Summary
Protokollen beskriver kirurgisk anskaffelse og påfølgende decellularisering av vaskulariserte svineklaffer ved perfusjon av natriumdodecylsulfatvaskemiddel gjennom klaffvaskulaturen i en tilpasset perfusjonsbioreaktor.
Abstract
Store volum bløtvevsdefekter fører til funksjonelle underskudd og kan i stor grad påvirke pasientens livskvalitet. Selv om kirurgisk rekonstruksjon kan utføres ved hjelp av autolog fri klaffoverføring eller vaskularisert komposittallotransplantasjon (VCA), har slike metoder også ulemper. Problemer som morbiditet på donorstedet og vevstilgjengelighet begrenser autolog fri klaffoverføring, mens immunsuppresjon er en betydelig begrensning av VCA. Konstruert vev i rekonstruktiv kirurgi ved hjelp av decellularisering / recellulariseringsmetoder representerer en mulig løsning. Decellulariserte vev genereres ved hjelp av metoder som fjerner innfødt cellulært materiale samtidig som den underliggende ekstracellulære matrisen (ECM) mikroarkitekturen opprettholdes. Disse acellulære stillasene kan deretter recellulariseres med mottakerspesifikke celler.
Denne protokollen beskriver anskaffelses- og decellulariseringsmetodene som brukes til å oppnå acellulære stillaser i en grismodell. I tillegg gir den også en beskrivelse av perfusjonsbioreaktorens design og oppsett. Klaffene inkluderer porcine omentum, tensor fascia lata og den radiale underarmen. Decellularisering utføres via ex vivo perfusjon av lavkonsentrasjon natriumdodecylsulfat (SDS) vaskemiddel etterfulgt av DNase enzymbehandling og pereddiksyresterilisering i en tilpasset perfusjonsbioreaktor.
Vellykket vevsdecellularisering er preget av et hvitt ugjennomsiktig utseende av klaffer makroskopisk. Acellulære klaffer viser fravær av kjerner på histologisk farging og en signifikant reduksjon i DNA-innhold. Denne protokollen kan brukes effektivt til å generere decellulære bløtvevsstillas med bevart ECM og vaskulær mikroarkitektur. Slike stillaser kan brukes i senere recellulariseringsstudier og har potensial for klinisk oversettelse i rekonstruktiv kirurgi.
Introduction
Traumatisk skade og fjerning av svulster kan føre til store og komplekse bløtvevsdefekter. Disse feilene kan svekke pasientens livskvalitet, føre til tap av funksjon, og resultere i permanent uførhet. Mens teknikker som autolog vevsklaffoverføring har blitt praktisert, er problemer med klafftilgjengelighet og morbiditet på donorstedet store begrensninger 1,2,3. Vascularized composite allotransplantation (VCA) er et lovende alternativ som overfører komposittvev, for eksempel muskel, hud, vaskulatur, som en enkelt enhet til mottakere. VCA krever imidlertid langvarig immunsuppresjon, noe som fører til legemiddeltoksisitet, opportunistiske infeksjoner og maligniteter 4,5,6.
Vevskonstruerte acellulære stillaser er en potensiell løsning på disse begrensningene7. Acellulære vevsstillas kan oppnås ved hjelp av decellulariseringsmetoder, som fjerner cellulært materiale fra innfødte vev samtidig som den underliggende ekstracellulære matrisen (ECM) mikroarkitekturen bevares. I motsetning til bruken av syntetiske materialer i vevsteknikk, tilbyr bruken av biologisk avledede stillaser et biomimetisk ECM-substrat som tillater biokompatibilitet og potensialet for klinisk oversettelse8. Etter decellularisering kan den påfølgende recellulariseringen av stillaser med mottakerspesifikke celler generere funksjonelle, vaskulariserte vev med liten eller ingen immunogenisitet 9,10,11. Ved å utvikle en effektiv protokoll for å oppnå acellulært vev ved hjelp av perfusjonsdecellulariseringsteknikker, kan et bredt spekter av vevstyper konstrueres. I sin tur tillater å bygge på denne teknikken applikasjonen til mer komplekse vev. Hittil har perfusjonsdecellularisering av vaskularisert bløtvev blitt undersøkt ved hjelp av enkle vaskulariserte vev som en full tykkelse fasciokutan klaff i gnager 12, svin 13 og menneskelige modeller14, samt porcine rectus abdominis skjelettmuskulatur15. I tillegg har komplekse vaskulariserte vev også blitt perfusjonsdecellularisert som vist i svin og humant øre 16,17 modeller og humane full-face graft modeller18.
Her beskriver protokollen decellularisering av vaskulariserte frie klaffer ved bruk av biologisk avledede ECM-stillaser. Vi presenterer decellularisering av tre klinisk relevante klaffer: 1) omentum, 2) tensor fascia lata og 3) radial underarm, som alle er representative for arbeidshestklaffer som brukes rutinemessig i rekonstruktiv kirurgi og ikke tidligere er undersøkt i dyreforsøk i sammenheng med vevsdecellularisering. Disse bioengineerte klaffene tilbyr en allsidig og lett tilgjengelig plattform som har potensial for kliniske anvendelser for bruk innen reparasjon og rekonstruksjon av store bløtvevsdefekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyrefag er godkjent av University Health Network Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og utføres i samsvar med University Health Network Animal Resource Centre protokoll og prosedyrer og Canadian Council on Animal Care Guidelines. Fem Yorkshire griser (35-50 kg; alder ca 12 uker gammel) ble brukt til alle eksperimenter.
