Hele monteren in situ hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. We nemen een propidiumjodide nucleair anti-vlek weefsel organisatie te markeren.
Whole mount<em> In situ</em> Hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele tl<em> In situ</em> Hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. Het protocol is een aangepaste versie van de standaard<em> In situ</em> Hybridisatie met behulp van alkalische fosfatase en substraten zoals NBT / BCIP en snelle Red<sup> 1,2</sup>. Dit protocol maakt gebruik van standaard digoxygenin en fluoresceïne gelabelde probes, samen met tyramide signaalversterking (TSA)<sup> 3</sup>. De commercieel verkrijgbare TSA kits maken een flexibele opzet van het experiment fluorescentie-emissie van groen naar ver-rood kan worden gebruikt in combinatie met diverse nucleaire vlekken, zoals propidiumjodide, of fluorescentie immunohistochemie voor eiwitten. TSA produceert een reactieve fluorescent substraat die snel covalent bindt aan groepen, meestal tyrosine residuen, in de directe omgeving van de gelabelde antisense riboprobe. De resulterende kleurpatronen zijn hoge resolutie in die subcellulaire lokalisatie van het mRNA kan worden waargenomen met behulp van laser scanning confocale microscopie<sup> 3,4</sup>. Men kan waarnemen ontluikende transcripten in de chromosomale loci, onderscheiden nucleaire en cytoplasmatische kleuring en visualiseren andere patronen, zoals corticale lokalisatie van mRNA. Studies in<em> Drosophila</em> Geven aan dat ongeveer 70% van de mRNA's specifieke patronen van de subcellulaire lokalisatie die vaak samenhangen met de functie van het gecodeerde eiwit vertonen<sup> 5</sup>. In combinatie met computer-aided reconstructie van 3D-confocale datasets, ons protocol maakt een gedetailleerde analyse van mRNA distributie met sub-cellulaire resolutie in zijn geheel gewervelde embryo's.
Het protocol hier gepresenteerde werkt goed met probes die een schone sterk signaal te geven na kleuring voor 30-45 minuten in een typisch alkalische fosfatase-gemedieerde reactie. Voorafgaand aan het uitvoeren van de fluorescente in situ hybridisatie protocol, we altijd testen onze sondes met behulp van de standaard niet-fluorescerende protocol (voorzien in aanvullende materiaal, samen met de sonde synthese-protocol). We hebben minder succes met de fluorescente in situ hybridisatie protocol bij het gebruik van zwakkere…
We willen graag de bijdragen van Dörthe Jülich, Jennifer Ronde en Andrew Mara erkennen in de ontwikkeling van dit protocol. Ondersteuning van het onderzoek door de NICHD, de American Cancer Society en de March of Dimes.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C | |
Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C | |
Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. | |
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. | |
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | As above. | |
TSA Plus Fluorescein system | Perkin Elmer | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. | |
TSA Plus Cyanine5 system | Perkin Elmer | NEL745001KT | As above | |
TSA Plus Cyanine3 system | Perkin Elmer | NEL744001KT | As above | |
TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes /Invitrogen | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. | |
RNase, DNase free | Roche | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution | |
Propidium Iodide | Molecular Probes /Invitrogen | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |