Protokollet beskriver den kirurgiska tillvaratagandet och efterföljande decellularisering av vaskulariserade svinflikar genom perfusion av natriumdodecylsulfattvättmedel genom klaffvaskulaturen i en anpassad perfusionsbioreaktor.
Stora volymer mjukvävnadsdefekter leder till funktionella underskott och kan i hög grad påverka patientens livskvalitet. Även om kirurgisk rekonstruktion kan utföras med användning av autolog fri klafföverföring eller vaskulariserad kompositallotransplantation (VCA), har sådana metoder också nackdelar. Problem som sjuklighet på donatorstället och vävnadstillgänglighet begränsar autolog fri klafföverföring, medan immunsuppression är en betydande begränsning av VCA. Konstruerade vävnader i rekonstruktiv kirurgi med hjälp av decellulariserings- / recellulariseringsmetoder representerar en möjlig lösning. Decellulariserade vävnader genereras med hjälp av metoder som tar bort inbyggt cellulärt material samtidigt som den underliggande extracellulära matrisen (ECM) mikroarkitekturen bevaras. Dessa acellulära ställningar kan sedan recellulariseras med mottagarspecifika celler.
Detta protokoll beskriver de upphandlings- och decellulariseringsmetoder som används för att uppnå acellulära byggnadsställningar i en grismodell. Dessutom ger den också en beskrivning av perfusionsbioreaktorns design och installation. Flikarna inkluderar svinomentum, tensor fascia lata och den radiella underarmen. Decellularisering utförs via ex vivo-perfusion av natriumdodecylsulfat (SDS) tvättmedel med låg koncentration följt av DNas-enzymbehandling och perättiksyrasterilisering i en anpassad perfusionsbioreaktor.
Framgångsrik vävnadsdecellularisering kännetecknas av ett vitt ogenomskinligt utseende av flikar makroskopiskt. Acellulära flikar visar frånvaron av kärnor på histologisk färgning och en signifikant minskning av DNA-innehållet. Detta protokoll kan användas effektivt för att generera decellulariserade mjukvävnadsställningar med bevarad ECM och vaskulär mikroarkitektur. Sådana ställningar kan användas i efterföljande recellulariseringsstudier och har potential för klinisk översättning inom rekonstruktiv kirurgi.
Traumatisk skada och tumöravlägsnande kan leda till stora och komplexa mjukvävnadsdefekter. Dessa defekter kan försämra patientens livskvalitet, orsaka förlust av funktion och resultera i permanent funktionshinder. Medan tekniker som autolog vävnadsklafföverföring har praktiserats ofta, är problem med klafftillgänglighet och sjuklighet på donatorstället stora begränsningar 1,2,3. Vaskulariserad sammansatt allotransplantation (VCA) är ett lovande alternativ som överför kompositvävnader, t.ex. muskler, hud, vaskulatur, som en enda enhet till mottagare. VCA kräver dock långvarig immunsuppression, vilket leder till läkemedelstoxicitet, opportunistiska infektioner och maligniteter 4,5,6.
Vävnadskonstruerade acellulära byggnadsställningar är en potentiell lösning på dessa begränsningar7. Acellulära vävnadsställningar kan erhållas med hjälp av decellulariseringsmetoder, som tar bort cellulärt material från inhemska vävnader samtidigt som den underliggande extracellulära matrisen (ECM) mikroarkitekturen bevaras. I motsats till användningen av syntetiska material inom vävnadsteknik erbjuder användningen av biologiskt härledda byggnadsställningar ett biomimetiskt ECM-substrat som möjliggör biokompatibilitet och potentialen för klinisk översättning8. Efter decellularisering kan den efterföljande recellulariseringen av byggnadsställningar med mottagarspecifika celler sedan generera funktionella, vaskulariserade vävnader med liten eller ingen immunogenicitet 9,10,11. Genom att utveckla ett effektivt protokoll för att erhålla acellulära vävnader med hjälp av perfusionsdecellulariseringstekniker kan ett brett spektrum av vävnadstyper konstrueras. I sin tur tillåter byggandet på denna teknik applikationen till mer komplexa vävnader. Hittills har perfusionsdecellularisering av vaskulariserade mjuka vävnader undersökts med hjälp av enkla vaskulariserade vävnader, såsom en fasciokutan flik med full tjocklek hos gnagare12, svin 13 och mänskliga modeller 14, samt svin rectus abdominis skelettmuskel15. Dessutom har komplexa vaskulariserade vävnader också perfusionsdecellulariserats, vilket visats i 16,17-modeller för svin och humant öraoch humana full-face-transplantatmodeller 18.
Här beskriver protokollet decellulariseringen av vaskulariserade fria klaffar med hjälp av biologiskt härledda ECM-ställningar. Vi presenterar decellulariseringen av tre kliniskt relevanta klaffar: 1) omentum, 2) tensor fascia lata och 3) radiell underarm, som alla är representativa för arbetshästflikar som används rutinmässigt vid rekonstruktiv kirurgi och inte tidigare har undersökts i djurstudier inom ramen för vävnadsdecellularisering. Dessa biotekniska klaffar erbjuder en mångsidig och lättillgänglig plattform som har potential för kliniska tillämpningar för användning inom reparation och rekonstruktion av stora mjukdelsdefekter.
Det föreslagna protokollet använder perfusion av SDS med låg koncentration för att decellularisera en rad svin-härledda klaffar. Med denna procedur kan acellulär omentum, tensor fascia lata och radiella underarmsflikar framgångsrikt decellulariseras med hjälp av ett protokoll som gynnar SDS med låg koncentration. Preliminära optimeringsexperiment har fastställt att SDS vid en låg koncentration (0,05%) mellan 2 dagar och 5 dagar kan ta bort cellulärt material för omentum, tensor fascia lata och radiell under…
The authors have nothing to disclose.
Ingen
0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |