Summary

Obtención y perfusión-descelularización de colgajos vascularizados porcinos en un biorreactor de perfusión personalizado

Published: August 01, 2022
doi:

Summary

El protocolo describe la obtención quirúrgica y la posterior descelularización de colgajos porcinos vascularizados mediante la perfusión de detergente dodecil sulfato de sodio a través de la vasculatura del colgajo en un biorreactor de perfusión personalizado.

Abstract

Los defectos de tejido blando de gran volumen conducen a déficits funcionales y pueden afectar en gran medida la calidad de vida del paciente. Aunque la reconstrucción quirúrgica se puede realizar mediante transferencia autóloga de colgajo libre o alotrasplante compuesto vascularizado (VCA), tales métodos también tienen desventajas. Problemas como la morbilidad del sitio donante y la disponibilidad de tejido limitan la transferencia autóloga de colgajo libre, mientras que la inmunosupresión es una limitación significativa de VCA. Los tejidos diseñados en cirugía reconstructiva utilizando métodos de descelularización/recelularización representan una posible solución. Los tejidos descelularizados se generan utilizando métodos que eliminan el material celular nativo al tiempo que preservan la microarquitectura de la matriz extracelular subyacente (ECM). Estos andamios acelulares pueden ser posteriormente recelularizados con células específicas del receptor.

Este protocolo detalla los métodos de adquisición y descelularización utilizados para lograr andamios acelulares en un modelo de cerdo. Además, también proporciona una descripción del diseño y la configuración del biorreactor de perfusión. Los colgajos incluyen el epiplón porcino, la fascia lata tensora y el antebrazo radial. La descelularización se realiza mediante perfusión ex vivo de detergente de dodecil sulfato de sodio (SDS) de baja concentración, seguido de un tratamiento con enzimas DNasa y esterilización con ácido peracético en un biorreactor de perfusión personalizado.

La descelularización tisular exitosa se caracteriza por una apariencia blanco-opaca de colgajos macroscópicamente. Los colgajos acelulares muestran la ausencia de núcleos en la tinción histológica y una reducción significativa en el contenido de ADN. Este protocolo se puede utilizar de manera eficiente para generar andamios de tejidos blandos descelularizados con ECM preservada y microarquitectura vascular. Tales andamios se pueden utilizar en estudios posteriores de recelularización y tienen el potencial de traducción clínica en cirugía reconstructiva.

Introduction

La lesión traumática y la extirpación del tumor pueden conducir a defectos grandes y complejos de tejidos blandos. Estos defectos pueden afectar la calidad de vida del paciente, causar pérdida de la función y provocar una discapacidad permanente. Si bien técnicas como la transferencia de colgajo de tejido autólogo se han practicado comúnmente, los problemas con la disponibilidad de colgajo y la morbilidad del sitio donante son limitaciones importantes 1,2,3. El alotrasplante compuesto vascularizado (ACV) es una alternativa prometedora que transfiere tejidos compuestos, por ejemplo, músculo, piel, vasculatura, como una sola unidad a los receptores. Sin embargo, VCA requiere inmunosupresión a largo plazo, lo que conduce a toxicidad farmacológica, infecciones oportunistas y neoplasias malignas 4,5,6.

Los andamios acelulares de ingeniería tisular son una solución potencial a estas limitaciones7. Los andamios de tejido acelular se pueden obtener utilizando métodos de descelularización, que eliminan el material celular de los tejidos nativos al tiempo que preservan la microarquitectura de la matriz extracelular subyacente (ECM). En contraste con el uso de materiales sintéticos en la ingeniería de tejidos, el uso de andamios derivados biológicamente ofrece un sustrato de ECM biomimético que permite la biocompatibilidad y el potencial para la traducción clínica8. Después de la descelularización, la posterior recelularización de andamios con células específicas del receptor puede generar tejidos funcionales, vascularizados y con poca o ninguna inmunogenicidad 9,10,11. Mediante el desarrollo de un protocolo eficaz para obtener tejidos acelulares utilizando técnicas de descelularización de perfusión, se puede diseñar una amplia gama de tipos de tejidos. A su vez, la construcción de esta técnica permite la aplicación a tejidos más complejos. Hasta la fecha, la descelularización por perfusión de tejidos blandos vascularizados se ha investigado utilizando tejidos vascularizados simples, como un colgajo fasciocutáneo de espesor total en roedores 12, porcinos13 y modelos humanos 14, así como músculo esquelético recto abdominal porcino15. Además, los tejidos vascularizados complejos también han sido descelularizados por perfusión, como se demostró en los modelos de oído porcino y humano 16,17 y en los modelos de injerto de cara completa humana18.

Aquí, el protocolo describe la descelularización de colgajos libres vascularizados utilizando andamios de ECM derivados biológicamente. Presentamos la descelularización de tres colgajos clínicamente relevantes: 1) el epiplón, 2) el tensor de la fascia lata, y 3) el antebrazo radial, todos los cuales son representativos de los colgajos de caballo de batalla utilizados rutinariamente en cirugía reconstructiva y no han sido examinados previamente en estudios con animales en el contexto de la descelularización tisular. Estos colgajos de bioingeniería ofrecen una plataforma versátil y fácilmente disponible que tiene el potencial de aplicaciones clínicas para su uso en el campo de la reparación y reconstrucción de grandes defectos de tejidos blandos.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Red Universitaria de Salud (IACUC) y se realizan de acuerdo con el protocolo y los procedimientos del Centro de Recursos Animales de la Red Universitaria de Salud y las Pautas del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. Se utilizaron cinco cerdos de Yorkshire (35-50 kg; edad aproximada 12 semanas de edad) para todos los experimentos. 1. Fabricación de biorreactores …

Representative Results

Este protocolo para descelularizar colgajos porcinos vascularizados se basa en la perfusión de un detergente de base iónica, SDS, a través de la vasculatura del colgajo en un biorreactor de perfusión personalizado. Antes de la descelularización, se adquirieron tres colgajos vascularizados en un modelo porcino y se canularon de acuerdo con sus principales vasos suministradores. Las aletas se enjuagaron inmediatamente después de la adquisición para mantener una vasculatura patentada y perfusible para permitir una de…

Discussion

El protocolo propuesto utiliza la perfusión de SDS de baja concentración para descelularizar una gama de colgajos derivados de porcinos. Con este procedimiento, el epiplón acelular, el tensor de la fascia lata y los colgajos radiales del antebrazo se pueden descelularizar con éxito utilizando un protocolo que favorece la baja concentración de SDS. Los experimentos preliminares de optimización han determinado que la SDS a una concentración baja (0,05%) entre 2 días y 5 días es capaz de eliminar material celular p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ninguno

Materials

0.2 µm pore Acrodisk Filter VWR CA28143-310
0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) Baxter JF7123
20 L Polypropylene Carboy Cole-Parmer RK-62507-20
3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie Covidien  LS639
3-way Stopcock Cole-Parmer UZ-30600-04
Adson Forceps Fine Science Tools 11027-12
Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X Wisent 450-115-EL
Atropine Sulphate 15 mg/30ml Rafter 8 Products 238481
BD Angiocath 20-Gauge VWR BD381134
BD Angiocath 22-Gauge VWR BD381123
BD Angiocath 24-Gauge VWR BD381112
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C4901 DNAse Co-factor
DNase I from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN25
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) Invitrogen P7589
DPBS, 10X Wisent 311-415-CL  without Ca++/Mg++
Halsted-Mosquito Hemostat Fine Science Tools 13008-12
Heparin, 1000 I.U./mL Leo Pharma A/S 453811
Ketamine Hydrochloride  5000 mg/50 ml Bimeda-MTC Animal Health Inc. 612316
Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing Cole-Parmer RK-96450-40 Internal Diameter:  1.85 mm
Ismatec REGLO 4-Channel Pump Cole-Parmer 78001-78
Ismatec Tubing Cassettes Cole-Parmer RK-78016-98
Isoflurane 99.9%, 250 ml Pharmaceutical Partners of Canada Inc. 2231929
LB Agar Lennox Bioshop Canada LBL406.500 Sterility testing agar plates
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506 DNAse Co-factor
Masterflex L/S 16 Tubing Cole-Parmer RK-96410-16
Midazolam 50 mg/10 ml Pharmaceutical Partners of Canada Inc. 2242905
Monopolar Cautery Pencil Valleylab E2100
Normal Buffered Formalin, 10% Sigma-Aldrich HT501128
N°11 scalpel blade Swann Morton 303
Papain from papaya latex Sigma-Aldrich P3125
Peracetic Acid Sigma-Aldrich 269336
Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID McMaster-Carr 5117K61
Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors McMaster-Carr 5117K76
Plastic Quick-Turn Tube Plugs McMaster-Carr 51525K143 Male Luer
Plastic Quick-Turn Tube Sockets McMaster-Carr 51525K293 Female Luer
Punch Biopsy Tool Integra Miltex 3332
Potassium Chloride 40 mEq/20 ml Hospira Healthcare Corporation 37869
Povidone-Iodine, 10% Rougier 833133
Serological Pipet, 2mL Fisher Science 13-678-27D
Snap Lid Airtight Containers SnapLock 142-3941-4
Sodium Dodecyl Sulfate Powder Sigma-Aldrich L4509
Surgical Metal Ligation Clips, Small Teleflex 001200
Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight B. Braun BC004R
TruWave Pressure Monitoring Set Edwards Lifesciences PX260

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Cite This Article
Xu, M. S., Karoubi, G., Waddell, T. K., Haykal, S. Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor. J. Vis. Exp. (186), e64068, doi:10.3791/64068 (2022).

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