Summary
El protocolo describe la obtención quirúrgica y la posterior descelularización de colgajos porcinos vascularizados mediante la perfusión de detergente dodecil sulfato de sodio a través de la vasculatura del colgajo en un biorreactor de perfusión personalizado.
Abstract
Los defectos de tejido blando de gran volumen conducen a déficits funcionales y pueden afectar en gran medida la calidad de vida del paciente. Aunque la reconstrucción quirúrgica se puede realizar mediante transferencia autóloga de colgajo libre o alotrasplante compuesto vascularizado (VCA), tales métodos también tienen desventajas. Problemas como la morbilidad del sitio donante y la disponibilidad de tejido limitan la transferencia autóloga de colgajo libre, mientras que la inmunosupresión es una limitación significativa de VCA. Los tejidos diseñados en cirugía reconstructiva utilizando métodos de descelularización/recelularización representan una posible solución. Los tejidos descelularizados se generan utilizando métodos que eliminan el material celular nativo al tiempo que preservan la microarquitectura de la matriz extracelular subyacente (ECM). Estos andamios acelulares pueden ser posteriormente recelularizados con células específicas del receptor.
Este protocolo detalla los métodos de adquisición y descelularización utilizados para lograr andamios acelulares en un modelo de cerdo. Además, también proporciona una descripción del diseño y la configuración del biorreactor de perfusión. Los colgajos incluyen el epiplón porcino, la fascia lata tensora y el antebrazo radial. La descelularización se realiza mediante perfusión ex vivo de detergente de dodecil sulfato de sodio (SDS) de baja concentración, seguido de un tratamiento con enzimas DNasa y esterilización con ácido peracético en un biorreactor de perfusión personalizado.
La descelularización tisular exitosa se caracteriza por una apariencia blanco-opaca de colgajos macroscópicamente. Los colgajos acelulares muestran la ausencia de núcleos en la tinción histológica y una reducción significativa en el contenido de ADN. Este protocolo se puede utilizar de manera eficiente para generar andamios de tejidos blandos descelularizados con ECM preservada y microarquitectura vascular. Tales andamios se pueden utilizar en estudios posteriores de recelularización y tienen el potencial de traducción clínica en cirugía reconstructiva.
Introduction
La lesión traumática y la extirpación del tumor pueden conducir a defectos grandes y complejos de tejidos blandos. Estos defectos pueden afectar la calidad de vida del paciente, causar pérdida de la función y provocar una discapacidad permanente. Si bien técnicas como la transferencia de colgajo de tejido autólogo se han practicado comúnmente, los problemas con la disponibilidad de colgajo y la morbilidad del sitio donante son limitaciones importantes 1,2,3. El alotrasplante compuesto vascularizado (ACV) es una alternativa prometedora que transfiere tejidos compuestos, por ejemplo, músculo, piel, vasculatura, como una sola unidad a los receptores. Sin embargo, VCA requiere inmunosupresión a largo plazo, lo que conduce a toxicidad farmacológica, infecciones oportunistas y neoplasias malignas 4,5,6.
Los andamios acelulares de ingeniería tisular son una solución potencial a estas limitaciones7. Los andamios de tejido acelular se pueden obtener utilizando métodos de descelularización, que eliminan el material celular de los tejidos nativos al tiempo que preservan la microarquitectura de la matriz extracelular subyacente (ECM). En contraste con el uso de materiales sintéticos en la ingeniería de tejidos, el uso de andamios derivados biológicamente ofrece un sustrato de ECM biomimético que permite la biocompatibilidad y el potencial para la traducción clínica8. Después de la descelularización, la posterior recelularización de andamios con células específicas del receptor puede generar tejidos funcionales, vascularizados y con poca o ninguna inmunogenicidad 9,10,11. Mediante el desarrollo de un protocolo eficaz para obtener tejidos acelulares utilizando técnicas de descelularización de perfusión, se puede diseñar una amplia gama de tipos de tejidos. A su vez, la construcción de esta técnica permite la aplicación a tejidos más complejos. Hasta la fecha, la descelularización por perfusión de tejidos blandos vascularizados se ha investigado utilizando tejidos vascularizados simples, como un colgajo fasciocutáneo de espesor total en roedores 12, porcinos13 y modelos humanos 14, así como músculo esquelético recto abdominal porcino15. Además, los tejidos vascularizados complejos también han sido descelularizados por perfusión, como se demostró en los modelos de oído porcino y humano 16,17 y en los modelos de injerto de cara completa humana18.
Aquí, el protocolo describe la descelularización de colgajos libres vascularizados utilizando andamios de ECM derivados biológicamente. Presentamos la descelularización de tres colgajos clínicamente relevantes: 1) el epiplón, 2) el tensor de la fascia lata, y 3) el antebrazo radial, todos los cuales son representativos de los colgajos de caballo de batalla utilizados rutinariamente en cirugía reconstructiva y no han sido examinados previamente en estudios con animales en el contexto de la descelularización tisular. Estos colgajos de bioingeniería ofrecen una plataforma versátil y fácilmente disponible que tiene el potencial de aplicaciones clínicas para su uso en el campo de la reparación y reconstrucción de grandes defectos de tejidos blandos.
