استخراج عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجينوم من التربة والرواسب

Summary

ووصف المنهجية لعزل الوزن الجزيئي عالية وعالية الجودة من الحمض النووي الجينومي المجتمع الميكروبي في التربة.

Abstract

وmicrobiome التربة هي الخزان واسعة وغير مستكشفة نسبيا من التنوع الجيني والابتكار الأيضية التي ترتبط ارتباطا وثيقا مع تدفق المواد الغذائية والطاقة داخل النظم الإيكولوجية الأرضية. زراعة مستقلة الجينومية البيئية ، والمعروف أيضا باسم metagenomic ، ونهج الوصول الوعد لم يسبق له مثيل على هذه المعلومات الوراثية في مجال التعمير والمسار الوظيفي للفحص العلاجية ذات القيمة العالية وعمليات تحويل الكتلة الحيوية. ومع ذلك ، فإن التربة microbiome لا يزال يمثل تحديا إلى حد كبير بسبب صعوبة الحصول على الحمض النووي الوزن الجزيئي عالية من الجودة واسعة تكفي لادخال الانتاج المكتبة. هنا نقدم مشروع بروتوكول لاستخراج الوزن الجزيئي عالية ، والحمض النووي الجينومي الميكروبي المجتمع من التربة والرواسب. نوعية الحمض النووي الجيني معزولة مثالية لإدراج بناء مكتبات بيئية كبيرة للتطبيقات تسلسل الجينوم والفرز المصب.

الإجراء يبدأ تحلل الخلية. وlysed جدران الخلايا والأغشية الميكروبات من قبل كل القوى الميكانيكية (طحن) والكيماوية (β – المركابتويثانول). ثم يتم عزل الحمض النووي الجينومي العازلة باستخدام الاستخراج ، والكحول والكلوروفورم ، isoamyl ايزوبروبيل. المخازن المؤقتة المستخدمة للتحلل والخطوات تشمل استخراج ثيوسيانات الجوانيدين وبروميد hexadecyltrimethylammonium (CTAB) للحفاظ على سلامة عالية الوزن الجزيئي الحمض النووي الجيني. اعتمادا على التطبيق الخاص المصب ، يمكن عزل الحمض النووي الجيني النقي باستخدام مزيد من كلوريد السيزيوم (CSCL) تنبيذ فائق التدرج ، مما يقلل من الشوائب بما في ذلك الأحماض الدبالية. الإجراء الأول والاستخراج ، ويأخذ 8 ساعات تقريبا ، باستثناء الخطوة الكمي الحمض النووي. تنبيذ فائق التدرج في CSCL ، هو عملية يومين. أثناء العملية كلها ، يجب أن تعامل برفق الحمض النووي الجيني لمنع القص ، وتجنب vortexing شديدة ، وقاسية pipetting المتكررة.

Protocol

الجزء الأول : استخراج الحمض النووي إجراء 1. ويلزم 8 ساعات ، لتجهيز 6 عينات من الحمض النووي باستثناء الكمي. قبل البدء في استخراج ، وسوف تحتاج إلى ما ق…

Materials

Recipe

* Denaturing solution
4 M Guanidine isothiocyanate
10 mM Tris-HCl (pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% 2-mercaptoethanol

Denaturing solution: 10 ml in total
Guanidine isothiocyanate (MW 118.16)	4.73 g
1M Tris-HCl (pH 7.0)	100 μl
0.5M EDTA	20 μl
Add water to 9.95 ml in total.
Autoclave.
Add 50 μl 2-mercaptoethanol just before use. (5 μl of 2-mercaptoethanol per 1 ml Denaturing Solution) Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C.  Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use.

**Extraction Buffer
100 mM Sodium phosphate buffer [pH 7.0]
100 mM Tris-HCl [pH 7.0]
100 mM EDTA [pH 8.0]
1.5 M  NaCl
1% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB)
2% SDS

Extraction Buffer for 1 L in total
1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*	100 ml
1M Tris-HCl [pH 7.0]	100 ml
0.5M EDTA [pH 8.0]	200 ml
5 M NaCl	300 ml
Autoclave and keep it at room temperature.
Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C. * 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0 Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended.