Zebravis hele Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridisatie

Summary

Hele monteren in situ hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. We nemen een propidiumjodide nucleair anti-vlek weefsel organisatie te markeren.

Abstract

Whole mount

Protocol

1. FIXATION

1. Fix embryo's overnacht bij 4 ° C met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS.
2. Verwijder de fix en was 2 x PBS, 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
3. Handmatig dechorionate embryo's in PBS in een glazen plaat met behulp van depressie horlogemaker tang. Na dechorionation, worden embryo's met behulp van een brand-gepolijst glas Pasteur pipet omdat ze kunnen blijven plakken aan polypropyleen pipetten.
4. Overdracht van embryo's door middel van een serie van 25%, 50% en 75% methanol in PBS gedurende 5 minuten elk.
5. Vervang de vloeistof met 100% methanol, incubeer 5 minuten en daarna vervangen door verse methanol.
6. Plaats embryo's bij -20 ° C voor minimaal een uur. (We overnachten meestal uitbroeden van de embryo's. Standaard in situ hybridisatie zal werken op embryo's worden opgeslagen gedurende meer dan een jaar, maar we hebben niet onderzocht of de hoge-resolutie van de fluorescente in situ hybridisatie verloren gaat door langdurige opslag.)
7. Was embryo's voor elk 5 minuten in 75%, 50%, 25% methanol in PBST bij RT. Was twee keer gedurende 5 minuten in PBST bij RT.
8. Fix opnieuw gedurende 20 minuten in 4% PFA in PBS bij RT.
9. Was twee keer gedurende 5 minuten in PBST bij RT.

OPMERKING OVER PFA:
Wij slaan 4% PFA in porties bij -20 º C (zie tabel van de reagentia). Voor de eerste fixatie, gebruiken we alleen PFA die nog nooit eerder is ontdooid. Voor de daaropvolgende fixaties, gebruiken we vaak PFA die eerder is ontdooid. De initiële fixatie lijkt te zijn essentieel voor een succesvolle kleuring met dit protocol.

2. Proteïnase EN POSTFIXATION

1. Digest met proteinase K (5μg/ml in PBST) bij RT gedurende 3 tot 12 minuten om de embryo's permeabilize. (De incubatietijd is afhankelijk van de leeftijd van de embryo's als jongere stadia zijn gevoeliger. Het hangt ook af van de partij enzym.) Voor somitogenesis stadium embryo's, meestal we permeabilize voor 3-4 minuten. Tijdens deze incubatie, leggen we de microcentrifugebuis op zijn kant.
2. Spoel kort in PBST en was een keer voor 5 minuten in PBST.
3. Fix opnieuw gedurende 20 minuten in 4% PFA in PBS bij RT.
4. Was twee keer, gedurende 5 minuten elk, in PBST bij RT.

3. Prehybridisatie

1. Incubeer de embryo's gedurende 5 minuten bij 65 º C in HYB-.
2. Prehybridize op 65 º C gedurende ten minste 1 uur in HYB +.

4. Hybridisatie

1. Verwijder alle maar 50 ul van de preHYB, maar zorg ervoor dat de embryo's volledig onder water te houden.
2. Voeg 1-2 ul van elk riboprobe (digoxygenin-en fluoresceïne-gelabeld riboprobes) om de embryo's en meng door zachtjes flicking de buis. De hoogte van de sonde is typisch een-2μl van een 20μl sonde synthesereactie.
3. Gezien het feit dat fluoresceïne is licht-gevoelig is, moet de buizen worden verpakt in aluminiumfolie of op andere wijze blootgesteld aan een minimale licht van dit punt naar voren.
4. 'S nachts Incubeer de embryo's op 65 º C.

5. PROBE VERWIJDEREN

Merk op dat de oplossingen van dit punt naar voren gebrek aan wasmiddel. Eliminatie van detergent lijkt te helpen de kleuring reacties, maar toe leidt dat de embryo's te worden nogal plakkerig.

1. Verwijder de riboprobe.
2. Was 2 x 30 minuten bij 65 º C in 50% formamide/2xSSC.
3. Was gedurende 15 minuten bij 65 º C in 2 x SSC.
4. Was gedurende 30 minuten 65 º C in 0,2 x SSC.

6. ANTI-fluoresceïne ANTILICHAAM incubatie

1. Blok voor ten minste 1 uur bij RT in 500μl van een oplossing van 1x maleïnezuur buffer verhoogd met 2% te blokkeren reagens (zie de tabel van de reagentia).
2. Voeg de anti-fluoresceïne-POD antilichaam, zoals geleverd door Roche, in een 1:500 verdunning in de blokkering oplossing.
3. Incubeer overnacht bij 4 º C. Tijdens deze incubatie, leggen we de microcentrifugebuis op zijn kant.
4. Was de 4 x 20 minuten in 1x maleïnezuur buffer. Was twee keer gedurende 5 minuten in PBS.

7. DETECTIE van fluoresceïne-ETIKETTEN PROBE

1. Incubeer 30-60 minuten in TSA Plus Fluoresceïne Solution. (Naar beneden TSA substraat Spin alvorens kleuroplossing. Voor de reactie, verdunnen tyramide reagens 01:50 in Perkin Elmer versterking verdunningsmiddel buffer.) Tijdens deze incubatie, leggen we de microcentrifugebuis op zijn kant. Reactietijd dient empirisch te worden bepaald voor elke probe. Helaas kan de kleuring reactie niet visueel gecontroleerd te worden als de ondergrond is fluorescerend, en men zal alomtegenwoordige groene fluorescentie te zien in de vlekken reactie.
2. Was gedurende 10 minuten elk in 30%, 50%, 75% en 100% methanol in PBS.
3. Incuberen in een oplossing van 1% H ₂ 0 ₂ in methanol gedurende 30 minuten om de eerste peroxidase inactiveren.
4. Was 10 minuten elk in 75%, 50% en 30% methanol in PBS. Dan twee keer wassen gedurende 10 minuten elk in PBS. Het is belangrijk dat alle gehaaldhanol worden verwijderd.

TOELICHTING OP DE tyramide signaalversterking:
We zijn met behulp van de Perkin Elmer TSA Kits. We vinden dat de Alexa-tyramide substraten goed vlek met behulp van de Perkin Elmer versterking verdunningsmiddel buffer, maar we hebben geen succes gehad met de kleuring buffer die bij de Invitrogen / Molecular Probes Kits. Tot slot hebben we gevonden dat Cy5 fluorescentie wordt geëlimineerd door de volgende methanol / H ₂ O ₂ behandeling, terwijl fluoresceïne en Alexa-647 blijven ongewijzigd. Cy3 kan ook negatief worden beïnvloed door de methanol / H ₂ O ₂ behandeling als het structureel gerelateerd is aan Cy5. Om deze reden moet Cy3 en Cy5 TSA reacties alleen worden gebruikt voor de tweede vlekken reactie in een dubbele fluorescente in situ protocol.

8. ANTI-Digoxygenin ANTILICHAAM incubatie

1. Opnieuw te blokkeren de embryo's voor minstens 1 uur bij RT in een oplossing van 1x maleïnezuur buffer verhoogd met 2% te blokkeren reagens.
2. Voeg de anti-DIG POD antilichaam zoals geleverd door Roche op een verdunning van 1:1000 in boven het blokkeren van oplossing
3. Incubeer overnacht bij 4 º C. Tijdens deze incubatie, leggen we de microcentrifugebuis op zijn kant.
4. Was de 4 x 20 minuten in 1x maleïnezuur buffer. Was twee keer gedurende 5 minuten in PBS.

9. OPSPORING VAN Digoxygenin-ETIKETTEN PROBE

1. Incubeer 30-60 minuten in TSA Plus Cy5 Solution (spin down TSA ondergrond alvorens kleuroplossing. Voor de reactie, tyramide reagens 01:50 in versterking verdunningsmiddel buffer verdund) Tijdens deze incubatie, leggen we de microcentrifugebuis op zijn kant. Reactietijd dient empirisch te worden bepaald voor elke probe.
2. Was drie keer voor 10 minuten elk in PBST.

10. Propidiumjodide KLEURING

1. Was twee keer gedurende 5 minuten in 2 x SSC.
2. Incubeer embryo's gedurende 30 minuten bij 37 ° C in 50 ui 2 x SSCT met 10 ul RNAse (voor een uiteindelijke concentratie van 100μg/ml).
3. Was zes keer gedurende 3 minuten in 2 x SSC bij RT.
4. Vlek van embryo's voor 8 minuten in een oplossing van 330μg/ml propidiumjodide in 2 x SSC.
5. Was zes keer gedurende 3 minuten in 2 x SSC bij RT.
6. Fix voor 20 minuten in 4% PFA in PBS bij RT.
7. Was twee keer, gedurende 5 minuten elk, in PBST bij RT.

11. MONTAGE

1. Incubeer de embryo's gedurende 10 minuten elk in 25% en 50% glycerol in PBST. Duidelijke 's nachts in 75% glycerol bij 4 º C.
2. We ontleden en deyolk de embryo's en vlakke plak ze op een microscoopglaasje. De dooier kan aanzienlijke achtergrond fluorescentie. Dissectie is veel gemakkelijker na de embryo's ovenight zijn verdwenen in gylcerol.

OPLOSSINGEN:

PBST	PBS plus 0,1% Tween
SSCT	SSC plus 0,1% Tween
HYB-	50% formamide 5xSSC 0,1% Tween-20
HYB +	HYB- 5mg/ml Torula (gist) RNA 50μg/ml heparine	De Torula RNA wordt bereid door proteinase K digestie van RNA met latere fenol-, fenol-chloroform-, en chloroform-extraction.The RNA is geprecipiteerd en opgelost in DEPC-behandeld water.
1 x maleïnezuur buffer	150mm maleïnezuur, 100mm NaCl (pH 7,5)

Figuur 1. Representatieve resultaten van de hele berg dubbele fluorescente in situ hybridisatie. (AC). Beelden tonen een confocale doorsnede door het achterste deel van een zebravis embryo bij de tien-somiet podium. Het uitzicht is dorsale met anterior naar de top. Kernen gekleurd met propidiumjodide zijn blauw gekleurd. (A) deltaC mRNA werd gedetecteerd met behulp van een digoxygenin-gelabeld riboprobe en TSA-Cy5 reagens. (B) mRNA getranscribeerd van de HER1 gen werd gedetecteerd met een fluoresceïne-gelabelde riboprobe en TSA-fluoresceïne reagens. (C) Het samenvoegen van de groene en rode kanalen eenduidig ​​identificeert de regio's van verschillende of overlappende gen-expressie van de twee genen. (D, E) Detail van HER1 expressie aantonen van de hoge resolutie van deze procedure. Subcellulaire lokalisatie van mRNA kan duidelijk worden onderscheiden. Pijlpunten wijzen op een cel vertoont actieve transcriptie, geopenbaard door punten van kleuring in de kern. Pijlen geven aan een cel met cytoplasmatische lokalisatie van mRNA. (F, G) Double kleuring voor HER1 en deltaC onthult cellen die transcriptie van beide genen (witte pijlpunt), of beide genen afzonderlijk (rood en groen pijlpunten).

Discussion

Het protocol hier gepresenteerde werkt goed met probes die een schone sterk signaal te geven na kleuring voor 30-45 minuten in een typisch alkalische fosfatase-gemedieerde reactie. Voorafgaand aan het uitvoeren van de fluorescente in situ hybridisatie protocol, we altijd testen onze sondes met behulp van de standaard niet-fluorescerende protocol (voorzien in aanvullende materiaal, samen met de sonde synthese-protocol). We hebben minder succes met de fluorescente in situ hybridisatie protocol bij het gebruik van zwakkere sondes, maar het kan mogelijk zijn in sommige gevallen. We hebben met succes samen de fluorescente in situ hybridisatie protocol met immunolocalization van β-catenine ^3. Bij het uitvoeren van deze variatie, wij doen de HYB-, HYB + en hybridisatie incubaties bij 55 ° C in plaats van 65 ° C als de epitopen lijken beter bewaard worden bij de lagere temperatuur. De immunolocalization incubaties worden uitgevoerd na de TSA reacties.

Sinds fluoresceïne-gelabelde probes zijn over het algemeen zwakker dan een digoxygenin-gelabelde probe voor hetzelfde gen, we meestal visualiseren de fluoresceïne-gelabelde probe eerste. Een voorbeeld waar men zou willen het digoxygenin sonde eerste visualiseren is als een van de twee genen wordt uitgedrukt op een laag niveau. In dit geval maakt men een digoxygenin-riboprobe voor de zwakke gen en vlekken voor het eerst het signaal te maximaliseren om ruis. Merk op dat als je visualiseert de fluoresceïne probe seconden, moet je niet de digoxygenin sonde te visualiseren met fluoresceïne TSA als de anti-fluoresceïne antilichaam herkent de TSA vlek als de fluoresceïne-gelabelde riboprobe.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710	Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C
Proteinase K, recombinant PCR grade	Roche Group	03115879001	Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C
Blocking Reagent	Roche Group	11096176001	Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws.
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments	Roche Group	11426346910	Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C.
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments	Roche Group	11207739910	As above.
TSA Plus Fluorescein system	PerkinElmer, Inc.	NEL741001KT	Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C.
TSA Plus Cyanine5 system	PerkinElmer, Inc.	NEL745001KT	As above
TSA Plus Cyanine3 system	PerkinElmer, Inc.	NEL744001KT	As above
TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG)	Molecular Probes, Life Technologies	T20926	Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C.
RNase, DNase free	Roche Group	11119915001	Supplied as 500μg/ml solution
Propidium Iodide	Molecular Probes, Life Technologies	P-3566	Supplied as 1mg/ml solution in water.