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Protocol
Todos los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Red Universitaria de Salud (IACUC) y se realizan de acuerdo con el protocolo y los procedimientos del Centro de Recursos Animales de la Red Universitaria de Salud y las Pautas del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. Se utilizaron cinco cerdos de Yorkshire (35-50 kg; edad aproximada 12 semanas de edad) para todos los experimentos.
1. Fabricación de biorreactores de perfusión
- Ver Figura 1 para todos los componentes utilizados en el biorreactor de perfusión. Para la fabricación de la cámara de tejido, utilice contenedores de cierre a presión de polipropileno disponibles comercialmente con tapas herméticas y herméticas que contengan un forro de sello de silicona. Asegúrese de que los contenedores sean compatibles con autoclave.
- Perfore dos orificios de 1/4 a lo largo de los lados del recipiente y enhebra un segmento corto de tubo de silicona recubierto de platino L / S-16. Un tubo llevará el perfusión de entrada y el otro es para el flujo de salida.
- Para el tubo de entrada, conecte un conector Luer macho en la parte interna que se utilizará para conectarse a la cánula de tejido. Conecte un conector Luer hembra en el extremo externo del tubo de entrada que se utilizará para conectarse a una llave de paso de tres vías.
- Perfore un solo orificio de 1/4 en la tapa de la cámara y enhebra otro segmento corto de tubo de silicona recubierto de platino L / S-16. Este tubo servirá como salida de aire.
- Haga el tubo de entrada y salida midiendo aproximadamente 50 cm de tubo de silicona recubierto de platino L / S-16. Conecte un extremo a un tubo amarillo de bomba de tres paradas y el otro extremo a una pipeta serológica estéril de 2 ml para transportar perfusato desde los depósitos de detergente a la cámara del biorreactor.
- Autoclave todos los componentes (cámara y tubería) en envases estériles envueltos individualmente.
Figura 1: Fabricación del biorreactor de perfusión. El biorreactor de perfusión consiste en (A) una cámara de tejido de polipropileno plástico (B) con orificios laterales perforados para acomodar tubos de perfusión con tapa hermética al aire y al agua. (C) Las llaves de paso están unidas a la tubería para permitir la fijación de la tubería de perfusión que transporta los agentes de descelularización desde el depósito de detergente a los desechos en una sola pasada. (D) Se utilizan casetes de bomba compatibles para conectar el tubo de tres paradas a la bomba peristáltica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Preparación de soluciones de descelularización
- Preparar solución salina normal heparinizada (15 UI/ml) diluyendo 1,5 ml de solución madre de heparina 1000 UI/ml en 100 ml de solución salina normal.
- Prepare una solución de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 0,05% p/v añadiendo lentamente 9 g de polvo de SDS a 18 L de agua destilada-desionizada esterilizada en autoclave. Utilice una garrafa de polipropileno (PP) de gran volumen para acomodar la solución SDS. La solución está lista para su uso cuando está completamente disuelta. Conservar a temperatura ambiente.
- Preparar la solución de trabajo DNase I. En primer lugar, reconstituir la DNasa I liofilizada a una concentración madre de 10 mg/ml con 5 mM de CaCl 2 en dH2O estéril. Almacenar la solución madre reconstituida de DNasa I como alícuotas en un congelador de −20 °C hasta que esté lista para su uso. El día del uso, diluir la DNasa I 1:100 con Mg++(1,29 mM) y Ca++(1,98 mM) en dH2Oestéril hasta una concentración final de 0,1 mg/ml.
NOTA: La actividad de DNasa se degradará a menos que se almacene congelada. Solo se debe usar una solución de DNasa de trabajo fresca para la digestión enzimática del ADN a temperatura ambiente. - Preparar 1x solución de PBS diluyendo 10x PBS stock 1:10 con agua estéril esterilizada en autoclave en un volumen final de 5 L en una garrafa de PP. Conservar a temperatura ambiente.
- Preparar antibióticos/antimicóticos (A/A) al 1% en PBS. Diluir 100x antibióticos/antimicóticos 1:100 con solución estéril 1x PBS hasta un volumen final de 1 L. Almacenar a temperatura ambiente.
- Preparar ácido peracético (PAA) al 0,1% (v/v) de etanol (PAA)/4% (v/v) (EtOH) añadiendo 3,13 mL de PAA + 40 mL de etanol al 100 % + 956 ml de dH2O estéril. Llevar el volumen final a 1.000 ml y almacenar a temperatura ambiente.
3. Adquisición de colgajos porcinos
NOTA: Este es un procedimiento terminal. Se utilizó un cerdo para obtener las tres solapas. Sacrificar humanamente al animal después de la obtención de todos los colgajos.
- Cuidados preoperatorios
- Cerdos rápidos al menos 12 h antes de la cirugía. Sedar a los animales con ketamina (20 mg/kg intramuscular, IM), atropina (0,04 mg/kg IM) y midazolam (0,3 mg/kg IM).
- Inducir anestesia por inhalación de isoflurano al 5% a través de una máscara a un caudal de 22-44 mL/kg/min para inserción de línea periférica e intubación. Mantener la anestesia con isoflurano al 0,5%-2% a 22-44 mL/kg/min. Asegurar una profundidad adecuada de la anestesia comprobando la estabilidad hemodinámica y anotar la ausencia de reflejos palpebral/pedal de retirada o tono muscular de la mandíbula para denotar un nivel apropiado de anestésico administrado. Administrar remifentanilo intravenoso (10-20 μg/kg/h) a velocidad continua de infusión durante la cirugía para analgesia.
- Intubar al cerdo con un tubo endotraqueal apropiado (7-8 mm) y conectar el tubo a un ventilador ajustado a un volumen corriente de 8 ml/kg, PEEP de 5 cm H 2 0, FiO2de 0,5 y frecuencia respiratoria de 14.
- Inserte un catéter de angiocate de 22 G en la vena del oído. Una vez que se obtiene el acceso intravenoso (IV), infundir solución salina normal caliente al 0,9% a 5-10 ml / kg / h durante todo el procedimiento para mantener la presión arterial media entre 60 mmHg y 90 mmHg.
- Controle continuamente la frecuencia cardíaca, la oximetría de pulso y elCO2 espiratorio final. Evalúe la presión arterial y la temperatura corporal cada 5 minutos.
- Aplique ungüento para los ojos para prevenir la sequedad ocular mientras está bajo anestesia. Prepare todo el campo quirúrgico con povidona yodada. Cubra el campo quirúrgico con toallas estériles.
- Colgajo Omental
- Colocar el cerdo en posición supina y realizar una laparotomía xifo-umbilical.
- Al entrar en el abdomen, moviliza la cefalada estomacal para visualizar el epiplón mayor. Coloque cuidadosamente el epiplón en el campo operatorio e identifique los vasos gastroepiploicos que corren a lo largo de la curvatura mayor del estómago (Figura 2A).
- Comience en el aspecto izquierdo de la curvatura mayor donde la arteria gastroepiploica izquierda se une a la arteria esplénica. Usando tijeras rectas de tenotomía de Stevens, esqueletizar tanto la arteria gastroepiploica izquierda como la vena. Ligate luego dividir ambos por separado usando lazos quirúrgicos o clips.
- Proceda a lo largo de la curvatura mayor del estómago de izquierda a derecha. Ligata y divide las ramas vasculares cortas que surgen del epiplón suministrando la mayor curvatura del estómago. Tenga cuidado de no lesionar el pedículo gastroepiploico principal del epiplón durante este paso.
- Continuar la movilización del epiplón mayor hasta que se encuentre la unión de los vasos gastroepiploicos derechos y la arteria gastroduodenal. Con clips o ataduras, ligar luego dividir la arteria gastroepiploica derecha y las venas por separado para liberar el colgajo omental.
- Una vez liberado, el epiplón se puede dividir a lo largo del medio en dos mitades, con cada mitad acompañada por una arteria y vena gastro-epiploica respectiva. Esto permite la obtención de dos colgajos libres de omental de una operación animal. Individualmente cannule los vasos gastro-epiploicos con una cánula 20-22 G y luego asegure con lazos de seda 3-0.
- Enjuague la solución salina heparinizada (15 UI/ml) en la cánula arterial gastroepiploica hasta que se observe un flujo venoso claro.
- Colgajo tensor de fascia lata
NOTA: El protocolo se basa en una descripción previa del colgajo de tensor porcino fascia lata por Haughey et al.19. La modificación se realiza para aislar solo la porción fascial del colgajo tensor de la fascia lata.- Coloque el cerdo en la posición de decúbito lateral y afeite toda la extremidad posterior superior bilateralmente. Prepare y cubra utilizando los procedimientos estériles habituales.
- Marque el límite anterior del colgajo con una línea que se extiende desde la espina ilíaca superior anterior (ASIS) hacia la rótula lateral. La ubicación del pedículo es aproximadamente 6-8 cm del ASIS a lo largo de esta línea.
- Marque una línea posterior paralela aproximadamente de 8 cm a 10 cm desde la incisión anterior a lo largo del eje del fémur para incluir el ancho del colgajo. Marque el borde distal del colgajo en la rótula lateral.
- Comience la disección en el margen distal en la rótula con una incisión aguda de la piel con un bisturí. Profundice la incisión de la piel con cauterio a través del tejido subcutáneo hasta que se encuentre la fascia que recubre el recto femoral.
- Continúe las incisiones cutáneas hacia el ASIS a lo largo de los límites anteriores y posteriores marcados descritos anteriormente. Para aislar solo el colgajo fascial, retire el componente de la piel suprayacente de la capa fascial subyacente. Ligate o cauterizar cualquier pequeño vaso perforante a la piel.
- Regrese al borde distal del colgajo e incise la fascia profunda para permitir la movilización del músculo vasto lateral subyacente. Movilizar la fascia hacia el ASIS.
- Durante la movilización, identificar el pedículo vascular que emerge entre los músculos vasto lateral y recto femoral (Figura 2B). Tenga cuidado de evitar la tracción excesiva para no lesionar los vasos pediculares.
- Diseccionar el aspecto proximal del ASIS mientras protege el pedículo vascular. Diseccionar hasta que el colgajo esté suficientemente movilizado alrededor de su pedículo.
- Traza el pedículo hacia los vasos femorales profundos. Esqueletizar tanto la arteria femoral circunfleja lateral como la vena que suministra el colgajo fascial. Ligate luego divide ambos vasos proximalmente donde se unen a los vasos femorales profundos.
- Canular los vasos pediculares individualmente con angiocatéteres de 20 G a 24 G, asegurados con lazos de seda 3-0. Enjuague la solución salina heparinizada (15 UI/ml) en la cánula arterial del colgajo hasta que se observe una salida venosa clara.
- Colgajo radial del antebrazo
NOTA: El siguiente protocolo se basa en una descripción publicada del modelo de colgajo radial de antebrazo porcino por Khachatryan et al.20.- Coloque el cerdo en la mesa de operaciones en la posición de decúbito lateral. Coloque la extremidad anterior dependiente dentro del campo operatorio.
- Marque un cuadrado de colgajo de piel de aproximadamente 3 cm x 3 cm en el antebrazo radial. Dibuje una línea entre el punto medio del margen del colgajo proximal y la fosa antecubital para denotar el curso aproximado del pedículo de la arteria radial. Confirmar el curso arterial con palpación.
NOTA: En el modelo porcino, los vasos radiales están ubicados relativamente más profundos que en los humanos. Su ubicación es entre el flexor radial del carpo y el braquiorradial. - Incide la piel con un bisturí en la cara distal con una profundidad hasta la fascia antebraquial. Disección contundente con tijeras de tenotomía hasta encontrar la arteria radial distal y sus dos venas comitantes. Ligate la arteria y las venas con lazos quirúrgicos individualmente y dividir.
- Continúe las incisiones cutáneas en los márgenes radial y cubital del cuadrado marcado de la piel. Movilice el colgajo del hueso radial subyacente con una cuchilla quirúrgica que proceda de una dirección radial a cubital mientras también eleva el colgajo de piel proximalmente hacia la fosa antecubital.
NOTA: Mantenga un plano de disección subfascial para asegurarse de que el pedículo de la arteria radial permanezca asociado con la capa cutánea suprayacente. - En el margen proximal, retraiga el espacio entre el braquiorradial y el flexor radial del carpo con un retractor autoretenedor para exponer la arteria radial proximal y sus venas comitantes (Figura 2C).
- Usando tijeras de tenotomía, esqueletizar la arteria radial y las venas comitantes proximalmente en la fosa antecubital donde se unen a la arteria braquial y las venas, respectivamente. Diseccionar los vasos de los tejidos fibrograsos circundantes para lograr una longitud pedicular suficiente de aproximadamente 5-6 cm. Ligate y divide la arteria y las venas por separado para liberar el colgajo radial del antebrazo.
- Canular los vasos pediculares con angiocatéteres de 20 G a 24 G, asegurados con lazos de seda 3-0. Enjuague la solución salina heparinizada (15 UI/ml) en la cánula arterial del colgajo hasta que se observe una salida venosa clara.
- Después de la obtención del colgajo, mantener los colgajos en solución salina fría a 4 °C hasta que estén listos para la descelularización. Bajo anestesia profunda con isoflurano, sacrificar a los animales con una inyección intravenosa de cloruro de potasio (100 mg/kg IV). Confirmar la muerte por la ausencia de signos vitales.
Figura 2: Obtención de tres colgajos vascularizados porcinos . (A) Epiplón. Las arterias gastroepiploicas derecha (i) e izquierda (ii) están canuladas en el colgajo omental (iii). (B) Fascia tensorial lata. El pedículo del colgajo (iv) es la rama ascendente de la arteria circunfleja femoral lateral (v). (C) Colgajo radial del antebrazo. La obtención del colgajo radial del antebrazo (vi) se basa en la arteria radial y la vena comitantes (vii) como el pedículo vascular (NOTA: se omitieron las cortinas con fines de demostración). Barras de escala: 3 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Configuración del sistema de descelularización
- Ensamble la cámara de tejido con colgajos en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad de flujo laminar.
- Conecte una llave de paso de tres vías a los puertos de entrada y salida del biorreactor. Conecte un filtro de 0,2 μm al puerto de ventilación de la tapa de la cámara de tejido. Prepare el tubo de entrada con solución salina heparinizada estéril para eliminar las burbujas de aire.
- Coloque las solapas en la cámara. Usando hemostáticos estériles, conecte las aletas al tubo de entrada utilizando el conector Luer macho. Atornille la cánula arterial respectiva de cada colgajo en el Luer macho y asegúrese de un sellado hermético.
- Enjuague la solución salina heparinizada a través de la llave de paso para verificar que la conexión Luer no tenga fugas y que las aletas se puedan perfundir con evidencia de flujo venoso. Cierre la tapa de la cámara de tejido.
- Conecte el tubo de entrada con un tubo de bomba amarillo de tres paradas a la llave de paso de entrada de la cámara de tejido. Además, conecte un transductor de sensor de presión en línea a la llave de paso de tres vías de entrada para permitir el monitoreo de la presión de perfusión.
- Encienda la bomba peristáltica de entrada. En la pantalla inicial, vaya a la tercera pestaña con la tecla de flecha para ajustar el ID del tubo a 1,85 mm. A continuación, continúe con la segunda pestaña para establecer la velocidad de perfusión. Velocidad de entrada como modo de entrega y ajustada a 2 mL/min. Asegúrese de que la dirección del flujo sea correcta como se muestra en la pantalla. Cargue el tubo de la bomba de tres topes en la bomba peristáltica con un cassette compatible.
- Repita el procedimiento para la bomba peristáltica de salida similar al anterior. Ajuste el ajuste de la bomba de salida a una velocidad de 4 ml/min. Conecte el tubo de salida con un tubo amarillo de bomba de tres paradas a la llave de paso de salida de la cámara de tejido. Cargue el tubo de la bomba de tres topes en la bomba peristáltica con un cassette compatible. Inicie el flujo para ambas bombas presionando el botón de encendido .
NOTA: La mayor velocidad de la bomba de salida es una medida de seguridad crucial para evitar el desbordamiento de la cámara de tejido, asegurando que el flujo de salida de la cámara siempre exceda el flujo de entrada durante el curso de la descelularización. Toda la configuración de descelularización ensamblada se representa en la Figura 3.
Figura 3: Sistema de descelularización de perfusión ensamblado. (A) Esquema del sistema de descelularización de perfusión. El tubo de entrada transporta perfusato desde el depósito de detergente a la cámara de tejido de una sola pasada con monitoreo del sensor de presión. El tubo de salida elimina el perfusión activamente de la cámara de tejido en el contenedor de residuos. Las flechas negras denotan la dirección del flujo de perfusión. Se utiliza una bomba peristáltica con la bomba izquierda para controlar el flujo de entrada. El flujo de salida se elimina activamente utilizando una segunda bomba peristáltica a través del tubo respectivo. Figura creada con BioRender.com. (B) Fotografía del sistema de descelularización de perfusión montado en la mesa de trabajo con la bomba peristáltica de entrada (i) conectada a las cámaras de tejido (ii) y luego la bomba peristáltica de salida (iii). La presión de perfusión de entrada se controla con un sensor de presión en línea (iv) antes de ingresar a la cámara de tejido. Aquí, tres aletas se descelularizan en paralelo. Tanto el detergente como los depósitos de residuos están debajo de la mesa de trabajo y no están fotografiados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. Descelularización de colgajos porcinos
- Lleve a cabo todos los pasos siguientes para la descelularización por perfusión a temperatura ambiente. Para un resumen de las tasas y duraciones de perfusión, véase la Tabla 1. Comience la perfusión de solución salina heparinizada a 2 ml / min usando una bomba peristáltica y perfunda los colgajos con solución salina heparinizada en la cámara del tejido durante 15 minutos para eliminar cualquier coágulo de sangre retenido.
- Al finalizar la perfusión salina heparinizada, aspire la solución salina residual en la cámara del tejido. Llene la cámara de tejido con aproximadamente 500 ml de solución de descelularización SDS para sumergir suficientemente el colgajo.
- Transfiera el tubo de entrada a la solución de descelularización SDS y perfunda el tejido a 2 ml / min. La duración de la perfusión varía dependiendo del colgajo; perfundir SDS durante 2 días para el epiplón, 3 días para la fascia tensorial y 5 días para el colgajo fascio-cutáneo radial del antebrazo.
- Al finalizar la descelularización de SDS, aspire el perfusión de SDS existente contenido dentro de la cámara de tejido. Transfiera el tubo de entrada a 1x solución de PBS y perfunda las aletas durante 1 día a 2 ml / min.
- Retire la solución PBS anterior y transfiera el tubo de entrada a la solución de trabajo DNasa. Perfundir durante 2 h a 2 mL/min. Retire la solución de DNasa de la cámara de tejido y coloque el tubo de entrada en 1x solución de PBS. Sumergir los tejidos con 1x solución de PBS en la cámara y perfundir 1x solución de PBS durante 1 día a 2 mL/min.
- Esterilizar los colgajos con solución PAA/EtOH. Transfiera el tubo de entrada a PAA/EtOH en solución dedH2Oy sumerja los tejidos en la misma solución. Perfundir PAA/EtOH a 2 mL/min durante 3 h. Una vez que se complete la esterilización PAA/EtOH, desconecte el tubo de las llaves de paso de tres vías.
- Retire los colgajos utilizando una técnica aséptica y coloque los instrumentos estériles en PBS que contengan 1% de antibióticos/antimicóticos (A/A). Sumerja las aletas con PBS + 1% A/A durante 15 minutos en dos lavados separados para neutralizar completamente el ácido residual. Mantener los colgajos en PBS + 1% A/A a 4 °C hasta que estén listos para la recelularización.
- Verifique la esterilidad de los andamios realizando un cultivo de hisopo en placas de agar y examine el crecimiento microbiano. Inocular las placas de agar con hisopos tomados de cada superficie del colgajo. Cultivar las placas de agar a 37 °C durante un máximo de 2 semanas. La esterilidad se demuestra por la ausencia de crecimiento de colonias microbianas.
Tabla 1: Resumen de los parámetros del protocolo de perfusión-descelularización. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
6. Evaluación de la descelularización
- Usando una biopsia por punción, obtenga muestras de 3 mm a 10 mm de espesor de los colgajos.
- Para histología, fijar biopsias en casetes histológicos en formalina tamponada normal durante 24 h a temperatura ambiente.
- Lave los casetes de biopsia en agua o PBS durante 15 minutos y luego colóquelos en etanol al 70% hasta que estén listos para el procesamiento de tejidos. Procese los casetes en un procesador de tejidos de acuerdo con los protocolos estándar.
- Incruste las biopsias en parafina, permitiendo que la cera se solidifique durante 10-15 minutos en una placa fría. Sección de bloques de parafina en un micrótomo de hasta 5 μm de espesor. Manche los portaobjetos con hematoxilina y eosina (H&E) de acuerdo con los protocolos estándar. Imagen de los portaobjetos de tejido con microscopía óptica.
- Para la cuantificación del contenido de ADN, obtener el peso seco de las biopsias de tejido después del secado nocturno del tejido en un horno a 60 °C. Digerir las muestras en un tampón de extracción de papaína a 65 °C durante la noche. Centrifugar las muestras digeridas a 10.000 x g y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo. Evalúe el contenido de ADN con un kit de extracción de ADN comercial según las instrucciones del fabricante.
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Representative Results
Este protocolo para descelularizar colgajos porcinos vascularizados se basa en la perfusión de un detergente de base iónica, SDS, a través de la vasculatura del colgajo en un biorreactor de perfusión personalizado. Antes de la descelularización, se adquirieron tres colgajos vascularizados en un modelo porcino y se canularon de acuerdo con sus principales vasos suministradores. Las aletas se enjuagaron inmediatamente después de la adquisición para mantener una vasculatura patentada y perfusible para permitir una descelularización exitosa. Utilizando contenedores herméticos con tapa a presión, se diseñó un biorreactor personalizado para permitir la perfusión del colgajo dentro de un entorno cerrado. La perfusión de los colgajos dentro del biorreactor se logró de una sola pasada utilizando dos bombas peristálticas conectadas a la cámara de tejido. La presión de perfusión se monitorizó con un sensor de presión en línea.
Durante la descelularización, la duración de la exposición a SDS dependió del tipo de tejido que se procesaba. Con la técnica de descelularización de perfusión descrita, los colgajos de epiplón, fascia tensorial y antebrazo radial fueron descelularizados con SDS al 0,05% durante 2 días, 3 días y 5 días, respectivamente. La esterilización exitosa después de la descelularización se demostró por la ausencia de crecimiento de colonias microbianas después de frotar los colgajos y cultivar los hisopos en placas de agar durante 14 días. Las presiones de perfusión se monitorizaron a un caudal de 2 mL/min y oscilaron entre 20-60 mmHg durante todas las etapas de descelularización para los tres colgajos. Al concluir la descelularización, los colgajos se enjuagaron bajo control manual y demostraron evidencia de salida de una cánula venosa dejada al drenaje libre (Video Suplementario 1, Video Suplementario 2, Video Suplementario 3).
Un total de 15 colgajos fueron descelularizados, con cinco réplicas para cada uno de los tres tipos de tejido. En el examen, la morfología macroscópica de los tejidos nativos apareció de color rosado (Figura 4A, E, I), mientras que los tejidos descelularizados eran característicamente blancos/opacos en apariencia (Figura 4C, G, K). El examen histológico de los tejidos nativos con H&E muestra la presencia de núcleos azules (Figura 4B, F, J). En colgajos descelularizados, la tinción de H&E mostró una pérdida de material celular con la ausencia de tinción nuclear azul (Figura 4D, H, L), lo que indica un andamio de tejido acelular. La cuantificación adicional del contenido de ADN en las cinco réplicas mostró una disminución estadísticamente significativa en el ADN en los andamios acelulares en comparación con los tejidos nativos mediante una prueba t de Student para cada colgajo (Figura 5). En el epiplón, el ADN disminuyó de 460 ng/mg ± 124 ng/mg de tejido seco en el colgajo nativo a 25,8 ng/mg ± 5,90 ng/mg de tejido seco en el colgajo descelularizado (n = 5, p < 0,05). En el tensor de la fascia lata, el ADN disminuyó de 297 ng/mg ± 68,2 ng/mg a 58,3 ng/mg ± 13,5 ng/mg entre colgajos nativos y descelularizados, respectivamente (n = 5, p < 0,05). El colgajo radial del antebrazo mostró una disminución del ADN de 1180 ng/mg ± 241 ng/mg en el colgajo nativo a 162 ng/mg ± 34,9 ng/mg en el colgajo descelularizado (n = 5, p < 0,05).
Figura 4: Descelularización de tres colgajos porcinos. El examen macroscópico del epiplón nativo (A), (E) la fascia lata tensoria y (I) los colgajos radiales del antebrazo demuestran la apariencia rosada de los colgajos inmediatamente después de la obtención. La tinción histológica de los tejidos nativos demuestra una clara tinción hematoxilina de los núcleos celulares con H&E (B, F, J). Después de la descelularización, el (C) epiplón, (G) tensor de la fascia lata y (K) antebrazo radial aparecen groseramente blancos y opacos. Histológicamente, los tres colgajos descelularizados muestran una ausencia de tinción nuclear con H&E (D,H,L). Barras de escala: 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Cuantificación del contenido de ADN en andamios acelulares. Los valores se normalizan a mg de masa seca de andamio. Las muestras de tejido fresco de tejidos nativos, no descelularizados (n = 5) y tejidos descelularizados (n = 5) se secaron y pesaron antes de la digestión nocturna en papaína antes de la cuantificación. Las pruebas estadísticas utilizaron las pruebas t de Student con un nivel de significancia (**) definido como un valor de p < 0,05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1. Examen cronológico de la progresión de la perfusión-descelularización del epiplón utilizando dodecil sulfato de sodio al 0,05% durante 5 días mediante examen macroscópico (barras de escala = 3 cm) e histología H&E (barras de escala = 200 μm). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2. Examen cronológico de la progresión de la perfusión-descelularización de la fascia lata tensorial utilizando dodecil sulfato de sodio al 0,05% durante 5 días mediante examen macroscópico (barras de escala = 3 cm) e histología H&E (barras de escala = 200 μm). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 3. Examen cronológico de la progresión de la perfusión-descelularización del colgajo radial del antebrazo utilizando dodecil sulfato de sodio al 0,05% durante 5 días mediante examen macroscópico (barras de escala = 3 cm) e histología H&E (barras de escala = 200 μm). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Video complementario 1. Perfusión manual representativa del colgajo de epiplón descelularizado a través de la cánula arterial (rosa) que demuestra el flujo de salida de la cánula venosa de drenaje libre (amarillo). Haga clic aquí para descargar este video.
Video complementario 2. Perfusión manual representativa del colgajo tensor descelularizado de la fascia lata a través de la cánula arterial (rosa) que demuestra el flujo de salida de la cánula venosa de drenaje libre (azul). Haga clic aquí para descargar este video.
Video complementario 3. Perfusión manual representativa del colgajo radial descelularizado del antebrazo a través de la cánula arterial (azul) que demuestra el flujo de salida de la cánula venosa de drenaje libre (amarillo). Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
El protocolo propuesto utiliza la perfusión de SDS de baja concentración para descelularizar una gama de colgajos derivados de porcinos. Con este procedimiento, el epiplón acelular, el tensor de la fascia lata y los colgajos radiales del antebrazo se pueden descelularizar con éxito utilizando un protocolo que favorece la baja concentración de SDS. Los experimentos preliminares de optimización han determinado que la SDS a una concentración baja (0,05%) entre 2 días y 5 días es capaz de eliminar material celular para el epiplón, el tensor de la fascia lata y el colgajo radial del antebrazo cuando se analiza con técnicas histológicas (Figura suplementaria 1, Figura complementaria 2, Figura complementaria 3). Este método ofrece un enfoque directo que logra la descelularización en un corto período de tiempo y a un costo razonable. En nuestra experiencia, la descelularización y esterilización de colgajos porcinos toma entre 2-5 días, con una descelularización de mayor duración necesaria para tejidos con mayor densidad (por ejemplo, piel del antebrazo a los 5 días vs. epiplón a los 2 días). Además, la baja concentración de SDS utilizada en este protocolo se seleccionó en base a la justificación de que una baja concentración de SDS al 0,05% cae por debajo de la concentración micelar crítica de SDS (aproximadamente al 0,2%21) y, por lo tanto, permite que el surfactante sosolubilice eficazmente las membranas celulares dejando intactos importantes componentes bioactivos de la ECM. El uso de SDS de baja concentración en este protocolo contrasta con el uso de concentraciones relativamente más altas de SDS (por ejemplo, 1%) para la perfusión-descelularización de colgajos fascio-cutáneos vascularizados, según lo informado por autores anteriores13,22. Las altas concentraciones de SDS, aunque efectivas en la descelularización, tienen el costo de incurrir en efectos perjudiciales sobre el andamio de la ECM, como GAG y el agotamiento del factor de crecimiento, así como la desnaturalización de proteínas como el colágeno y la vimentina23,24. De hecho, el trabajo futuro en la perfusión-descelularización de colgajos vascularizados porcinos se beneficiará de estudios de caracterización adicionales para examinar los efectos del agente de descelularización en la ECM a nivel estructural y molecular y sus implicaciones para la recelularización aguas abajo25,26,27 . Los ensayos para componentes de ECM como colágeno, elastina o contenido de GAG se pueden usar para evaluar cuantitativamente los cambios en la ECM después de la descelularización. Además, las pruebas de resistencia mecánica son una modalidad útil para estudiar los cambios en las propiedades biomecánicas después de la descelularización. Finalmente, la evaluación de la vascularidad mediante técnicas como la angiografía o la microTC también ayudará a caracterizar la arquitectura vascular a nivel sistémico como requisito para generar colgajos vascularizados perfusibles28.
Se deben tener en cuenta varias consideraciones técnicas con este protocolo. En primer lugar, se debe tener mucho cuidado durante la manipulación del colgajo y el montaje del biorreactor para evitar la decanulación accidental, ya que la anulación en un entorno ex vivo es comparativamente más difícil. En segundo lugar, durante la adquisición de colgajos, obtener un colgajo intacto con un pedículo vascular perfusible e intacto es fundamental para una descelularización exitosa. Se debe tener cuidado durante la adquisición para garantizar que los puntos de fuga distales en el andamio estén recortados o atados a mano. Esto ayudará a reducir las fugas, que pueden causar una perfusión incompleta de soluciones a través de la vasculatura del colgajo. Un período inicial de perfusión con solución salina heparinizada después de la obtención evita la retención de coágulos sanguíneos y verifica una vasculatura perfusible como lo demuestra la salida de perfusión venosa. Los tejidos descelularizados también se pueden enjuagar nuevamente al finalizar la descelularización para verificar cualquier posible obstrucción intravascular (por ejemplo, de desechos celulares / émbolos aéreos) que puedan impedir la perfusibilidad del colgajo. En nuestra experiencia, los colgajos descelularizados no mostraron resistencia intravascular al lavado de la jeringa siguiendo este protocolo, mientras que el flujo venoso se pudo observar nuevamente desde el colgajo descelularizado después del lavado (Video Suplementario 1, Video Suplementario 2, Video Suplementario 3). Esto fue indicativo de un asa arterial permeable a vascular venosa con capilares de conexión que pueden perfundirse.
Otra consideración se hace con respecto a los parámetros de perfusión durante la descelularización. En este protocolo, se seleccionó una perfusión de caudal constante con un caudal objetivo de 2 mL/min, que estaba dentro del rango de los caudales operativos utilizados en estudios de descelularización de tejidos de colgajo porcinopublicados anteriormente 13,29. Además, nuestro sistema de descelularización incorpora una capacidad de monitoreo de presión en línea en tiempo real para monitorear posibles fluctuaciones en la resistencia intravascular en el transcurso de la perfusión; este método puede ayudar a evitar altas presiones de perfusión derivadas de una posible oclusión intravascular que pueden dañar la MEC microvascular.
Finalmente, la esterilización del andamio resultante es otra consideración técnica importante. Incorporamos una fase de esterilización como el último paso del protocolo de descelularización para abordar la contaminación ambiental incidental que puede ocurrir durante la descelularización. La esterilidad del colgajo es especialmente importante para que los colgajos puedan usarse en el futuro para la recelularización. La perfusión de 0,1% de ácido peracético/4% de EtOH como esterilizante ha sido previamente reportada por grupos para esterilizar andamios acelulares30,31 y también se encontró que era efectiva con este protocolo. La esterilidad se verificó examinando los cultivos de hisopos con colgajo en placas de agar y observando la ausencia de crecimiento después de 14 días de incubación.
El biorreactor de perfusión personalizado diseñado para los experimentos es relativamente rentable, así como simple y rápido de montar. Además, todos los componentes de este biorreactor de perfusión son esterilizables en autoclave y adaptables para trabajos de recelularización, manteniendo la esterilidad de los colgajos. El circuito de biorreactor personalizado se puede modificar fácilmente para permitir la perfusión de circuito abierto que puede hacer circular los medios de cultivo celular a través de un andamio recelularizado después de los experimentos de siembra celular. Sin embargo, vale la pena mencionar algunas limitaciones del sistema de biorreactores. En primer lugar, el uso de dos bombas comerciales, aunque es necesario para evitar el desbordamiento inadvertido del sistema, especialmente cuando se utilizan grandes volúmenes de perfusión, resta valor al bajo costo de la configuración de perfusión. Además, el bajo rendimiento del sistema actual de biorreactor de perfusión puede presentar desafíos logísticos cuando se necesita ejecutar numerosas réplicas experimentales en paralelo; Los sistemas de rendimiento comparativamente más alto desarrollados para la descelularización renal porcina32 pueden algún día adaptarse para la descelularización del colgajo porcino con el fin de aliviar estos desafíos logísticos. Finalmente, aunque el biorreactor desarrollado es fácil de configurar, la supervisión humana y la operación manual siguen siendo necesarias con regularidad y frecuencia para garantizar que no se produzca un mal funcionamiento del sistema. Las modificaciones al biorreactor que incorporan capacidades de automatización que pueden monitorear y reajustar el rendimiento del biorreactor con una intervención humana mínima o nula pueden llevarse a cabo para avanzar en la tecnología de biorreactor de perfusión-descelularización en el futuro33,34.
La principal aplicación de los colgajos descelularizados es permitir la posterior recelularización de estos andamios acelulares con poblaciones celulares que pueden regenerar la vasculatura. Si bien se requiere mucha investigación futura para determinar el número apropiado de células, poblaciones, estrategias de siembra y condiciones de biorreactores para regenerar tejido vascularizado funcional y viable, este protocolo representa el trabajo fundamental inicial hacia este objetivo. Los métodos futuros de recelularización ayudarán a establecer estrategias para diseñar colgajos de tejidos blandos con una red vascular perfusible intacta y contribuirán a regenerar potencialmente tejidos compuestos más complejos, como los aloinjertos faciales y de extremidades. Estos andamios pueden algún día eludir la morbilidad y la inmunosupresión del sitio donante para los pacientes sometidos a reconstrucción de tejidos blandos a gran escala, mejorando así sus resultados clínicos y la calidad de vida.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Ninguno
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
| 0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
| 20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
| 3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
| 3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
| Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
| BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
| BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
| BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
| Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
| Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
| Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
| Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
| Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
| Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
| Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
| Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
| Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
| Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
| Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
| Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
| TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |
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