1. Perfusjon bioreaktor fabrikasjon
- Se figur 1 for alle komponentene som brukes i perfusjonsbioreaktoren. For fremstilling av vevskammeret, bruk kommersielt tilgjengelige polypropylen snap-lock beholdere med vanntette og lufttette lokk som inneholder en silikonforsegling. Forsikre deg om at beholderne er autoklavkompatible.
- Bor to 1/4 hull langs sidene av beholderen og trer et kort segment av L/S-16 platinabelagt silikonrør. En slange vil bære innstrømningsperfusatet og den andre er for utstrømningen.
- For innstrømningsslangen festes en mannlig Luer-kontakt på den indre delen som skal brukes til å koble til vevskanylen. Fest en kvinnelig Luer-kontakt i den ytre enden av innstrømningsslangen som skal brukes til å koble til en treveis stoppekran.
- Bor et enkelt 1/4 hull på kammerlokket og tre et annet kort segment av L/S-16 platinabelagt silikonrør. Denne slangen vil tjene som luftventilen.
- Lag inn- og utstrømningsslangen ved å måle ca. 50 cm L/S-16 platinabelagt silikonrør. Koble den ene enden til et gult tre-trinns pumperør og den andre enden til en steril 2 ml serologisk pipette for å bære perfusat fra vaskemiddelreservoarene inn i bioreaktorkammeret.
- Autoklav alle komponenter (kammer og rør) i individuelt innpakket steril emballasje.
Figur 1: Fremstilling av perfusjonsbioreaktoren. Perfusjonsbioreaktoren består av (A) et plastisk polypropylenvevskammer (B) med sidehull boret for å imøtekomme perfusjonsrør med luft- og vanntett lokk. (C) Stoppekraner er festet til slanger for å tillate festing av perfusjonsslangen som bærer decellulariseringsmidler fra vaskemiddelbeholderen til avfall i enkeltpass. (D) Kompatible pumpekassetter brukes til å koble tre-stopp-slangen til den peristaltiske pumpen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Fremstilling av decellulariseringsløsninger
- Klargjør heparinisert normal saltoppløsning (15 IE / ml) ved å fortynne 1,5 ml 1000 IE / ml heparinoppløsning i 100 ml normal saltvann.
- Forbered 0,05% w / v natriumdodecylsulfat (SDS) løsning ved sakte å tilsette 9 g SDS-pulver til 18 L autoklaveret destillert deionisert vann. Bruk en stor volum polypropylen (PP) carboy for å imøtekomme SDS-løsningen. Løsningen er klar til bruk når den er helt oppløst. Oppbevares ved romtemperatur.
- Forbered DNase I arbeidsløsning. Rekonstituer først lyofilisert DNase I til en stamkonsentrasjon på 10 mg/ml med 5 mM CaCl 2 i steril dH2O. Oppbevar den rekonstituerte DNase I-oppløsningen som aliquots i en -20 °C fryser til den er klar til bruk. På bruksdagen, fortynn DNase I lager 1:100 med Mg ++ (1,29 mM) og Ca ++ (1,98 mM) i steril dH2O til en endelig konsentrasjon på 0,1 mg / ml.
MERK: DNase-aktiviteten vil nedbrytes med mindre den lagres frosset. Bare fersk fungerende DNase-løsning skal brukes til enzymatisk fordøyelse av DNA ved romtemperatur. - Klargjør 1x PBS oppløsning ved å fortynne 10x PBS lager 1:10 med sterilt autoklavert vann i et 5 L siste volum i en PP carboy. Oppbevares ved romtemperatur.
- Forbered 1% antibiotika / antimykotika (A / A) i PBS. Fortynn 100x antibiotika/antimykotika 1:100 med steril 1x PBS oppløsning til et endelig volum på 1 l. Oppbevares ved romtemperatur.
- Forbered 0,1% (v / v) pereddiksyre (PAA) / 4% (v / v) etanol (EtOH) ved å tilsette 3,13 ml PAA + 40 ml 100% etanol + 956 ml steril dH2O. Ta det endelige volumet til 1000 ml og oppbevar ved romtemperatur.
3. Innkjøp av svineklaffer
MERK: Dette er en terminal prosedyre. En gris ble brukt til å skaffe alle tre klaffene. Avlive dyret humant etter anskaffelse av alle klaffer.
- Preoperativ omsorg
- Raske griser minst 12 timer før operasjonen. Bedøve dyrene med ketamin (20 mg/kg intramuskulært, i.m.), atropin (0,04 mg/kg i.m.) og midazolam (0,3 mg/kg i.m.).
- Induser anestesi ved inhalasjon av 5 % isofluran gjennom en maske med en strømningshastighet på 22-44 ml/kg/min for innsetting og intubasjon av perifer linje. Oppretthold anestesi med 0,5%-2% isofluran ved 22-44 ml / kg / min. Sørg for tilstrekkelig anestesidybde ved å kontrollere hemodynamisk stabilitet og noter fraværende palpebral / pedal tilbaketrekningsreflekser eller kjeve muskeltonus for å betegne et passende nivå av bedøvelse administrert. Administrer intravenøs remifentanil (10-20 μg/kg/time) kontinuerlig hastighetsinfusjon under kirurgi for analgesi.
- Intuber grisen med et passende endotrakealrør (7-8 mm) og koble røret til et ventilatorsett til et tidevannsvolum på 8 ml / kg, PEEP på 5 cm H 2 0, FiO2på 0,5 og respirasjonsfrekvens på 14.
- Sett inn et 22 G angiocath kateter i ørevenen. Når intravenøs (IV) tilgang er oppnådd, tilfør varm 0,9% normal saltvann ved 5-10 ml / kg / t gjennom hele prosedyren for å opprettholde gjennomsnittlig arterielt trykk mellom 60 mmHg og 90 mmHg.
- Overvåk kontinuerlig hjertefrekvens, pulsoksymetri og end-tidal CO2. Vurder blodtrykk og kroppstemperatur hvert 5. minutt.
- Påfør øyesalve for å forhindre okulær tørrhet mens du er under anestesi. Forbered hele kirurgisk felt med povidon-jod. Draper det kirurgiske feltet med sterile håndklær.
- Omental klaff
- Plasser grisen i den bakre posisjonen og utfør en xypho-umbilical laparotomi.
- Når du kommer inn i magen, mobiliser magesekken for å visualisere det større omentumet. Plasser omentumet forsiktig i det operative feltet og identifiser de gastroepiploiske karene som går langs den større krumningen i magen (figur 2A).
- Begynn på venstre aspekt av den større krumningen hvor venstre gastro-epiploic arterie blir med miltarterien. Ved hjelp av rett Stevens tenotomi saks, skeletonize både venstre gastro-epiploic arterie og vene. Ligate deler deretter begge separat ved hjelp av kirurgiske bånd eller klips.
- Fortsett langs den større krumningen i magen fra venstre til høyre. Ligate og del de korte vaskulære grenene som oppstår fra omentumet som gir større krumning i magen. Pass på at du ikke skader den viktigste gastroepiploiske pedicle av omentum i løpet av dette trinnet.
- Fortsett mobiliseringen av det større omentum til krysset mellom de høyre gastro-epiploiske karene og gastroduodenal arterien oppstår. Med klips eller bånd deler ligate deretter høyre gastroepiploiske arterie og vener separat for å frigjøre omental klaff.
- Når det er frigjort, kan omentumet deles langs midten i to halvdeler, med hver halvdel ledsaget av en respektive gastro-epiploisk arterie og vene. Dette gjør det mulig å anskaffe to omentalfrie klaffer fra en dyreoperasjon. Individuelt kanylere de gastro-epiploiske karene med en 20-22 G kanyle og fest deretter med 3-0 silkebånd.
- Skyll heparinisert saltvann (15 I.U./ml) inn i den gastroepiploiske arterielle kanylen til en klar venøs utstrømning observeres.
- Tensor fascia lata klaff
MERK: Protokollen er basert på en tidligere beskrivelse av svin tensor fascia lata klaff av Haughey et al.19. Modifikasjon er laget for å isolere bare den fascielle delen av tensor fascia lata klaffen.- Plasser grisen i lateral decubitus-stilling og barber hele øvre bakben bilateralt. Forbered og draper ved hjelp av de vanlige sterile prosedyrene.
- Merk klaffens fremre grense med en linje som strekker seg fra fremre øvre hofterygg (ASIS) mot lateral patella. Plasseringen av pedicle er ca 6-8 cm fra ASIS langs denne linjen.
- Merk en parallell bakre linje ca. 8 cm til 10 cm fra det fremre snittet langs lårbensaksen for å inkludere bredden på klaffen. Merk den distale kanten av klaffen ved lateral patella.
- Begynn disseksjonen ved distalmarginen ved patellaen med et skarpt snitt av huden ved hjelp av en skalpell. Utdype hudinnsnittet med cautery gjennom det subkutane vevet til fascia overliggende rectus femoris er oppstått.
- Fortsett hudinnsnittene mot ASIS langs de markerte fremre og bakre grensene beskrevet ovenfor. For å isolere den fascielle klaffen alene, fjern den overliggende hudkomponenten fra det underliggende fasciale laget. Ligate eller cauterize noen små perforator fartøy til huden.
- Gå tilbake til klaffens distale kant og snitt den dype fascia for å tillate mobilisering av den underliggende vastus lateralis-muskelen. Mobiliser fascia mot ASIS.
- Under mobilisering, identifiser den vaskulære pedicle som kommer fra mellom vastus lateralis og rectus femoris muskler (figur 2B). Pass på å unngå overdreven trekkraft for ikke å skade pedicle-karene.
- Disseker det proksimale aspektet av ASIS mens du beskytter den vaskulære pedicleen. Disseker til klaffen er tilstrekkelig mobilisert om pedikelen.
- Spor pedicle mot de dype lårbenene. Skeletonize både lateral circumflex femoral arterie og vene som forsyner den fasciale klaffen. Ligate deler deretter begge fartøyene proksimalt hvor de blir med i de dype lårbenene.
- Kanylere pedikelkarene individuelt med 20 G til 24 G angiokateter, sikret med 3-0 silkebånd. Skyll heparinisert saltvann (15 I.U./ml) inn i klaffen arteriell kanyle til en klar venøs utstrømning observeres.
- Radial underarm klaff
MERK: Protokollen nedenfor er basert på en publisert beskrivelse av porcine radial underarm klaffmodell av Khachatryan et al.20.- Plasser grisen på operasjonsbordet i lateral decubitus-stilling. Plasser det avhengige forbenet innenfor det operative feltet.
- Merk en omtrentlig hudklaff på 3 cm x 3 cm på den radiale underarmen. Tegn en linje mellom midtpunktet i den proksimale klaffmargen og den antecubitale fossa for å betegne det omtrentlige forløpet av radialarteriepedikelen. Bekreft arterielt kurs med palpasjon.
MERK: I svinemodellen ligger de radiale karene relativt dypere enn hos mennesker. Deres plassering er mellom flexor carpi radialis og brachioradialis. - Snitt huden ved hjelp av en skalpell på det distale aspektet med en dybde opp til antebrachial fascia. Stump dissekere med tenotomi saks til den distale radiale arterien og dens to venae comitantes er oppstått. Ligate arterien og venene med kirurgiske bånd individuelt og dele seg.
- Fortsett hudsnittene på de radiale og ulnare kantene av den markerte hudfirkanten. Mobiliser klaffen av det underliggende radiale beinet med et kirurgisk blad som går fra radial til ulnar retning, samtidig som du hever hudklaffen proksimalt mot antecubital fossa.
MERK: Oppretthold et subfascialt disseksjonsplan for å sikre at radialarteriens pedicle forblir assosiert med det overliggende kutane laget. - Ved proksimal margin trekkes mellomrommet mellom brachioradialis og flexor carpi radialis med en selvbevarende retractor for å eksponere den proksimale radiale arterien og dens venae comitantes (figur 2C).
- Ved hjelp av tenotomi saks, skeletonize den radiale arterien og venae comitantes proksimalt på antecubital fossa hvor de går sammen med brachialisarterien og venene, henholdsvis. Disseker karene fra det omkringliggende fibrofete vevet for å oppnå en tilstrekkelig pedikellengde på ca. 5-6 cm. Ligate og del arterien og venae separat for å frigjøre den radiale underarmsklaffen.
- Kanylere pedikelkarene med 20 G til 24 G angiokateter, sikret med 3-0 silkebånd. Skyll heparinisert saltvann (15 IE/ml) inn i klaffen arteriell kanyle til en klar venøs utstrømning observeres.
- Etter anskaffelse av klaff, hold klaffene i kaldt saltvann ved 4 °C til de er klare for decellularisering. Ved dyp isofluranbedøvelse avliver du dyrene med en intravenøs injeksjon av kaliumklorid (100 mg/kg i.v.). Bekreft døden ved fravær av vitale tegn.
Figur 2: Innkjøp av tre vaskulære klaffer fra svin. Høyre (i) og venstre (ii) gastroepiploiske arterier kanyleres i omental klaff (iii). (B) Tensor fascia lata. Pedicle av klaffen (iv) er den stigende grenen av lateral femoral circumflex arterie (v). (C) Radial underarm klaff. Innkjøp av radial underarmsklaff (vi) er basert på den radiale arterien og vena comitantes (vii) som vaskulær pedicle (MERK: Gardiner ble utelatt for demonstrasjonsformål). Skala barer: 3 cm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Oppsett av decellulariseringssystemet
- Monter vevskammeret med klaffer under sterile forhold i et biosikkerhetsskap med laminær strømning.
- Fest en treveis stoppekran til både innløps- og utløpsportene til bioreaktoren. Fest et 0,2 μm filter til luftventilporten på lokket på vevkammerlokket. Prime innstrømningsslangen med steril heparinisert saltvann for å eliminere luftbobler.
- Plasser klaffene i kammeret. Ved hjelp av sterile hemostater kobler du klaffene til innstrømningsslangen ved hjelp av den mannlige Luer-kontakten. Skru den respektive arterielle kanylen av hver klaff på hannen Luer og sørg for en tett forsegling.
- Skyll heparinisert saltvann gjennom stoppekranen for å kontrollere at Luer-forbindelsen er uten lekkasjer og at klaffene kan perfunderes med tegn på venøs utstrømning. Lukk lokket på vevkammeret.
- Koble innstrømningsslangen med et gult tre-stopps pumperør til innstrømningsstoppekranen i vevskammeret. Fest også en inline trykksensortransduser til innstrømningen treveis stoppekran for å tillate perfusjonstrykkovervåking.
- Slå på den peristaltiske innstrømningspumpen. På startskjermbildet fortsetter du til den tredje fanen ved hjelp av piltasten for å sette rør-ID-en til 1,85 mm. Fortsett deretter til den andre fanen for å stille inn perfusjonshastigheten. Inngangshastighet som leveringsmåte og satt til 2 ml/min. Kontroller at flytretningen er riktig som vist på skjermen. Legg tre-trinns pumpeslangen til den peristaltiske pumpen med en kompatibel kassett.
- Gjenta prosedyren for den peristaltiske utstrømningspumpen som ligner på ovenfor. Sett utstrømningspumpeinnstillingen til hastighet på 4 ml/min. Koble utstrømningsslangen med et gult tre-trinns pumperør til utstrømningsstoppekranen i vevskammeret. Legg tre-trinns pumpeslangen til den peristaltiske pumpen med en kompatibel kassett. Start strømmen for begge pumpene ved å trykke på strømknappen .
MERK: Den høyere hastigheten på utstrømningspumpen er et viktig sikkerhetstiltak for å forhindre overløp av vevskammeret, slik at kammerutstrømningen alltid overstiger tilstrømningen i løpet av decellulariseringen. Hele det sammensatte decellulariseringsoppsettet er avbildet i figur 3.
Figur 3: Montert perfusjonsdecellulariseringssystem. (A) Skjematisk av perfusjonsdecellulariseringssystemet. Innstrømningsslangen fører perfusat fra vaskemiddelbeholderen inn i vevskammeret på en enkeltpassasjemåte med trykksensorovervåking. Utstrømningsslangen fjerner perfusat aktivt fra vevskammeret inn i avfallsbeholderen. Svarte piler betegner retningen for perfusjonsstrømmen. En peristaltisk pumpe brukes med venstre pumpe for å kontrollere tilstrømningen. Utstrømningen fjernes aktivt ved hjelp av en annen peristaltisk pumpe gjennom de respektive rørene. Figur laget med BioRender.com. (B) Fotografi av perfusjonsdecellulariseringssystemet montert på benktoppen med den peristaltiske innstrømningspumpen (i) koblet til vevskamrene (ii) og deretter utstrømningsperistaltisk pumpe (iii). Innstrømningsperfusattrykket overvåkes med en inline trykksensor (iv) før det kommer inn i vevskammeret. Her decellulariseres tre klaffer parallelt. Både vaskemiddelet og avfallsbeholderne er under benken og ikke fotografert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5. Decellularisering av svineklaffer
- Utfør alle følgende trinn for perfusjonsdecellularisering ved romtemperatur. For en oppsummering av perfusjonsrater og varigheter, se tabell 1. Begynn perfusjonen av heparinisert saltvann ved 2 ml / min ved hjelp av en peristaltisk pumpe og perfuse klaffene med heparinisert saltvann i vevskammeret i 15 minutter for å fjerne eventuelle tilbakeholdte blodpropper.
- Ved fullføring av heparinisert saltvannsperfusjon, aspirat gjenværende saltvann i vevskammeret. Fyll vevskammeret med ca. 500 ml SDS decellulariseringsløsning for å senke klaffen tilstrekkelig.
- Overfør innstrømningsslangen til SDS-decellulariseringsløsningen og perfuser vevet ved 2 ml / min. Varigheten av perfusjon varierer avhengig av klaffen; perfuse SDS i 2 dager for omentum, 3 dager for tensor fascia, og 5 dager for radial underarm fascio-kutan klaff.
- Når SDS-decellulariseringen er fullført, aspirerer du det eksisterende SDS-perfusatet som finnes i vevskammeret. Overfør innstrømningsslangen til 1x PBS-løsning og perfuser klaffene i 1 dag ved 2 ml / min.
- Fjern den forrige PBS-løsningen og overfør innstrømningsslangen til DNase-arbeidsløsningen. Sikring i 2 timer ved 2 ml/min. Fjern DNase-løsningen fra vevskammeret og plasser innstrømningsslangen i 1x PBS-løsning. Senk vevet med 1x PBS-løsning i kammeret og perfuse 1x PBS-løsning i 1 dag ved 2 ml / min.
- Steriliser klaffene med PAA/EtOH-oppløsning. Overfør innstrømningsslangen til PAA/EtOH i dH2O-oppløsning og senk vevet i samme oppløsning. Støt PAA/EtOH ved 2 ml/min i 3 timer. Når PAA/EtOH-steriliseringen er fullført, kobler du slangen fra de treveis stoppekranene.
- Fjern klaffene ved hjelp av aseptisk teknikk og legg de sterile instrumentene i PBS som inneholder 1% antibiotika / antimykotika (A / A). Senk klaffene med PBS + 1% A / A i 15 minutter i to separate vasker for å nøytralisere restsyren helt. Oppbevar klaffene i PBS + 1 % A/A ved 4 °C til de er klare for recellularisering.
- Kontroller steriliteten til stillasene ved å utføre en vattpinnekultur på agarplater og undersøk for mikrobiell vekst. Inokulere agarplater med vattpinner tatt fra hver klaffoverflate. Dyrk agarplatene ved 37 °C i opptil 2 uker. Sterilitet er demonstrert ved fravær av mikrobiell kolonivekst.
Tabell 1: Sammendrag av perfusjon-decellulariseringsprotokollparametere. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
6. Evaluering av decellularisering
- Ved hjelp av en stansebiopsi anskaffer du prøver 3 mm til 10 mm i tykkelse fra klaffene.
- For histologi, fikse biopsier i histologiske kassetter i normalt bufret formalin i 24 timer ved romtemperatur.
- Vask biopsi kassetter i vann eller PBS i 15 min deretter plassere dem i 70% etanol til klar for vev behandling. Behandle kassettene i en vevsprosessor i henhold til standardprotokoller.
- Legg biopsiene i parafin, slik at voksen stivner i 10-15 minutter på en kald tallerken. Seksjon parafinblokker på en mikrotom til 5 μm tykkelse. Flekk lysbildene med hematoksylin og eosin (H &E) i henhold til standardprotokoller. Bilde vevet lysbilder med lysmikroskopi.
- For kvantifisering av DNA-innhold, oppnå tørrvekten til vevsbiopsiene etter tørking over natten i en ovn ved 60 °C. Fordøy prøvene i en papain ekstraksjonsbuffer ved 65 °C over natten. Sentrifuger de fordøyede prøvene ved 10.000 x g og overfører supernatanten til et friskt mikrosentrifugerør. Analyser DNA-innholdet med et kommersielt DNA-ekstraksjonssett i henhold til produsentens instruksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen for å decellularisere vaskulariserte svineklaffer er avhengig av perfusjon av et ionisk-basert vaskemiddel, SDS, gjennom klaffvaskulaturen i en tilpasset perfusjonsbioreaktor. Før decellularisering ble tre vaskulariserte klaffer i en svinemodell anskaffet og kanylert i henhold til deres viktigste forsyningsfartøy. Klaffene ble umiddelbart spylt etter anskaffelse for å opprettholde en patent, perfusabel vaskulatur for å muliggjøre vellykket decellularisering. Ved hjelp av lufttette snap-lokkbeholdere ble en tilpasset bioreaktor designet for å tillate klaffperfusjon i et lukket miljø. Perfusjon av klaffer i bioreaktoren ble oppnådd i en enkeltpassasje ved bruk av to peristaltiske pumper koblet til vevskammeret. Perfusjonstrykket ble overvåket med en inline trykksensor.
Under decellularisering var varigheten av SDS-eksponering avhengig av hvilken type vev som ble behandlet. Med den beskrevne perfusjonsdecellulariseringsteknikken ble omentum, tensorfascie og radiale underarmsklaffer decellularisert med 0,05% SDS i henholdsvis 2 dager, 3 dager og 5 dager. Vellykket sterilisering etter decellularisering ble demonstrert ved fravær av mikrobiell kolonivekst etter swabbing av klaffene og dyrking av vattpinnene på agarplater i 14 dager. Perfusjonstrykket ble overvåket med en strømningshastighet på 2 ml/min og varierte mellom 20-60 mmHg i alle stadier av decellularisering for alle tre klaffene. Ved avslutningen av decellulariseringen ble klaffene spylt under manuell kontroll og viste tegn på utstrømning fra venøs kanyle til fri drenasje (Supplementary Video 1, Supplementary Video 2, Supplementary Video 3).
Totalt 15 klaffer ble decellularisert, med fem replikasjoner for hver av de tre vevstypene. Ved undersøkelse viste bruttomorfologien til innfødte vev rosafarget (figur 4A, E, I), mens decellulariserte vev var karakteristisk hvite / ugjennomsiktige i utseende (figur 4C, G, K). Histologisk undersøkelse av stedegne vev med H&E viser tilstedeværelse av blå kjerner (figur 4B,F,J). I decellulariserte klaffer viste H&E-farging et tap av cellulært materiale med fravær av blå kjernefarging (figur 4D, H, L), noe som indikerer et acellulært vevsstillas. Ytterligere kvantifisering av DNA-innholdet i de fem replikaene viste en statistisk signifikant reduksjon i DNA i de acellulære stillasene sammenlignet med innfødte vev ved en Student t-test for hver klaff (figur 5). I omentumet ble DNA redusert fra 460 ng/mg ± 124 ng/mg tørt vev i den opprinnelige klaffen til 25,8 ng/mg ± 5,90 ng/mg tørt vev i den decellulære klaffen (n = 5, p < 0,05). I tensor fascia lata ble DNA redusert fra 297 ng/mg ± 68,2 ng/mg til 58,3 ng/mg ± 13,5 ng/mg mellom henholdsvis native og decellularized klaffer (n = 5, p < 0,05). Den radiale underarmsklaffen viste en DNA-reduksjon fra 1180 ng/mg ± 241 ng/mg i den opprinnelige klaffen til 162 ng/mg ± 34,9 ng/mg i den decellulære klaffen (n = 5, p < 0,05).
Figur 4: Decellularisering av tre svineklaffer. Grov undersøkelse av (A) innfødt omentum, (E) tensor fascia lata og (I) radiale underarmsklaffer viser det rosa utseendet til klaffene umiddelbart etter anskaffelse. Den histologiske fargingen av innfødte vev demonstrerer klar hematoksylinfarging av cellulære kjerner med H &E (B, F, J). Etter decellularisering virker (C) omentum, (G) tensor fascia lata og (K) radial underarm grovt hvit og ugjennomsiktig. Histologisk viser de tre decellulariserte klaffene et fravær av nukleær farging med H&E (D,H,L). Skala barer: 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kvantifisering av DNA-innhold i acellulære stillaser. Verdiene normaliseres til mg tørr stillasmasse. Ferske vevsprøver fra innfødte, ikke-decellulære vev (n = 5) og decellulariserte vev (n = 5) ble tørket og veid før nattens fordøyelse i papain før kvantifisering. Statistisk testing brukte Student t-tester med et signifikansnivå (**) definert som en p-verdi < 0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1. Tidsforløpsundersøkelse av progresjon av perfusjonsdecellularisering av omentum ved bruk av 0,05 % natriumdodecylsulfat over 5 dager ved bruttoundersøkelse (skalastenger = 3 cm) og H&E-histologi (skalastenger = 200 μm). Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2. Tidsforløpsundersøkelse av progresjon av perfusjon-decellularisering av tensor fascia lata ved bruk av 0,05% natriumdodecylsulfat over 5 dager ved bruttoundersøkelse (skalastenger = 3 cm) og H&E-histologi (skalastenger = 200 μm). Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 3. Tidsforløpsundersøkelse av progresjon av perfusjonsdecellularisering av radial underarmsklaff ved bruk av 0,05 % natriumdodecylsulfat over 5 dager ved bruttoundersøkelse (skalastenger = 3 cm) og H&E-histologi (skalastenger = 200 μm). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsvideo 1. Representativ manuell perfusjon av decellularisert omentumklaff via arteriell kanyle (rosa) som viser utstrømning fra den fritt drenerende venøse kanylen (gul). Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Tilleggsvideo 2. Representativ manuell perfusjon av decellularisert tensor fascia lata klaff via arteriell kanyle (rosa) som viser utstrømning fra den fritt drenerende venøse kanylen (blå). Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Tilleggsvideo 3. Representativ manuell perfusjon av decellularisert radial underarmsklaff via arteriell kanyle (blå) som viser utstrømning fra den fritt drenerende venøse kanylen (gul). Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den foreslåtte protokollen bruker perfusjon av lav konsentrasjon SDS for å decellularisere en rekke svineavledede klaffer. Med denne prosedyren kan acellulær omentum, tensor fascia lata og radial underarmsklaffer vellykket decellulariseres ved hjelp av en protokoll som favoriserer lav konsentrasjon SDS. Foreløpige optimaliseringseksperimenter har fastslått at SDS ved lav konsentrasjon (0,05%) mellom 2 dager og 5 dager er i stand til å fjerne cellulært materiale for omentum, tensor fascia lata og radial underarmsklaff når det analyseres med histologiske teknikker (supplerende figur 1, supplerende figur 2, supplerende figur 3). Denne metoden gir en enkel tilnærming som oppnår decellularisering innen kort tidsramme og til en rimelig pris. Etter vår erfaring tar decellularisering og sterilisering av svineklaffer mellom 2-5 dager, med lengre varighet decellularisering nødvendig for vev med større tetthet (f.eks. Underarmshud på 5 dager vs. omentum på 2 dager). Videre ble den lave konsentrasjonen av SDS som brukes i denne protokollen valgt ut fra begrunnelsen at en lav konsentrasjon av SDS ved 0,05% faller under den kritiske micellarkonsentrasjonen av SDS (omtrent 0,2%21) og dermed tillater overflateaktivt middel å effektivt oppløse cellemembraner mens viktige bioaktive ECM-komponenter forblir intakte. Bruken av lav konsentrasjon SDS i denne protokollen står i kontrast til bruken av relativt høyere konsentrasjoner av SDS (f.eks. 1%) for perfusjon-decellularisering av vaskulariserte fascio-kutane klaffer som rapportert av tidligere forfattere 13,22. Høye konsentrasjoner av SDS, mens de er effektive ved decellularisering, kommer på bekostning av å pådra seg skadelige effekter på ECM-stillaset, som GAG og uttømming av vekstfaktorer, samt denaturering av proteiner som kollagen og vimentin23,24. Faktisk vil fremtidig arbeid i perfusjon-decellularisering av svin vaskulariserte klaffer dra nytte av ytterligere karakteriseringsstudier for å undersøke effekten av decellulariseringsmidlet på ECM på strukturelle og molekylære nivåer og deres implikasjoner for nedstrøms recellularisering25,26,27 . Analyser for ECM-komponenter som kollagen-, elastin- eller GAG-innhold kan brukes til kvantitativt å vurdere endringer i ECM etter decellularisering. Videre er mekanisk styrketesting en nyttig modalitet for å studere endringer i de biomekaniske egenskapene etter decellularisering. Endelig vil vurdering av vaskulariteten ved hjelp av teknikker som angiografi eller microCT-skanning også bidra til å karakterisere vaskulær arkitektur på systemisk nivå som en forutsetning for å generere perfusable vaskulariserte klaffer28.
Flere tekniske hensyn bør bemerkes med denne protokollen. For det første bør det utvises ekstrem forsiktighet under klaffhåndtering og bioreaktormontering for å forhindre utilsiktet dekanlanulering, da rekanlanulering i en ex vivo-innstilling er relativt vanskeligere. For det andre, under klaffinnkjøp, er det avgjørende å skaffe en intakt klaff med en perfusabel og intakt vaskulær pedicle for vellykket decellularisering. Det bør utvises forsiktighet under anskaffelser for å sikre at distale lekkasjepunkter i stillaset enten er klippet eller bundet for hånd. Dette vil bidra til å redusere lekkasje, noe som kan forårsake ufullstendig perfusjon av løsninger gjennom klaffvaskulaturen. En innledende periode med perfusjon med heparinisert saltvann etter anskaffelse forhindrer oppbevaring av blodpropper og verifiserer en perfusabel vaskulatur som vist ved venøs perfusatutstrømning. Decellularisert vev kan også skylles igjen ved fullføring av decellularisering for å se etter potensielle intravaskulære hindringer (f.eks. Fra celleavfall / luftembolier) som kan utelukke klaffperfusabilitet. Vår erfaring var at decellulariserte klaffer ikke viste intravaskulær resistens mot sprøyteskylling etter denne protokollen, mens venøs utstrømning igjen kunne observeres fra decellularisert klaff etter skylling (Supplementary Video 1, Supplementary Video 2, Supplementary Video 3). Dette var en indikasjon på en patent arteriell til venøs vaskulær sløyfe med tilkoblingskapillærer som kan perfunderes.
