Dissociazione Meccanica: Un metodo per ottenere cellule vitali da un tessuto

In primo luogo, pesare un frammento di tessuto e misurarne la lunghezza, l'ampiezza e l'altezza. Mettere il tessuto in un piatto di coltura con un mezzo di coltura e dadi a piccoli pezzi usando un bisturi. Trasferire tutto su un tubo C per l'omogeneizzazione utilizzando una pipetta Pasteur.

Posizionare il tubo in un dissociatore meccanico e eseguire cicli in base alle esigenze. L'apparato utilizza forze meccaniche per estrarre singole cellule vitali dal campione di tessuto mantenendo l'integrità cellulare, comprese le proteine superficiali. Decantare l'omogeneato attraverso un colino cellulare fissato su un tubo di centrifuga.

Reogenizzare il tessuto rimanente e sforzare l'omogeneato attraverso il filtro cellulare nel tubo. Centrifugare l'omogeneato e rimuovere il supernatante. Ora, rimospendare il pellet cellulare nel mezzo di coltura e trasferire una piccola quantità della sospensione cellulare in un tubo contenente macchia blu tripano.

Dopo la colorazione, trasferire le cellule su uno scivolo emocitometro. Contare le celle trasparenti vitali. Le cellule morte prendono la macchia, poiché la loro membrana cellulare non è intatta. Nel seguente protocollo, eseguiremo la dissociazione non enzimatica del tessuto umano fresco per l'analisi quantitativa e qualitativa delle cellule CD45+.

- Iniziare pesando il campione di tessuto e quindi misurando la lunghezza, la larghezza e l'altezza del tessuto. Quindi trasferire il frammento di tessuto in una piccola piastra di Petri contenente 1 millilitro del mezzo cellulare ematopoietico appropriato definito chimicamente, privo di siero e utilizzare un bisturi sterile per tagliare a dadini i campioni in piccoli pezzi da 1 a 2 millimetri quadrati. Successivamente, trasferire il contenuto del piatto in un tubo C dissociatore meccanico e sciacquare il piatto e il bisturi con 2 millilitri di mezzo.

Aggiungere il lavaggio al tubo C e quindi eseguire il programma di dissociatore meccanico 8.01 due volte in successione per omogeneizzare delicatamente i frammenti di tessuto in una singola sospensione cellulare. Dopo il secondo ciclo, decantare l'omogeneato attraverso un colino cellulare di 40 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri. Quindi utilizzare la stessa pipetta Pasteur dal lavaggio della piastra di Petri per trasferire il liquido rimanente nel tubo C nel filtro cellulare.

Successivamente, utilizzare una micropipetta da 1 millilitro per trasferire il liquido filtrato in un tubo conico da 15 millilitri e risciacquare il tubo C con altri 3 millilitri di mezzo. Trasferire questo lavaggio attraverso il filtro cellulare nel tubo da 50 millilitri. Quindi spostare delicatamente il tessuto disomogeneo intorno al colino con una punta pulita da 1 millilitro per spremere la quantità massima di liquido residuo intrappolato nel tessuto nel tubo da 50 millilitri. Ora posiziona il filtro cellulare capovolto sopra il tubo C originale e risciacqua il colino con altri 3 millilitri di mezzo in modo che il tessuto disomogenizzato ripiega nel tubo C.

Reogenizzare il tessuto per altri due cicli come appena dimostrato, quindi versare nuovamente il secondo omogeneato attraverso il filtro cellulare. Risciacquare il tubo C con altri 3 millilitri di mezzo. Quindi filtrare il supernatante attraverso il colino e spremere il liquido residuo dal tessuto, come appena dimostrato. A questo punto, un volume di circa 2,5 millilitri di sospensione a singola cella dovrebbe essere presente nel tubo da 15 millilitri e dovrebbero essere osservati circa 9 millilitri nel tubo da 50 millilitri.

Per separare il supernatante tissutale dalle cellule, prima centrifugare entrambi i tubi di omogeneato per 15 minuti a 600 G a temperatura ambiente. Decantare il supernatante dal tubo da 15 millilitri in un tubo da 1,5 millilitri, posizionandolo a 4 gradi Celsius, e scartare il supernatante dal tubo da 50 millilitri. Quindi toccare delicatamente ogni tubo su una superficie dura per rompere ciascuno dei pellet di cella.

Rimospendato il pellet a celle sciolte nel tubo da 50 millilitri con 500 microlitri di mezzo e trasferire le celle nel tubo da 15 millilitri per rimorsi il secondo pellet. Quindi sciacquare il tubo da 50 millilitri con altri 500 microlitri di mezzo e trasferire il lavaggio nel tubo da 15 millilitri per il massimo recupero cellulare. Dopo aver contato il numero di cellule vitali per esclusione blu tripano, pellet la sospensione cellulare.

Infine, spin down il supernatante tissutale riservato. Quindi trasferire con cura il supernatante in almeno un tubo pulito senza toccare o disturbare il pellet e conservarlo a -80 gradi Celsius per la futura analisi a valle.