Summary
Protokollet beskriver den kirurgiska tillvaratagandet och efterföljande decellularisering av vaskulariserade svinflikar genom perfusion av natriumdodecylsulfattvättmedel genom klaffvaskulaturen i en anpassad perfusionsbioreaktor.
Abstract
Stora volymer mjukvävnadsdefekter leder till funktionella underskott och kan i hög grad påverka patientens livskvalitet. Även om kirurgisk rekonstruktion kan utföras med användning av autolog fri klafföverföring eller vaskulariserad kompositallotransplantation (VCA), har sådana metoder också nackdelar. Problem som sjuklighet på donatorstället och vävnadstillgänglighet begränsar autolog fri klafföverföring, medan immunsuppression är en betydande begränsning av VCA. Konstruerade vävnader i rekonstruktiv kirurgi med hjälp av decellulariserings- / recellulariseringsmetoder representerar en möjlig lösning. Decellulariserade vävnader genereras med hjälp av metoder som tar bort inbyggt cellulärt material samtidigt som den underliggande extracellulära matrisen (ECM) mikroarkitekturen bevaras. Dessa acellulära ställningar kan sedan recellulariseras med mottagarspecifika celler.
Detta protokoll beskriver de upphandlings- och decellulariseringsmetoder som används för att uppnå acellulära byggnadsställningar i en grismodell. Dessutom ger den också en beskrivning av perfusionsbioreaktorns design och installation. Flikarna inkluderar svinomentum, tensor fascia lata och den radiella underarmen. Decellularisering utförs via ex vivo-perfusion av natriumdodecylsulfat (SDS) tvättmedel med låg koncentration följt av DNas-enzymbehandling och perättiksyrasterilisering i en anpassad perfusionsbioreaktor.
Framgångsrik vävnadsdecellularisering kännetecknas av ett vitt ogenomskinligt utseende av flikar makroskopiskt. Acellulära flikar visar frånvaron av kärnor på histologisk färgning och en signifikant minskning av DNA-innehållet. Detta protokoll kan användas effektivt för att generera decellulariserade mjukvävnadsställningar med bevarad ECM och vaskulär mikroarkitektur. Sådana ställningar kan användas i efterföljande recellulariseringsstudier och har potential för klinisk översättning inom rekonstruktiv kirurgi.
Introduction
Traumatisk skada och tumöravlägsnande kan leda till stora och komplexa mjukvävnadsdefekter. Dessa defekter kan försämra patientens livskvalitet, orsaka förlust av funktion och resultera i permanent funktionshinder. Medan tekniker som autolog vävnadsklafföverföring har praktiserats ofta, är problem med klafftillgänglighet och sjuklighet på donatorstället stora begränsningar 1,2,3. Vaskulariserad sammansatt allotransplantation (VCA) är ett lovande alternativ som överför kompositvävnader, t.ex. muskler, hud, vaskulatur, som en enda enhet till mottagare. VCA kräver dock långvarig immunsuppression, vilket leder till läkemedelstoxicitet, opportunistiska infektioner och maligniteter 4,5,6.
Vävnadskonstruerade acellulära byggnadsställningar är en potentiell lösning på dessa begränsningar7. Acellulära vävnadsställningar kan erhållas med hjälp av decellulariseringsmetoder, som tar bort cellulärt material från inhemska vävnader samtidigt som den underliggande extracellulära matrisen (ECM) mikroarkitekturen bevaras. I motsats till användningen av syntetiska material inom vävnadsteknik erbjuder användningen av biologiskt härledda byggnadsställningar ett biomimetiskt ECM-substrat som möjliggör biokompatibilitet och potentialen för klinisk översättning8. Efter decellularisering kan den efterföljande recellulariseringen av byggnadsställningar med mottagarspecifika celler sedan generera funktionella, vaskulariserade vävnader med liten eller ingen immunogenicitet 9,10,11. Genom att utveckla ett effektivt protokoll för att erhålla acellulära vävnader med hjälp av perfusionsdecellulariseringstekniker kan ett brett spektrum av vävnadstyper konstrueras. I sin tur tillåter byggandet på denna teknik applikationen till mer komplexa vävnader. Hittills har perfusionsdecellularisering av vaskulariserade mjuka vävnader undersökts med hjälp av enkla vaskulariserade vävnader, såsom en fasciokutan flik med full tjocklek hos gnagare12, svin 13 och mänskliga modeller 14, samt svin rectus abdominis skelettmuskel15. Dessutom har komplexa vaskulariserade vävnader också perfusionsdecellulariserats, vilket visats i 16,17-modeller för svin och humant öraoch humana full-face-transplantatmodeller 18.
Här beskriver protokollet decellulariseringen av vaskulariserade fria klaffar med hjälp av biologiskt härledda ECM-ställningar. Vi presenterar decellulariseringen av tre kliniskt relevanta klaffar: 1) omentum, 2) tensor fascia lata och 3) radiell underarm, som alla är representativa för arbetshästflikar som används rutinmässigt vid rekonstruktiv kirurgi och inte tidigare har undersökts i djurstudier inom ramen för vävnadsdecellularisering. Dessa biotekniska klaffar erbjuder en mångsidig och lättillgänglig plattform som har potential för kliniska tillämpningar för användning inom reparation och rekonstruktion av stora mjukdelsdefekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som involverar djurämnen har godkänts av University Health Network Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) och utförs i enlighet med University Health Network Animal Resource Centre protokoll och förfaranden och Canadian Council on Animal Care Guidelines. Fem Yorkshire-grisar (35-50 kg; ålder cirka 12 veckor gamla) användes för alla experiment.
1. Tillverkning av perfusionsbioreaktorer
- Se figur 1 för alla komponenter som används i perfusionsbioreaktorn. För tillverkning av vävnadskammaren, använd kommersiellt tillgängliga snapslåsbehållare av polypropen med vattentäta och lufttäta lock som innehåller ett silikontätningsfoder. Se till att containrarna är autoklavkompatibla.
- Borra två 1/4 i hål längs behållarens sidor och trä ett kort segment av L/S-16 platinabelagda silikonrör. En slang kommer att bära inflödesperfusatet och den andra är för utflödet.
- För inflödesslangen, fäst en manlig Luer-kontakt vid den inre delen som kommer att användas för att ansluta till vävnadskanulen. Fäst en kvinnlig Luer-kontakt i den yttre änden av inflödesslangen som kommer att användas för att ansluta till en trevägs stoppkran.
- Borra ett enda 1/4 hål på kammarlocket och trä ytterligare ett kort segment av L / S-16 platinabelagda silikonrör. Denna slang kommer att fungera som luftventil.
- Gör in- och utflödesslangen genom att mäta cirka 50 cm L/S-16 platinabelagda silikonslangar. Anslut ena änden till en gul pumpslang med tre stopp och den andra änden till en steril 2 ml serologisk pipett för att transportera perfusat från tvättmedelsbehållarna till bioreaktorkammaren.
- Autoklavera alla komponenter (kammare och slang) i individuellt förpackade sterila förpackningar.
Figur 1: Tillverkning av perfusionsbioreaktorn. Perfusionsbioreaktorn består av (A) en plastkammare av polypropen (B) med sidohål borrade för att rymma perfusionsrör med luft- och vattentätt lock. (C) Stoppkranar är fästa vid slangar för att möjliggöra fastsättning av perfusionsslangen som transporterar decellulariseringsmedel från tvättmedelsbehållaren till avfall på ett enda pass. (D) Kompatibla pumpkassetter används för att ansluta trestoppsslangen till den peristaltiska pumpen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Beredning av decellulariseringslösningar
- Bered hepariniserad normal saltlösning (15 IE/ml) genom att späda 1,5 ml 1000 I.U./ml heparinstamlösning i 100 ml normal saltlösning.
- Bered 0,05% w / v natriumdodecylsulfatlösning (SDS) genom att långsamt tillsätta 9 g SDS-pulver till 18 liter autoklaverat destillerat avjoniserat vatten. Använd en stor volym polypropen (PP) carboy för att rymma SDS-lösningen. Lösningen är klar för användning när den är helt upplöst. Förvaras i rumstemperatur.
- Förbered DNase I arbetslösning. Rekonstituera först frystorkat DNas I till en stamkoncentration på 10 mg/ml med 5 mMCaCl2 i sterilt dH2O. Förvara denfärdigberedda DNase I-lösningen som alikvoter i en frys på −20 °C tills den är klar att användas. På användningsdagen, späd DNase I lager 1:100 med Mg++(1,29 mM) och Ca++(1,98 mM) i sterilt dH2O till en slutlig koncentration av 0,1 mg/ml.
DNase-aktiviteten försämras om den inte förvaras fryst. Endast färsk fungerande DNas-lösning ska användas för enzymatisk uppslutning av DNA vid rumstemperatur. - Förbered 1x PBS-lösning genom att späda 10x PBS-stam 1:10 med sterilt autoklaverat vatten i en 5 L slutlig volym i en PP-karboy. Förvaras i rumstemperatur.
- Förbered 1% antibiotika / antimykotika (A / A) i PBS. Späd 100x antibiotika/antimykotika 1:100 med steril 1x PBS-lösning till en slutlig volym på 1 L. Förvaras i rumstemperatur.
- Bered 0,1% (v/v) perättiksyra (PAA)/4% (v/v) etanol (EtOH) genom att tillsätta 3,13 ml PAA + 40 ml 100 % etanol + 956 ml sterilt dH2O. Bringa den slutliga volymen till 1 000 ml och förvara vid rumstemperatur.
3. Upphandling av svinklaffar
OBS: Detta är en terminalprocedur. En gris användes för att skaffa alla tre klaffarna. Avliva djuret humant efter upphandling av alla klaffar.
- Preoperativ vård
- Snabba grisar minst 12 h före operationen. Lugna djuren med ketamin (20 mg/kg intramuskulär, IM), atropin (0,04 mg/kg IM) och midazolam (0,3 mg/kg IM).
- Inducera anestesi genom inandning av 5% isofluran genom en mask med en flödeshastighet på 22-44 ml / kg / min för perifer ledningsinsättning och intubation. Behåll anestesi med 0,5%-2% isofluran vid 22-44 ml/kg/min. Säkerställ ett tillräckligt anestesidjup genom att kontrollera hemodynamisk stabilitet och notera frånvarande palpebral / pedalabstinensreflexer eller käkmuskelton för att beteckna en lämplig nivå av bedövningsmedel som administreras. Administrera intravenös remifentanil (10-20 μg/kg/h) kontinuerlig infusionshastighet under operation för analgesi.
- Intubera grisen med ett lämpligt endotrakealt rör (7-8 mm) och anslut röret till en ventilatorsats till en tidvattenvolym på 8 ml/kg, PEEP på 5 cm H20,FiO2 på 0,5 och andningsfrekvens på 14.
- Sätt in en 22 G angiokateter i öronvenen. När intravenös (IV) åtkomst har erhållits, infusera varm 0,9% normal saltlösning vid 5-10 ml / kg / h under hela proceduren för att upprätthålla medelartärtrycket mellan 60 mmHg och 90 mmHg.
- Övervaka kontinuerligt hjärtfrekvensen, pulsoximetrin och end-tidal CO2. Bedöm blodtryck och kroppstemperatur var 5: e minut.
- Applicera ögonsalva för att förhindra okulär torrhet under anestesi. Förbered hela operationsfältet med povidon-jod. Drapera det kirurgiska fältet med sterila handdukar.
- Omental klaff
- Placera grisen i ryggläge och utför en xypho-navel laparotomi.
- När du kommer in i buken, mobilisera magen cephalad för att visualisera det större omentumet. Placera försiktigt omentum i det operativa fältet och identifiera de gastro-epiploiska kärlen som löper längs magsäckens större krökning (figur 2A).
- Börja vid den vänstra aspekten av den större krökningen där den vänstra gastro-epiploiska artären förenar mjältartären. Med hjälp av raka Stevens tenotomy sax, skelettisera både vänster gastro-epiploic artär och ven. Ligate dela sedan båda separat med kirurgiska band eller klämmor.
- Fortsätt längs den större krökningen i magen från vänster till höger. Ligate och dela de korta vaskulära grenarna som härrör från omentum som levererar den större krökningen i magen. Var försiktig så att du inte skadar omentumets huvudsakliga gastroepiploiska pedikel under detta steg.
- Fortsätt mobiliseringen av det större omentumet tills korsningen av de högra gastro-epiploiska kärlen och gastroduodenalartären påträffas. Med clips eller slipsar, ligate dela sedan den högra gastroepiploic artären och venerna separat för att frigöra omental klaffen.
- När den väl har befriats kan omentum delas längs mitten i två halvor, med varje hälft åtföljd av en respektive gastro-epiploisk artär och ven. Detta möjliggör upphandling av två omentala fria flikar från en djuroperation. Individuellt kannulera de gastro-epiploiska kärlen med en 20-22 G kanyl och säkra sedan med 3-0 silkesband.
- Spola hepariniserad saltlösning (15 I.U./ml) i gastro-epiploisk arteriell kanyl tills ett klart venöst utflöde observeras.
- Tensor fascia lata flik
OBS: Protokollet är baserat på en tidigare beskrivning av svintensor fascia lata flap av Haughey et al.19. Modifiering görs för att isolera endast den fasciala delen av tensor fascia lata klaffen.- Placera grisen i lateralt decubitusläge och raka hela övre bakbenet bilateralt. Förbered och drapera med de vanliga sterila procedurerna.
- Markera klaffens främre gräns med en linje som sträcker sig från den främre överlägsna iliac ryggraden (ASIS) mot lateral patella. Pedikelns placering är ca 6-8 cm från ASIS längs denna linje.
- Markera en parallell bakre linje cirka 8 cm till 10 cm från det främre snittet längs lårbenets axel för att inkludera klaffens bredd. Markera klaffens distala kant vid lateral patella.
- Börja dissektion vid distal marginal vid patella med ett skarpt snitt av huden med en skalpell. Fördjupa hudsnittet med cautery genom den subkutana vävnaden tills fascian som ligger över rectus femoris påträffas.
- Fortsätt hudsnitten mot ASIS längs de markerade främre och bakre gränserna som beskrivs ovan. För att isolera den fasciala klaffen ensam, ta bort den överliggande hudkomponenten från det underliggande fasciala skiktet. Ligate eller cauterize några små perforatorkärl till huden.
- Återgå till klaffens distala kant och snitta den djupa fascian för att möjliggöra mobilisering av den underliggande vastus lateralis-muskeln. Mobilisera fascian mot ASIS.
- Under mobilisering, identifiera den vaskulära pedikeln som kommer ut mellan musklerna vastus lateralis och rectus femoris (figur 2B). Var noga med att undvika överdriven dragkraft för att inte skada pedikelkärlen.
- Dissekera den proximala aspekten från ASIS samtidigt som du skyddar den vaskulära pedikeln. Dissekera tills klaffen är tillräckligt mobiliserad om pedikeln.
- Spåra pedikeln mot de djupa lårbenskärlen. Skelettisera både den laterala circumflex lårbensartären och venen som levererar fascialklaffen. Ligate delar sedan båda kärlen proximalt där de går med i de djupa lårbenskärlen.
- Cannulate pedikelkärlen individuellt med 20 G till 24 G angiokatetrar, säkrade med 3-0 silkesband. Spola hepariniserad saltlösning (15 I.U./ml) i klaffens arteriella kanyl tills ett tydligt venöst utflöde observeras.
- Radiell underarmsflik
OBS: Protokollet nedan är baserat på en publicerad beskrivning av porcinens radiella underarmsflikmodell av Khachatryan et al.20.- Placera grisen på operationsbordet i lateralt decubitusläge. Placera det beroende frambenet inom det operativa fältet.
- Markera en ungefärlig 3 cm x 3 cm hudflikskvadrat på den radiella underarmen. Rita en linje mellan mittpunkten för den proximala klaffmarginalen och den antecubitala fossan för att beteckna den ungefärliga kursen för den radiella artärpedikeln. Bekräfta artärkursen med palpation.
OBS: I svinmodellen ligger de radiella kärlen relativt djupare än hos människor. Deras läge är mellan flexor carpi radialis och brachioradialis. - Skär huden med en skalpell vid den distala aspekten med ett djup upp till antebrachial fascia. Trubbig dissekera med tenotomy sax tills den distala radiella artären och dess två venae comitantes påträffas. Ligate artären och venerna med kirurgiska band individuellt och dela.
- Fortsätt hudens snitt på de radiella och ulnara marginalerna på den markerade hudrutan. Mobilisera klaffen från det underliggande radiella benet med ett kirurgiskt blad som går från en radiell till ulnar riktning samtidigt som du höjer hudfliken proximalt mot den antecubitala fossan.
OBS: Behåll ett subfascialt dissektionsplan för att säkerställa att den radiella artärpedikeln förblir associerad med det överliggande kutana skiktet. - Vid den proximala marginalen drar du tillbaka utrymmet mellan brachioradialis och flexor carpi radialis med en självhållande retraktor för att exponera den proximala radiella artären och dess venae comitantes (figur 2C).
- Med hjälp av tenotomy sax, skelettisera den radiella artären och venae comitantes proximalt vid antecubital fossa där de går med i brachialartären respektive venerna. Dissekera kärlen från de omgivande fibrofettvävnaderna för att uppnå en tillräcklig pedikellängd på ca 5-6 cm. Ligate och dela artären och venae separat för att frigöra den radiella underarmsfliken.
- Cannulate pedikelkärlen med 20 G till 24 G angiokatetrar, säkrade med 3-0 silkesband. Spola hepariniserad saltlösning (15 IE / ml) i klaffartärkanylen tills ett tydligt venöst utflöde observeras.
- Efter klaffupphandling, håll klaffarna i kall saltlösning vid 4 °C tills de är redo för decellularisering. Under djup isoflurananestesi avliva djuren med en intravenös injektion av kaliumklorid (100 mg/kg IV). Bekräfta döden genom frånvaro av vitala tecken.
Figur 2: Upphandling av tre vaskulära flikar för svin . (A) Omentum. De högra (i) och vänstra (ii) gastroepiploiska artärerna kannuleras i omentalklaffen (iii). (B) Tensor fascia lata. Klaffens pedikel (iv) är den stigande grenen av den laterala femorala circumflexartären (v). (C) Radiell underarmsflik. Upphandling av den radiella underarmsfliken (vi) baseras på den radiella artären och vena comitantes (vii) som vaskulär pedikel (OBS: Draperier utelämnades för demonstrationsändamål). Skalstreck: 3 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Installation av decellulariseringssystemet
- Montera vävnadskammaren med flikar under sterila förhållanden i ett laminärt flöde biosäkerhetsskåp.
- Fäst en trevägs stoppkran på både bioreaktorns in- och utflödesportar. Fäst ett 0,2 μm filter på luftventilporten på vävnadskammarens lock. Fyll inloppsslangen med steril hepariniserad saltlösning för att eliminera luftbubblor.
- Placera flikarna i kammaren. Använd sterila hemostater och anslut flikarna till inflödesslangen med hjälp av Luer-kontakten. Skruva fast respektive artärkanyl på varje flik på hanen Luer och se till att den tätar ordentligt.
- Spola hepariniserad saltlösning genom stoppkranen för att kontrollera att Luer-anslutningen är utan läckage och att klaffarna kan genomsyras med bevis på venöst utflöde. Stäng vävnadskammarens lock.
- Anslut inflödesslangen med en gul pumpslang med tre stopp till vävnadskammarens inflödesstoppkran. Fäst också en inbyggd tryckgivare till inflödesstoppkranen för att möjliggöra övervakning av perfusionstryck.
- Slå på inflödet peristaltisk pump. På startskärmen fortsätter du till den tredje fliken med piltangenten för att ställa in slang-ID till 1,85 mm. Fortsätt sedan till den andra fliken för att ställa in perfusionshastigheten. Inmatningshastighet som leveranssätt och inställd på 2 ml / min. Se till att flödesriktningen är korrekt som visas på skärmen. Ladda pumpslangen med tre stopp till den peristaltiska pumpen med en kompatibel kassett.
- Upprepa proceduren för utflödesperistaltisk pump som liknar ovan. Ställ in utflödespumpens inställning på hastighet vid 4 ml / min. Anslut utflödesslangen med en gul pumpslang med tre stopp till vävnadskammarens utflödesstoppkran. Ladda pumpslangen med tre stopp till den peristaltiska pumpen med en kompatibel kassett. Starta flödet för båda pumparna genom att trycka på strömbrytaren .
OBS: Den högre hastigheten på utflödespumpen är en avgörande säkerhetsåtgärd för att förhindra överflöde av vävnadskammaren, vilket säkerställer att kammarens utflöde alltid överstiger inflödet under decellularisering. Hela den sammansatta decellulariseringsinställningen visas i figur 3.
Figur 3: Monterat perfusionsdecellulariseringssystem. (A) Schematisk för perfusionsdecellulariseringssystemet. Inloppsslangen transporterar perfusat från tvättmedelsbehållaren in i vävnadskammaren på ett enda pass sätt med trycksensorövervakning. Utflödesslangen tar bort perfusat aktivt från vävnadskammaren till avfallsbehållaren. Svarta pilar betecknar riktningen för perfusionsflödet. En peristaltisk pump används med vänster pump för att styra inflödet. Utflödet avlägsnas aktivt med hjälp av en andra peristaltisk pump genom respektive slang. Figur skapad med BioRender.com. B) Fotografi av perfusionsdecellulariseringssystemet monterat på bänkskivan med inflödesperistaltikpumpen (i) ansluten till vävnadskamrarna (ii) och sedan utflödesperistaltikpumpen (iii). Inflödesperfusattrycket övervakas med en in-line trycksensor (iv) innan den kommer in i vävnadskammaren. Här decellulariseras tre flikar parallellt. Både tvättmedlet och avfallskärlen ligger under bänkskivan och är inte fotograferade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. Decellularisering av svinflikar
- Utför alla följande steg för perfusionsdecellularisering vid rumstemperatur. För en sammanfattning av perfusionshastigheter och varaktigheter, se tabell 1. Börja perfusionen av hepariniserad saltlösning vid 2 ml / min med en peristaltisk pump och perfusera flikarna med hepariniserad saltlösning i vävnadskammaren i 15 minuter för att avlägsna eventuella kvarhållna blodproppar.
- Efter avslutad hepariniserad saltlösningsperfusion, aspirera kvarvarande saltlösning i vävnadskammaren. Fyll vävnadskammaren med cirka 500 ml SDS-decellulariseringslösning för att sänka klaffen tillräckligt.
- Överför inloppsslangen till SDS-decellulariseringslösningen och perfusera vävnaden vid 2 ml / min. Varaktigheten av perfusion varierar beroende på klaffen; perfuse SDS i 2 dagar för omentum, 3 dagar för tensor fascia och 5 dagar för radiell underarm fascio-kutan flik.
- Efter avslutad SDS-decellularisering, aspirera det befintliga SDS-perfusatet som finns i vävnadskammaren. Överför inloppsslangen till 1x PBS-lösning och perfusera klaffarna i 1 dag vid 2 ml/min.
- Ta bort den tidigare PBS-lösningen och överför inflödesslangen till DNase-arbetslösningen. Håll i 2 timmar vid 2 ml/min. Ta bort DNase-lösningen från vävnadskammaren och placera inloppsslangen i 1x PBS-lösning. Sänk ner vävnaderna med 1x PBS-lösning i kammaren och perfus 1x PBS-lösning i 1 dag vid 2 ml / min.
- Sterilisera flikarna med PAA/EtOH-lösning. Överför inflödesslangen till PAA/EtOH i dH2O-lösningoch sänk ner vävnaderna i samma lösning. Perfuse PAA/EtOH vid 2 ml/min i 3 timmar. När PAA/EtOH-steriliseringen är klar, koppla bort slangen från trevägsstoppkranarna.
- Ta bort flikarna med aseptisk teknik och placera de sterila instrumenten i PBS som innehåller 1% antibiotika / antimykotika (A / A). Sänk ner flikarna med PBS + 1% A/A i 15 min i två separata tvättar för att helt neutralisera kvarvarande syra. Håll flikarna i PBS + 1% A/A vid 4 °C tills de är redo för recellularisering.
- Verifiera ställningens sterilitet genom att utföra en svabbodling på agarplattor och undersök för mikrobiell tillväxt. Inokulera agarplattor med vattpinnar som tas från varje klaffyta. Odla agarplattorna vid 37 °C i upp till 2 veckor. Sterilitet demonstreras av frånvaron av mikrobiell kolonitillväxt.
Tabell 1: Sammanfattning av parametrar för perfusion-decellulariseringsprotokoll. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
6. Utvärdering av decellularisering
- Använd en stansbiopsi, skaffa prover 3 mm till 10 mm i tjocklek från flikarna.
- För histologi, fixa biopsier i histologiska kassetter i normalt buffrat formalin i 24 timmar vid rumstemperatur.
- Tvätta biopsikassetterna i vatten eller PBS i 15 minuter och placera dem sedan i 70% etanol tills de är klara för vävnadsbehandling. Bearbeta kassetterna i en vävnadsprocessor enligt standardprotokoll.
- Bädda in biopsierna i paraffin, så att vaxet stelnar i 10-15 min på en kall tallrik. Sektionsparaffinblock på en mikrotom till 5 μm tjocklek. Färga objektglasen med hematoxylin och eosin (H&E) enligt standardprotokoll. Föreställ dig vävnadsglasen med ljusmikroskopi.
