Summary

Zebrafish पूरा पर्वत उच्च संकल्प डबल प्रतिदीप्त स्वस्थानी में संकरण

Published: March 25, 2009
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Summary

स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट विकासात्मक जीव विज्ञान में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीकों का है. यहाँ, हम एक डबल एक जीन की सटीक अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए और दो जीन की अभिव्यक्ति डोमेन के ओवरलैप का निर्धारण करने के लिए स्वस्थानी संकरण प्रोटोकॉल में फ्लोरोसेंट उच्च संकल्प प्रस्तुत करते हैं. हम एक परमाणु propidium आयोडाइड ऊतक संगठन पर प्रकाश डाला काउंटर दाग शामिल हैं.

Abstract

पूरे माउंट<em> बगल में</em> संकरण विकासात्मक जीव विज्ञान में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीकों का है. यहाँ, हम एक उच्च संकल्प डबल फ्लोरोसेंट मौजूद<em> बगल में</em> एक जीन की सटीक अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए और दो जीन की अभिव्यक्ति डोमेन के ओवरलैप का निर्धारण करने के लिए संकरण प्रोटोकॉल. प्रोटोकॉल मानक का एक संशोधित संस्करण है<em> बगल में</em> Alkaline फॉस्फेट और एनबीटी / BCIP और फास्ट लाल जैसे substrates का उपयोग संकरण<sup1,2></sup>. Tyramide संकेत प्रवर्धन (TSA) के साथ इस प्रोटोकॉल मानक digoxygenin और fluorescein लेबल जांच का इस्तेमाल<sup> 3</sup>. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध TSA किट की अनुमति प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के रूप में लचीला प्रयोगात्मक हरे रंग से दूर लाल डिजाइन propidium आयोडाइड, या प्रोटीन के लिए प्रतिदीप्ति immunohistochemistry जैसे विभिन्न परमाणु दाग, के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है. TSA एक प्रतिक्रियाशील फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट है कि जल्दी covalently लेबल antisense riboprobe के तत्काल आसपास के क्षेत्र में moieties, आम तौर पर tyrosine अवशेषों को बांध पैदा करता है. परिणामस्वरूप धुंधला पैटर्न है कि mRNA की subcellular स्थानीयकरण में उच्च संकल्प confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेसर का उपयोग कर रहे हैं मनाया जा सकता है<sup3,4></sup>. एक गुणसूत्र loci में नवजात टेप निरीक्षण परमाणु और cytoplasmic धुंधला भेद कर सकते हैं और अन्य mRNA की cortical स्थानीयकरण के रूप में इस तरह के पैटर्न कल्पना. में अध्ययन<em> ड्रोसोफिला</em> संकेत मिलता है कि mRNAs का लगभग 70% प्रदर्शन subcellular स्थानीयकरण के विशिष्ट पैटर्न है कि अक्सर इनकोडिंग प्रोटीन के समारोह के साथ सहसंबंधी<sup> 5</sup>. जब कंप्यूटर एडेड 3D confocal डेटासेट के पुनर्निर्माण के साथ संयुक्त, हमारे प्रोटोकॉल पूरे हड्डीवाला भ्रूण में उप सेलुलर संकल्प के साथ mRNA वितरण का विस्तृत विश्लेषण की अनुमति देता है.

Protocol

1. निर्धारण 4 में रातोंरात भ्रूण डिग्री सेल्सियस पीबीएस में 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ ठीक ठीक निकालें और कमरे के तापमान (आर टी) पर 2 x Pbs, 5 मिनट प्रत्येक धोने. पीबीएस में एक गिलास अवसाद घड़ीसाज़ संदंश ?…

Discussion

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल जांच है कि 30-45 मिनट के लिए एक ठेठ alkaline फॉस्फेट मध्यस्थता प्रतिक्रिया में धुंधला के बाद एक स्वच्छ मजबूत संकेत देने के साथ अच्छी तरह से काम करता है. पूर्व स्वस्थानी संकरण प्रोटोकॉल …

Acknowledgements

हम इस प्रोटोकॉल को विकसित करने में Dörthe Julich, जेनिफर दौर और एंड्रयू मारा के योगदान को स्वीकार करना चाहते हैं. अनुसंधान NICHD, अमेरिकन कैंसर सोसायटी और ऑफ डाइम्स के मार्च के द्वारा सहायता प्रदान.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade   Electron Microscopy Services 15710 Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C
Proteinase K, recombinant PCR grade   Roche 03115879001 Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C
Blocking Reagent   Roche 11096176001 Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws.
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments   Roche 11426346910 Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C.
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments   Roche 11207739910 As above.
TSA Plus Fluorescein system   Perkin Elmer NEL741001KT Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C.
TSA Plus Cyanine5 system   Perkin Elmer NEL745001KT As above
TSA Plus Cyanine3 system   Perkin Elmer NEL744001KT As above
TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG)   Molecular Probes /Invitrogen T20926 Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C.
RNase, DNase free   Roche 11119915001 Supplied as 500μg/ml solution
Propidium Iodide   Molecular Probes /Invitrogen P-3566 Supplied as 1mg/ml solution in water.

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Cite This Article
Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (25), e1229, doi:10.3791/1229 (2009).

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