Estrazione di DNA ad alta peso molecolare genomico da terreni e sedimenti
Summary
Una metodologia per isolare ad alto peso molecolare del DNA genomico e di alta qualità da parte della comunità microbica del suolo è descritta.
Abstract
Il microbioma suolo è un vasto serbatoio e relativamente inesplorato della diversità genomica e innovazione metabolici che è intimamente associato a sostanze nutritive e flusso di energia negli ecosistemi terrestri. Coltivazione indipendente genomica ambientale, noto anche come metagenomica, approcci promessa accesso senza precedenti a queste informazioni genetiche rispetto alla ricostruzione percorso di screening e funzionale a fini terapeutici ad alto valore e processi di conversione della biomassa. Tuttavia, il microbioma suolo rimane ancora una sfida in gran parte dovuta alla difficoltà di ottenere DNA di alta peso molecolare di qualità sufficiente per la produzione di grandi biblioteche inserire. Qui introduciamo un protocollo per l'estrazione ad alto peso molecolare, DNA genomico comunità microbica da terreni e sedimenti. La qualità del DNA genomico isolato è ideale per la costruzione di grandi librerie di inserimento ambientale genomiche per applicazioni a valle di sequenziamento e di screening.
La procedura inizia con la lisi cellulare. Pareti delle cellule e le membrane dei microbi vengono lisati da entrambe le forze meccaniche (rettifica) e chimici (β-mercaptoetanolo). Il DNA genomico viene poi isolato tramite tampone di estrazione, cloroformio-alcool isoamilico e alcool isopropilico. I tamponi utilizzati per la lisi e fasi di estrazione comprendono isotiocianato di guanidina e esadeciltrimetilammonio bromuro (CTAB) per preservare l'integrità del DNA genomico ad alto peso molecolare del peso. A seconda dell'applicazione a valle, il DNA genomico isolato può essere ulteriormente purificato con cloruro di cesio (CsCl) ultracentrifugazione gradiente, che riduce le impurità tra cui gli acidi umici. Il primo procedimento, l'estrazione, dura circa 8 ore, escluse le passo la quantificazione del DNA. L'ultracentrifugazione gradiente di CsCl, è un processo di due giorni. Durante l'intera procedura, il DNA genomico deve essere trattata con delicatezza per evitare di taglio, evitare vortex severo, duro e ripetitivo pipettaggio.
Protocol
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare la Fondazione canadese per l'innovazione, la Columbia Britannica Conoscenza di sviluppo regionale, Genome British Columbia e la British Columbia Ministero delle Foreste e Gamma per sostenere gli studi in corso di produttività del suolo forestale. SL è stato sostenuto da una borsa di studio del Centro TULA fondazione finanziata per la diversità microbica e Evolution.
Materials
Recipe
* Denaturing solution
4 M Guanidine isothiocyanate
10 mM Tris-HCl (pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% 2-mercaptoethanol
| Denaturing solution: 10 ml in total | |
| Guanidine isothiocyanate (MW 118.16) | 4.73 g |
| 1M Tris-HCl (pH 7.0) | 100 μl |
| 0.5M EDTA | 20 μl |
| Add water to 9.95 ml in total. | |
| Autoclave. | |
| Add 50 μl 2-mercaptoethanol just before use. (5 μl of 2-mercaptoethanol per 1 ml Denaturing Solution) Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C. Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use. | |
**Extraction Buffer
100 mM Sodium phosphate buffer [pH 7.0]
100 mM Tris-HCl [pH 7.0]
100 mM EDTA [pH 8.0]
1.5 M NaCl
1% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB)
2% SDS
| Extraction Buffer for 1 L in total | |
| 1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]* | 100 ml |
| 1M Tris-HCl [pH 7.0] | 100 ml |
| 0.5M EDTA [pH 8.0] | 200 ml |
| 5 M NaCl | 300 ml |
| Autoclave and keep it at room temperature. | |
| Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C. * 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0 Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended. | |
References
- Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA extraction from 0.22 μM Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation. JoVE. , (2009).
- Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large insert environmental genomic library production. J Vis Exp. , (2009).
