Zebrafish पूरा पर्वत उच्च संकल्प डबल प्रतिदीप्त स्वस्थानी में संकरण
Summary
स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट विकासात्मक जीव विज्ञान में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीकों का है. यहाँ, हम एक डबल एक जीन की सटीक अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए और दो जीन की अभिव्यक्ति डोमेन के ओवरलैप का निर्धारण करने के लिए स्वस्थानी संकरण प्रोटोकॉल में फ्लोरोसेंट उच्च संकल्प प्रस्तुत करते हैं. हम एक परमाणु propidium आयोडाइड ऊतक संगठन पर प्रकाश डाला काउंटर दाग शामिल हैं.
Abstract
पूरे माउंट<em> बगल में</em> संकरण विकासात्मक जीव विज्ञान में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीकों का है. यहाँ, हम एक उच्च संकल्प डबल फ्लोरोसेंट मौजूद<em> बगल में</em> एक जीन की सटीक अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए और दो जीन की अभिव्यक्ति डोमेन के ओवरलैप का निर्धारण करने के लिए संकरण प्रोटोकॉल. प्रोटोकॉल मानक का एक संशोधित संस्करण है<em> बगल में</em> Alkaline फॉस्फेट और एनबीटी / BCIP और फास्ट लाल जैसे substrates का उपयोग संकरण<sup1,2></sup>. Tyramide संकेत प्रवर्धन (TSA) के साथ इस प्रोटोकॉल मानक digoxygenin और fluorescein लेबल जांच का इस्तेमाल<sup> 3</sup>. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध TSA किट की अनुमति प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के रूप में लचीला प्रयोगात्मक हरे रंग से दूर लाल डिजाइन propidium आयोडाइड, या प्रोटीन के लिए प्रतिदीप्ति immunohistochemistry जैसे विभिन्न परमाणु दाग, के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है. TSA एक प्रतिक्रियाशील फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट है कि जल्दी covalently लेबल antisense riboprobe के तत्काल आसपास के क्षेत्र में moieties, आम तौर पर tyrosine अवशेषों को बांध पैदा करता है. परिणामस्वरूप धुंधला पैटर्न है कि mRNA की subcellular स्थानीयकरण में उच्च संकल्प confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेसर का उपयोग कर रहे हैं मनाया जा सकता है<sup3,4></sup>. एक गुणसूत्र loci में नवजात टेप निरीक्षण परमाणु और cytoplasmic धुंधला भेद कर सकते हैं और अन्य mRNA की cortical स्थानीयकरण के रूप में इस तरह के पैटर्न कल्पना. में अध्ययन<em> ड्रोसोफिला</em> संकेत मिलता है कि mRNAs का लगभग 70% प्रदर्शन subcellular स्थानीयकरण के विशिष्ट पैटर्न है कि अक्सर इनकोडिंग प्रोटीन के समारोह के साथ सहसंबंधी<sup> 5</sup>. जब कंप्यूटर एडेड 3D confocal डेटासेट के पुनर्निर्माण के साथ संयुक्त, हमारे प्रोटोकॉल पूरे हड्डीवाला भ्रूण में उप सेलुलर संकल्प के साथ mRNA वितरण का विस्तृत विश्लेषण की अनुमति देता है.
Protocol
Discussion
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल जांच है कि 30-45 मिनट के लिए एक ठेठ alkaline फॉस्फेट मध्यस्थता प्रतिक्रिया में धुंधला के बाद एक स्वच्छ मजबूत संकेत देने के साथ अच्छी तरह से काम करता है. पूर्व स्वस्थानी संकरण प्रोटोकॉल …
Acknowledgements
हम इस प्रोटोकॉल को विकसित करने में Dörthe Julich, जेनिफर दौर और एंड्रयू मारा के योगदान को स्वीकार करना चाहते हैं. अनुसंधान NICHD, अमेरिकन कैंसर सोसायटी और ऑफ डाइम्स के मार्च के द्वारा सहायता प्रदान.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C | |
| Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. | |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | As above. | |
| TSA Plus Fluorescein system | Perkin Elmer | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. | |
| TSA Plus Cyanine5 system | Perkin Elmer | NEL745001KT | As above | |
| TSA Plus Cyanine3 system | Perkin Elmer | NEL744001KT | As above | |
| TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes /Invitrogen | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. | |
| RNase, DNase free | Roche | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution | |
| Propidium Iodide | Molecular Probes /Invitrogen | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |
References
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
- Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
- Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