Det tas en annen vurdering av perfusjonsparametrene under decellularisering. I denne protokollen ble en konstant strømningshastighetsperfusjon valgt med en målstrømningshastighet på 2 ml / min, som var innenfor rekkevidden av driftsstrømningshastighetene som ble brukt i tidligere publiserte decellulariseringsstudier av svineklaffvev13,29. Videre inkorporerer vårt decellulariseringssystem en sanntids in-line trykkovervåkingskapasitet for å overvåke potensielle svingninger i intravaskulær motstand i løpet av perfusjon; Denne metoden kan bidra til å unngå høyt perfusjonstrykk som oppstår ved mulig intravaskulær okklusjon som kan skade den mikrovaskulære ECM.
Endelig er sterilisering av det resulterende stillaset et annet viktig teknisk hensyn. Vi innlemmet en steriliseringsfase som det siste trinnet i decellulariseringsprotokollen for å håndtere tilfeldig miljøforurensning som kan oppstå under decellularisering. Klasterilitet er spesielt viktig slik at klaffer kan brukes i fremtiden for recellularisering. Perfusjonen av 0,1% pereddiksyre / 4% EtOH som sterilant har tidligere blitt rapportert av grupper for sterilisering av acellulære stillaser30,31 og ble også funnet å være effektiv med denne protokollen. Sterilitet ble verifisert ved å undersøke klaffpinnekulturer på agarplater og notere fraværende vekst etter 14 dagers inkubasjon.
Den tilpassede perfusjonsbioreaktoren designet for forsøkene er relativt kostnadseffektiv, så vel som enkel og rask å montere. Videre er alle komponentene i denne perfusjonsbioreaktoren autoklaverbare og tilpasningsdyktige for recellulariseringsarbeid, samtidig som klaffens sterilitet opprettholdes. Den tilpassede bioreaktorkretsen kan enkelt modifiseres for å tillate perfusjon med åpen krets som kan sirkulere cellekulturmedier gjennom et recellularisert stillas etter cellesåingseksperimenter. Likevel er noen begrensninger i bioreaktorsystemet verdt å nevne. For det første forringer bruken av to kommersielle pumper, mens det er nødvendig for å forhindre utilsiktet overløp av systemet, spesielt når store mengder perfusat brukes, den ellers lave prisen på perfusjonsoppsettet. I tillegg kan den lave gjennomstrømningen av det nåværende perfusjonsbioreaktorsystemet presentere logistiske utfordringer når du trenger å kjøre mange eksperimentelle replikasjoner parallelt; Relativt høyere gjennomstrømningssystemer utviklet for svinenyredecellularisering32 kan en dag tilpasses for decellularisering av svineklaff for å lindre disse logistiske utfordringene. Til slutt, mens den utviklede bioreaktoren er enkel å sette opp, er det fortsatt behov for menneskelig tilsyn og manuell drift regelmessig og ofte for å sikre at det ikke oppstår funksjonsfeil i systemet. Modifikasjoner av bioreaktoren som omfatter automatiseringsfunksjoner som både kan overvåke og justere bioreaktorytelsen med minimal eller ingen menneskelig inngrep, kan forfølges for å fremme perfusjons-decellulariseringsbioreaktorteknologi i fremtiden33,34.
Hovedanvendelsen av decellulære klaffer er å tillate etterfølgende recellularisering av disse acellulære stillasene med cellepopulasjoner som kan regenerere vaskulaturen. Mens mye fremtidig forskning er nødvendig for å bestemme passende celletall, populasjoner, såstrategier og bioreaktorforhold for å regenerere funksjonelt og levedyktig vaskularisert vev, representerer denne protokollen det første grunnleggende arbeidet mot dette målet. Fremtidige metoder for recellularisering vil bidra til å etablere strategier for å konstruere bløtvevsklaffer med et intakt perfusabelt vaskulært nettverk og bidra til potensielt å regenerere mer komplekse sammensatte vev, som ekstremitet og ansiktsallografter. Disse stillasene kan en dag omgå morbiditet og immunsuppresjon av donorstedet for pasienter som gjennomgår storskala bløtvevsrekonstruksjon, og dermed forbedre deres kliniske utfall og livskvalitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
| 0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
| 20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
| 3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
| 3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
| Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
| BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
| BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
| BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
| Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
| Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
| Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
| Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
| Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
| Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
| Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
| Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
| Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
| Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
| Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
| Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
| TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |
References
- Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study. Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).
- Edsander-Nord, Å, Jurell, G., Wickman, M. Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study. Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).
- Qian, Y., et al. A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651 (2018).
- Issa, F. Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses. Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Iske, J., et al. Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges. Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016, 1541823 (2016).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).
- Colazo, J. M., et al. Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration. Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).
- Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering - Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
- Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization. Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).
- Zhang, J., et al. Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template. Biomaterials. 89, 114-126 (2016).
- Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
- Duisit, J., et al. Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering. Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
- Khachatryan, A., et al. Radial Forearm Flap. Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , Springer. Denmark. 177-181 (2021).
- Hammouda, B. Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).
- Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold. Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).
- Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 84, 25-34 (2015).
- Mendibil, U., et al. Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds. International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447 (2020).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).
- Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
- Adil, A., Xu, M., Haykal, S. Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation. Frontiers in Surgery. 9, 843677 (2022).
- Phelps, E. A., García, A. J. Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering. Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).
- Pozzo, V., et al. A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies. Journal of Visualized Experiments. (181), e63557 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. Journal of Visualized Experiments. (48), e2394 (2011).
- Uzarski, J. S., et al. Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development. Journal of Visualized Experiments. (102), e53271 (2015).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
- Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. Decellularization systems and devices: State-of-the-art. Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).
- Schilling, B. K., et al. Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering. Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).