- För kvantifiering av DNA-halten, erhålla vävnadsbiopsiernas torrvikt efter torkning av vävnad över natten i en ugn vid 60 °C. Smält proverna i en papain extraktionsbuffert vid 65 °C över natten. Centrifugera de smälta proverna vid 10 000 x g och överför supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör. Analysera DNA-innehållet med ett kommersiellt DNA-extraktionssats enligt tillverkarens instruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll för att decellularisera vaskulariserade svinflikar förlitar sig på perfusion av ett jonbaserat tvättmedel, SDS, genom klaffvaskulaturen i en anpassad perfusionsbioreaktor. Före decellularisering anskaffades och kannulerades tre vaskulariserade klaffar i en svinmodell enligt deras huvudförsörjningskärl. Klaffarna spolades omedelbart efter upphandling för att upprätthålla en patenterbar, perfusabel kärl för att möjliggöra framgångsrik decellularisering. Med hjälp av lufttäta snap-lock-behållare utformades en anpassad bioreaktor för att möjliggöra klaffperfusion i en sluten miljö. Perfusion av klaffar i bioreaktorn uppnåddes på ett enda pass sätt med hjälp av två peristaltiska pumpar anslutna till vävnadskammaren. Perfusionstrycket övervakades med en in-line trycksensor.
Under decellularisering var varaktigheten av SDS-exponering beroende av vilken typ av vävnad som bearbetades. Med den beskrivna perfusionsdecellulariseringstekniken decellulariserades omentum, tensorfascia och radiella underarmsflikar med 0,05% SDS i 2 dagar, 3 dagar respektive 5 dagar. Framgångsrik sterilisering efter decellularisering demonstrerades av frånvaron av mikrobiell kolonitillväxt efter att ha svabbat flikarna och odlat pinnarna på agarplattor i 14 dagar. Perfusionstrycket övervakades med en flödeshastighet på 2 ml/min och varierade mellan 20-60 mmHg under alla stadier av decellularisering för alla tre klaffarna. Efter avslutad decellularisering spolades flikarna under manuell kontroll och visade tecken på utflöde från en venös kanyl kvar till fri dränering (Supplementary Video 1, Supplementary Video 2, Supplementary Video 3).
Totalt 15 flikar decellulariserades, med fem replikat för var och en av de tre vävnadstyperna. Vid undersökning verkade bruttomorfologin hos inhemska vävnader rosafärgad (figur 4A, E, I), medan decellulariserade vävnader var karakteristiskt vita / ogenomskinliga i utseende (figur 4C, G, K). Histologisk undersökning av inhemska vävnader med H&E visar närvaron av blå kärnor (figur 4B,F,J). I decellulariserade flikar visade H&E-färgning en förlust av cellulärt material med frånvaro av blå kärnfärgning (figur 4D,H,L), vilket indikerar en acellulär vävnadsställning. Ytterligare kvantifiering av DNA-halten i de fem replikaten visade en statistiskt signifikant minskning av DNA i de acellulära byggnadsställningarna jämfört med inhemska vävnader med en Students t-test för varje klaff (figur 5). I omentumet minskade DNA från 460 ng/mg ± 124 ng/mg torrvävnad i den ursprungliga klaffen till 25,8 ng/mg ± 5,90 ng/mg torrvävnad i den decellulariserade klaffen (n = 5, p < 0,05). I tensor fascia lata minskade DNA från 297 ng/mg ± 68,2 ng/mg till 58,3 ng/mg ± 13,5 ng/mg mellan inhemska respektive decellulariserade klaffar (n = 5, p < 0,05). Den radiella underarmsfliken visade en DNA-minskning från 1180 ng/mg ± 241 ng/mg i den ursprungliga klaffen till 162 ng/mg ± 34,9 ng/mg i den decellulariserade klaffen (n = 5, p < 0,05).
Figur 4: Decellularisering av tre svinflikar. Grov undersökning av (A) infödda omentum, (E) tensor fascia lata och (I) radiella underarmsflikar visar klaffarnas rosa utseende omedelbart efter upphandling. Den histologiska färgningen av inhemska vävnader visar tydlig hematoxylinfärgning av cellulära kärnor med H&E (B,F,J). Efter decellularisering verkar (C) omentum, (G) tensor fascia lata och (K) radiell underarm grovt vit och ogenomskinlig. Histologiskt visar de tre decellulariserade flikarna en frånvaro av kärnfärgning med H&E (D,H,L). Skalstreck: 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Kvantifiering av DNA-innehåll i acellulära byggnadsställningar. Värdena normaliseras till mg torr ställningsmassa. Färska vävnadsprover från inhemska, icke-decellulariserade vävnader (n = 5) och decellulariserade vävnader (n = 5) torkades och vägdes före matsmältningen över natten i papain före kvantifiering. Statistisk testning använde Students t-tester med en signifikansnivå (**) definierad som ett p-värde < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1. Tidskursundersökning av progressionen av perfusion-decellularisering av omentum med användning av 0,05% natriumdodecylsulfat under 5 dagar genom grovundersökning (skalstänger = 3 cm) och H&E-histologi (skalstänger = 200 μm). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2. Tidskursundersökning av progressionen av perfusion-decellularisering av tensor fascia lata med användning av 0,05% natriumdodecylsulfat under 5 dagar genom grovundersökning (skalstänger = 3 cm) och H&E-histologi (skalstänger = 200 μm). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3. Tidskursundersökning av progressionen av perfusion-decellularisering av radiell underarmsflik med användning av 0,05% natriumdodecylsulfat under 5 dagar genom grovundersökning (skalstänger = 3 cm) och H&E-histologi (skalstänger = 200 μm). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande video 1. Representativ manuell perfusion av den decellulariserade omentumklaffen via artärkanylen (rosa) som visar utflöde från den fritt dränerande venösa kanylen (gul). Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande video 2. Representativ manuell perfusion av den decellulariserade tensor fascia lata-klaffen via artärkanylen (rosa) som visar utflöde från den fritt dränerande venösa kanylen (blå). Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande video 3. Representativ manuell perfusion av den decellulariserade radiella underarmsfliken via artärkanylen (blå) som visar utflöde från den fritt dränerande venösa kanylen (gul). Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det föreslagna protokollet använder perfusion av SDS med låg koncentration för att decellularisera en rad svin-härledda klaffar. Med denna procedur kan acellulär omentum, tensor fascia lata och radiella underarmsflikar framgångsrikt decellulariseras med hjälp av ett protokoll som gynnar SDS med låg koncentration. Preliminära optimeringsexperiment har fastställt att SDS vid en låg koncentration (0,05%) mellan 2 dagar och 5 dagar kan ta bort cellulärt material för omentum, tensor fascia lata och radiell underarmsflik när det analyseras med histologiska tekniker (kompletterande figur 1, kompletterande figur 2, kompletterande figur 3). Denna metod erbjuder ett enkelt tillvägagångssätt som uppnår decellularisering inom en kort tidsram och till en rimlig kostnad. Enligt vår erfarenhet tar decellularisering och sterilisering av svinflikar mellan 2-5 dagar, med längre varaktighet decellularisering som behövs för vävnader med större densitet (t.ex. underarmshud vid 5 dagar jämfört med omentum vid 2 dagar). Vidare valdes den låga koncentrationen av SDS som används i detta protokoll baserat på motiveringen att en låg koncentration av SDS vid 0,05% faller under den kritiska micellära koncentrationen av SDS (ungefär vid 0,2% 21) och därmed tillåter ytaktivt ämne att effektivt solubilisera cellmembran samtidigt som viktiga bioaktiva ECM-komponenter lämnas intakta. Användningen av SDS med låg koncentration i detta protokoll står i kontrast till användningen av relativt högre koncentrationer av SDS (t.ex. 1%) för perfusion-decellularisering av vaskulariserade fascio-kutana flikar som rapporterats av tidigare författare13,22. Höga koncentrationer av SDS, även om de är effektiva vid decellularisering, kommer på bekostnad av att ådra sig skadliga effekter på ECM-ställningen, såsom GAG och tillväxtfaktorutarmning, samt denaturering av proteiner som kollagen och vimentin23,24. Faktum är att framtida arbete inom perfusion-decellularisering av vaskulariserade flikar hos svin kommer att dra nytta av ytterligare karakteriseringsstudier för att undersöka effekterna av decellulariseringsmedlet på ECM på strukturell och molekylär nivå och deras konsekvenser för nedströms recellularisering25,26,27 . Analyser för ECM-komponenter som kollagen-, elastin- eller GAG-innehåll kan användas för att kvantitativt bedöma förändringar i ECM efter decellularisering. Dessutom är mekanisk hållfasthetstestning en användbar metod för att studera förändringar av de biomekaniska egenskaperna efter decellularisering. Slutligen kommer bedömning av vaskulariteten med hjälp av tekniker som angiografi eller mikroCT-skanning också att bidra till att karakterisera den vaskulära arkitekturen på systemnivå som en förutsättning för att generera perfusable vaskulariserade flikar28.
Flera tekniska överväganden bör noteras med detta protokoll. För det första bör extrem försiktighet iakttas vid klaffhantering och montering av bioreaktorer för att förhindra oavsiktlig dekaannulering, eftersom recannulation i en ex vivo-miljö är jämförelsevis svårare. För det andra, under klaffupphandling, är det viktigt att få en intakt flik med en perfusabel och intakt vaskulär pedikel för framgångsrik decellularisering. Försiktighet bör iakttas vid upphandling för att säkerställa att distala läckagepunkter i ställningen antingen klipps eller binds för hand. Detta kommer att bidra till att minska läckage, vilket kan orsaka ofullständig perfusion av lösningar genom klaffvaskulaturen. En initial period av perfusion med hepariniserad saltlösning efter tillvaratagande förhindrar kvarhållande av blodproppar och verifierar en perfusabel vaskulatur som framgår av venöst perfusatutflöde. Decellulariserade vävnader kan också spolas igen efter avslutad decellularisering för att kontrollera eventuella intravaskulära hinder (t.ex. från cellskräp / luftemboli) som kan utesluta klaffperfusabilitet. Enligt vår erfarenhet visade decellulariserade flikar inget intravaskulärt motstånd mot sprutspolning enligt detta protokoll, medan venöst utflöde återigen kunde observeras från den decellulariserade klaffen efter spolning (kompletterande video 1, kompletterande video 2, kompletterande video 3). Detta var ett tecken på en patentartär till venös vaskulär slinga med anslutande kapillärer som kan perfuseras.
Ett annat övervägande görs angående perfusionsparametrarna under decellularisering. I detta protokoll valdes en konstant flödeshastighetsperfusion med en målflödeshastighet på 2 ml/min, vilket låg inom intervallet för de driftsflödeshastigheter som användes i tidigare publicerade decellulariseringsstudier av svinklaffvävnader13,29. Dessutom innehåller vårt decellulariseringssystem en realtids in-line tryckövervakningskapacitet för att övervaka potentiella fluktuationer i intravaskulär resistans under perfusion; denna metod kan hjälpa till att undvika höga perfusionstryck som uppstår vid eventuell intravaskulär ocklusion som kan skada den mikrovaskulära ECM.
Slutligen är sterilisering av den resulterande ställningen en annan viktig teknisk faktor. Vi införlivade en steriliseringsfas som det sista steget i decellulariseringsprotokollet för att ta itu med tillfällig miljöförorening som kan uppstå under decellularisering. Klaffsterilitet är särskilt viktigt så att klaffar kan användas i framtiden för recellularisering. Perfusionen av 0,1% perättiksyra/4% EtOH som sterilt medel har tidigare rapporterats av grupper för sterilisering av acellulära ställningar30,31 och visade sig också vara effektiv med detta protokoll. Sterilitet verifierades genom att undersöka klaffpinnar på agarplattor och notera frånvarande tillväxt efter 14 dagars inkubation.
Den kundanpassade perfusionsbioreaktorn som utformats för experimenten är relativt kostnadseffektiv samt enkel och snabb att montera. Dessutom är alla komponenter i denna perfusionsbioreaktor autoklaverbara och anpassningsbara för recellulariseringsarbete samtidigt som klaffarnas sterilitet bibehålls. Den anpassade bioreaktorkretsen kan enkelt modifieras för att möjliggöra perfusion med öppen krets som kan cirkulera cellodlingsmedier genom en recellulariserad byggnadsställning efter cellsåddsexperiment. Ändå är några begränsningar av bioreaktorsystemet värda att nämna. För det första minskar användningen av två kommersiella pumpar, även om det är nödvändigt för att förhindra oavsiktligt överflöde av systemet, särskilt när stora volymer perfusat används, den annars låga kostnaden för perfusionsuppsättningen. Dessutom kan den låga genomströmningen av det nuvarande perfusionsbioreaktorsystemet ge logistiska utmaningar när man behöver köra många experimentella replikat parallellt; Jämförelsevis högre genomströmningssystem utvecklade för njurecellulariseringhos svin 32 kan en dag anpassas för svinklaffscellularisering för att lindra dessa logistiska utmaningar. Slutligen, medan den utvecklade bioreaktorn är enkel att installera, behövs mänsklig övervakning och manuell drift fortfarande regelbundet och ofta för att säkerställa att inget fel i systemet uppstår. Modifieringar av bioreaktorn som innehåller automatiseringsfunktioner som både kan övervaka och justera bioreaktorns prestanda med minimal eller ingen mänsklig intervention kan eftersträvas för att främja perfusion-decellulariseringsbioreaktorteknik i framtiden33,34.
Huvudtillämpningen av decellulariserade flikar är att tillåta efterföljande recellularisering av dessa acellulära byggnadsställningar med cellpopulationer som kan regenerera vaskulaturen. Medan mycket framtida forskning krävs för att bestämma lämpliga cellnummer, populationer, såddstrategier och bioreaktorförhållanden för att regenerera funktionell och livskraftig vaskulariserad vävnad, representerar detta protokoll det första grundläggande arbetet mot detta mål. Framtida metoder för recellularisering kommer att bidra till att etablera strategier för att konstruera mjukvävnadsflikar med ett intakt perfusabelt vaskulärt nätverk och bidra till att potentiellt regenerera mer komplexa kompositvävnader, såsom extremitets- och ansiktsallografter. Dessa byggnadsställningar kan en dag kringgå sjuklighet och immunsuppression på donatorstället för patienter som genomgår storskalig mjukvävnadsrekonstruktion och därigenom förbättra deras kliniska resultat och livskvalitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
| 0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
| 20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
| 3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
| 3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
| Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
| BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
| BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
| BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
| Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
| Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
| Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
| Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
| Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
| Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
| Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
| Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
| Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
| Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
| Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
| Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
| TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |
References
- Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study. Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).
- Edsander-Nord, Å, Jurell, G., Wickman, M. Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study. Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).
- Qian, Y., et al. A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651 (2018).
- Issa, F. Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses. Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Iske, J., et al. Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges. Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016, 1541823 (2016).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).
- Colazo, J. M., et al. Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration. Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).
- Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A.
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering - Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
- Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization. Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).
- Zhang, J., et al. Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template. Biomaterials. 89, 114-126 (2016).
- Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
- Duisit, J., et al. Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering. Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
- Khachatryan, A., et al. Radial Forearm Flap. Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , Springer. Denmark. 177-181 (2021).
- Hammouda, B. Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).
- Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold. Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).
- Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 84, 25-34 (2015).
- Mendibil, U., et al. Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds. International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447 (2020).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).
- Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
- Adil, A., Xu, M., Haykal, S. Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation. Frontiers in Surgery. 9, 843677 (2022).
- Phelps, E. A., García, A. J. Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering. Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).
- Pozzo, V., et al. A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies. Journal of Visualized Experiments. (181), e63557 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. Journal of Visualized Experiments. (48), e2394 (2011).
- Uzarski, J. S., et al. Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development. Journal of Visualized Experiments. (102), e53271 (2015).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
- Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. Decellularization systems and devices: State-of-the-art. Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).
- Schilling, B. K., et al. Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering. Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).
