Summary
整装原位杂交是发育生物学中最广泛使用的技术之一。在这里，我们提出一个高分辨率的双荧光原位杂交协议分析一个单一的基因精确的表达模式，并确定两个基因的表达域重叠。我们包括核反击一个碘化丙啶染色，以突出组织机构。
Abstract
整装
Protocol
1。固定
- 修复的胚胎在4℃过夜℃，4％多聚甲醛（PFA）的PBS。
- 删除修复，并在室温（RT）洗2 × PBS，每次5分钟。
- 在PBS手动dechorionate胚胎在玻璃抑郁使用钟表匠钳板。 dechorionation后，胚胎转移使用火抛光的玻璃巴斯德吸管，因为他们可能会粘到聚丙烯移液器。
- 转移胚胎通过一系列的25％，50％和75％甲醇的PBS，每次5分钟。
- 用100％的甲醇液体，孵化5分钟，然后与新鲜甲醇代替。
- 在-20 ° C放置至少一小时的胚胎。 （我们通常孵化的胚胎过夜。原位杂交技术标准工作了一年多的储存的胚胎，但我们还没有研究是否高分辨率的荧光原位杂交长时间存放丢失。）
- 每次5分钟，75％，50％，25％甲醇在室温下PBST清洗胚胎。 5分钟在室温下在PBST洗两次。
- 在4％PFA在室温下用PBS再次修正为20分钟。
- 5分钟在室温下在PBST洗两次。
注：关于煤灰：
我们存放在-20℃的4％PFA（见试剂表）分装。初步固定，我们只用煤灰以前从未有过解冻。随后的录制品中，我们经常用煤灰先前已解冻。初步固定，似乎是与此协议的成功染色关键。
2。蛋白酶和POSTFIXATION
- 精华与蛋白酶K（5μg/ml在PBST）在3至12分钟，以通透的胚胎RT。 （培养时间取决于胚胎，作为年轻的阶段是比较敏感的年龄，也取决于一批酶）。somitogenesis阶段的胚胎，我们通常通透3-4分钟。在此孵化，我们打下的离心管中，在其一侧。
- 简述在PBST冲洗，并为5分钟，在PBST洗一次。
- 在4％PFA在室温下用PBS再次修正为20分钟。
- 洗两次，每次5分钟，在室温下PBST。
3。预杂交
- 在65 º C孵育5分钟的胚胎HYB -。
- Prehybridize在HYB至少1小时+ 65 ° C。
4。杂交
- 取出所有的preHYB 50μL，但一定要保持完全淹没的胚胎。
- 每个riboprobe 1-2μL（digoxygenin和荧光标记的riboprobes）和混合胚胎，轻轻弹管。探头的数量通常是1 -2μL从20μL探针的合成反应。
- 管，荧光光敏感，应在铝箔包裹或以其他方式接触到最小光从这一点向前。
- 在65 ° C孵育过夜的胚胎
5。探头撤除
请注意，从这一点向前缺乏清洁剂的解决方案。消除洗涤剂似乎可以帮助染色反应，但不会导致胚胎变得相当粘。
- 取出的riboprobe。
- 在65 º C 50％formamide/2xSSC洗2 × 30分钟。
- 在65 º C 2 × SSC洗15分钟。
- 洗30分钟，65 º C在0.2 × SSC。
6。抗荧光抗体孵育
- 在室温下至少1小时座1X马来酸缓冲液加2％阻断试剂（见试剂表）的解决方案500μL。
- 添加在封闭液1:500稀释的抗荧光素过氧化物酶抗体，由罗氏公司提供，。
- 4℃孵育过夜在此孵化，我们打下的离心管中，在其一侧。
- 1X马来酸缓冲液洗4 × 20分钟。 5分钟的PBS洗两次。
7。检测荧光标记的探针
- TSA加荧光液孵育30-60分钟。 （染色液前离心TSA的基板反应，淡化酪胺试剂Perkin Elmer公司扩增稀释剂缓冲区1:50）在此孵化，我们打下的离心管中，在其一侧。反应时间必须为每个探头凭经验确定。不幸的是，染色反应，不能直观地监测为基材的荧光，会看到整个染色反应无处不在的绿色荧光。
- 30％，50％，75％和100％甲醇的PBS洗，每次10分钟。
- 在解决方案，在甲醇30分钟的1％ 的 H 2 0 2孵育灭活过氧化物酶。
- 75％，50％和30％甲醇的PBS洗涤，每次10分钟。在PBS各10分钟，然后洗两次。重要的是，所有的大都会hanol被删除。
酪胺信号放大的注意事项：
我们一直在使用Perkin Elmer公司TSA试剂盒。我们发现，Alexa的酪胺基板染色以及使用Perkin Elmer公司扩增稀释剂缓冲区，但我们还没有成功使用的染色与Invitrogen公司/分子探针试剂盒提供的缓冲区。最后，我们发现，随后甲醇/ H 2 O 2处理淘汰，而荧光素和Alexa - 647不受影响Cy5的荧光。 Cy3标记也可能会受到不利影响的甲醇/ H 2 O 2处理，因为它是结构相关的，以Cy5的。出于这个原因，Cy3和Cy5 TSA的反应应该只被用于第二双荧光染色原位协议反应。
8。抗- Digoxygenin抗体孵育
- 座在室温下至少1小时的胚胎，再次在1X马来酸缓冲液加2％阻断试剂的解决方案。
- 添加提供由罗氏公司在上述封闭液在1:1000稀释的抗地高辛的POD抗体
- 4℃孵育过夜在此孵化，我们打下的离心管中，在其一侧。
- 1X马来酸缓冲液洗4 × 20分钟。 5分钟的PBS洗两次。
9。 Digoxygenin标记探针检测
- 孵育（上下TSA的衬底旋转，然后才作出染色溶液反应，淡化酪胺试剂放大稀释剂缓冲区1:50）30-60分钟，在TSA的加Cy5的解决方案在此孵化，我们打下的离心管中，在其一侧。反应时间必须为每个探头凭经验确定。
- 10分钟，在PBST清洗三次。
10。碘化丙啶染色
- 5分钟，在2 × SSC洗两次。
- 孵育30分钟，胚胎在37 ° 50μL2 × 10μLRNA酶（终浓度为100μg/ml的）SSCT与C。
- 在2 × SSC在室温下每3分钟清洗6次。
- 为8分钟，在2 × SSC溶液330μg/ml碘化丙啶染色的胚胎。
- 在2 × SSC在室温下每3分钟清洗6次。
- 修复了20分钟在4％PFA在室温下用PBS。
- 洗两次，每次5分钟，在室温下PBST。
11。 MOUNTING
- 孵育10分钟，每个在25％和50％甘油在PBST的胚胎。清除75％的甘油，4℃过夜
- 我们解剖和deyolk胚胎和平板安装在显微镜幻灯片。蛋黄可产生显着的背景荧光。剥离是容易得多的胚胎后，已清除gylcerol ovenight。
解决方案：
| PBST | PBS加0.1％吐温 | |
| SSCT | SSC加0.1％吐温 | |
| HYB - | 50％甲酰胺 5xSSC 0.1％Tween - 20的 | |
| HYB + | HYB - 5mg/ml torula（酵母）RNA 50μg/ml肝素 | torula蛋白酶K消化的RNA与RNA准备随后苯酚，苯酚 - 氯仿，氯仿extraction.The RNA沉淀溶解于DEPC处理过的水。 |
| 1个马来酸缓冲 | 马来酸150MM，100MM氯化钠（pH值7.5） |
图1。整装代表结果双荧光原位杂交。 （AC）。图像显示，单焦部分通过对斑马鱼的胚胎在10体节期后区。据认为是与前顶端背。原子核与碘化丙啶染色为蓝色。 （一）deltaC mRNA的检测，使用digoxygenin标记riboprobe和TSA - Cy5的试剂。 （二）mRNA的转录从HER1基因检测用荧光标记的riboprobe和TSA荧光素试剂。 （三）合并，绿色和红色通道，明确标识不同的或重叠的两个基因的基因表达的区域。 （D，E）HER1表达的细节，展示了此过程的高分辨率。 mRNA的亚细胞定位，可以清楚地看出端倪。箭头指示表现活跃转录的一个细胞，发现在细胞核染色点。箭头指示一个细胞的mRNA的细胞质定位。 （F，G）HER1和deltaC的双重染色显示细胞转录基因（白箭头），或任一基因分开（红色和绿色箭头） 。
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Discussion
这里提出的协议的工作原理以及与染色30-45分钟后，在一个典型的碱性磷酸酶介导的反应，让一个干净的强烈信号的探针。执行的荧光原位杂交协议之前，我们总是考验我们的探头，使用标准的非荧光协议（探针合成协议提供补充材料）。使用较弱的探针时，我们曾成功与荧光原位杂交协议，但它可能在某些情况下可能。我们已经成功地结合起来，与β- catenin的3免疫定位的荧光原位杂交协议。当执行这种变化，我们做的HYB -，HYB +和杂交孵化，在55 ° C而不是65 ° C的抗原表位出现在较低温度下保存更好。免疫定位孵化后执行该协议的反应。
由于荧光标记的探针，一般比一个digoxygenin标记相同的基因探针弱，我们通常可视化荧光标记的探针。其中一个可能要形象化digoxygenin探头的一个实例是，如果这两个基因之一是在低水平表达。在这种情况下，一个为digoxygenin弱的基因和它的污渍第一最大化信噪比riboprobe。请注意，如果你可视化的荧光探针第二，你应该不可视荧光TSA的抗荧光素抗体将承认该协议染色以及荧光标记的riboprobe digoxygenin探头。
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Acknowledgments
我们要认识到，在发展本议定书Dörthe利希，珍妮回合和安德鲁马拉的贡献。 NICHD的，美国癌症协会和March of Dimes的提供的研究支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C |
| Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche Group | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C |
| Blocking Reagent | Roche Group | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche Group | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche Group | 11207739910 | As above. |
| TSA Plus Fluorescein system | PerkinElmer, Inc. | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. |
| TSA Plus Cyanine5 system | PerkinElmer, Inc. | NEL745001KT | As above |
| TSA Plus Cyanine3 system | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT | As above |
| TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes, Life Technologies | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. |
| RNase, DNase free | Roche Group | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution |
| Propidium Iodide | Molecular Probes, Life Technologies | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |
References
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
- Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
- Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
