfähige Zellen aus einem Gewebe zu erhalten

Wiegen Sie zunächst ein Gewebefragment und messen Sie dessen Länge, Breite und Höhe. Legen Sie das Gewebe in ein Kulturgericht mit einem Kulturmedium und würfeln Sie es in kleine Stücke mit einem Skalpell. Übertragen Sie alles auf ein C-Rohr zur Homogenisierung mit einer Pasteur Pipette.

Legen Sie das Rohr in einen mechanischen Dissoziator und laufen Sie die Zyklen nach Bedarf. Das Gerät nutzt mechanische Kräfte, um lebensfähige Einzelzellen aus der Gewebeprobe zu extrahieren und gleichzeitig die zelluläre Integrität, einschließlich der Oberflächenproteine, aufrechtzuerhalten. Dekantieren Sie das Homogenat durch ein Zellsieb, das auf einem Zentrifugenrohr befestigt ist.

Rehomogenisieren Sie das restliche Gewebe und sätten Sie das Homogenat durch das Zellsieb in das Rohr. Zentrifugieren Sie das Homogenat und entfernen Sie den Überstand. Nun setzen Sie das Zellpellet im Kulturmedium wieder auf und übertragen Sie eine kleine Menge der Zellsuspension in ein Rohr, das Trypanblaufleck enthält.

Nach der Färbung die Zellen auf eine Hämozytometerrutsche übertragen. Zählen Sie die transparenten lebensfähigen Zellen. Die abgestorbenen Zellen nehmen den Fleck auf, da ihre Zellmembran nicht intakt ist. Im folgenden Protokoll führen wir eine nicht-enzymatische Dissoziation von frischem menschlichem Gewebe für die quantitative und qualitative Analyse von CD45+ Zellen durch.

- Beginnen Sie mit dem Wiegen der Gewebeprobe und messen Sie dann die Länge, Breite und Höhe des Gewebes. Dann das Gewebefragment in eine kleine Petrischale mit 1 Milliliter des entsprechenden chemisch definierten, serumfreien, hämatopoetischen Zellmediums übertragen und mit einem sterilen Skalpell die Proben in kleine 1 bis 2 Quadratmillimeter stückewürfeln. Als nächstes den Tellerinhalt in einen mechanischen Dissoziator C-Rohr übertragen und die Schale und das Skalpell mit 2 Millilitern Medium abspülen.

Fügen Sie die Wäsche in das C-Rohr und führen Sie dann das mechanische Dissoziatorprogramm 8.01 zweimal hintereinander aus, um die Gewebefragmente sanft in eine einzellige Suspension zu homogenisieren. Nach dem zweiten Zyklus dekantieren Sie das Homogenat durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Konustube. Dann verwenden Sie die gleiche Pasteur Pipette aus dem Waschen der Petrischale, um alle im C-Rohr verbleibenden Flüssigkeit in das Zellsieb zu übertragen.

Als nächstes verwenden Sie eine 1-Milliliter-Mikropipette, um die gefilterte Flüssigkeit in ein 15-Milliliter-Konusrohr zu übertragen und das C-Rohr mit zusätzlichen 3 Millilitern Medium zu spülen. Übertragen Sie diese Wäsche durch das Zellsieb in das 50-Milliliter-Rohr. Dann bewegen Sie das unhomogenisierte Gewebe vorsichtig um das Sieb mit einer sauberen 1-Milliliter-Spitze, um die maximale Menge an im Gewebe eingeschlossener Restflüssigkeit in das 50-Milliliter-Rohr zu drücken. Legen Sie nun das Zellsieb kopfüber auf das ursprüngliche C-Rohr und spülen Sie das Sieb mit 3 weiteren Millilitern Medium, so dass das unhomogenisierte Gewebe wieder in die C-Röhre fällt.

Rehomogenisieren Sie das Gewebe für zwei weitere Zyklen, wie gerade gezeigt, und gießen Sie dann das zweite Homogenat wieder durch das Zellsieb. Spülen Sie die C-Röhre mit weiteren 3 Milliliter Nader Nadern. Dann filtern Sie den Überstand durch das Sieb und drücken Sie die Restflüssigkeit aus dem Gewebe, wie gerade gezeigt. An dieser Stelle sollte ein Volumen von etwa 2,5 Milliliter Einzelzellsuspension in der 15-Milliliter-Röhre vorhanden sein, und etwa 9 Milliliter sollten in der 50-Milliliter-Röhre beobachtet werden.

Um den Gewebeüberstand von den Zellen zu trennen, zentrieren Sie zunächst beide Röhren von Homogenat für 15 Minuten bei 600 Gs bei Raumtemperatur. Dekantieren Sie den Überstand aus dem 15-Milliliter-Rohr in ein 1,5-Milliliter-Rohr, platzieren Sie ihn bei 4 Grad Celsius, und entsorgen Sie den Überstand aus dem 50-Milliliter-Rohr. Tippen Sie dann vorsichtig auf jedes Rohr auf einer harten Oberfläche, um jedes der Zellpellets aufzubrechen.

Das lose Zellpellet in der 50-Milliliter-Röhre mit 500 Mikroliter n. Medium resuspended und die Zellen in das 15-Milliliter-Rohr überträgt, um das zweite Pellet wieder aufzuhängen. Dann spülen Sie das 50-Milliliter-Rohr mit weiteren 500 Mikroliter Medium und übertragen Sie die Wäsche auf das 15-Milliliter-Rohr für maximale Zellrückgewinnung. Nachdem Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch Trypan-Blau-Ausschluss gezählt haben, pellet die Zellsuspension.

Drehen Sie schließlich den reservierten Gewebeüberstand herunter. Dann den Überstand vorsichtig auf mindestens ein sauberes Rohr übertragen, ohne das Pellet zu berühren oder zu stören und bei negativen 80 Grad Celsius für zukünftige Downstream-Analysen aufzubewahren.