Topraklar ve tortulları Yüksek Moleküler Ağırlık Genomik DNA çıkarımı

Summary

Mikrobiyal topluluk yüksek molekül ağırlıklı ve yüksek kalitede genomik DNA izole etmek için bir metodoloji tarif edilir.

Abstract

Toprak mikrobiyomları, karasal ekosistemler içinde besin ve enerji akışı ile yakından ilişkili genomik çeşitlilik ve metabolik yenilik ve nispeten keşfedilmemiş geniş bir rezervuar. Metagenomic olarak da bilinen Yetiştiriciliği bağımsız çevre genomik yaklaşımlar, bu genetik bilginin değeri yüksek tedavi ve biyokütle dönüşüm süreçleri için yolağı yeniden yapılanma ve fonksiyonel taraması ile ilgili benzeri görülmemiş bir erişim söz veriyorum. Ancak, toprak mikrobiyomları, hala büyük ekleme kütüphane üretimi için yeterli kalitede yüksek molekül ağırlıklı DNA temininde zorluk büyük ölçüde bir sorun olmaya devam etmektedir. Burada toprak ve tortular yüksek molekül ağırlıklı, mikrobiyal topluluk genomik DNA ayıklamak için bir protokol tanıtmak. Izole genomik DNA kalitesi downstream sıralama ve tarama uygulamaları için büyük ekleme çevre genomik kütüphaneler oluşturmak için idealdir.

Bu prosedür, hücre parçalama ile başlar. Mikropların hücre duvarlarını ve membranlar (β-mercaptoethanol) hem mekanik (taşlama) ve kimyasal güçleri tarafından parçalanmış. Genomik DNA ekstraksiyon tamponu, kloroform-izoamil alkol ve izopropil alkol kullanarak izole edilmiştir. Parçalama ve çıkarma adımları istihdam tamponlar guanidin izotiyosiyanat ve yüksek molekül ağırlıklı genomik DNA bütünlüğünü korumak için hekzadesiltrimetilamonyum bromür (STAB) içerir. Alt uygulanmasına ilişkin olarak, izole genomik DNA sezyum klorür (CSCL) hümik asitler de dahil olmak üzere kirleri azaltır degrade Ultrasantrifügasyon kullanarak saflaştırılmış olabilir. Ilk yordamı, ekstraksiyon, DNA sayısallaması adım hariç, yaklaşık 8 saat sürer. CSCL degrade Ultrasantrifügasyon, iki gün bir süreçtir. Bütün bu prosedür sırasında, genomik DNA kesme önlemek için nazikçe tedavi edilmelidir, ciddi vorteks önlemek ve tekrarlayan ağır pipetleme.

Protocol

Bölüm I: DNA çıkarımı Prosedür 1. 8 saat 6 örnekleri DNA ölçümü hariç işlenmesi için gereklidir. Çıkarma başlamadan önce, ön-chill harç, havaneli ve -20 ° C derin dondurucu içinde spatula veya sıvı azot kullanılarak gerekecektir. Ayrıca, 20 ml kloroform izoamil alkol (24:1) buz üzerinde içeren ön-chill 50 ml tüpler. 65 hibridizasyon fırın ayarlayın ° C ön ısıtma için. ° C kristall…

Materials

Recipe

* Denaturing solution
4 M Guanidine isothiocyanate
10 mM Tris-HCl (pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% 2-mercaptoethanol

Denaturing solution: 10 ml in total
Guanidine isothiocyanate (MW 118.16)	4.73 g
1M Tris-HCl (pH 7.0)	100 μl
0.5M EDTA	20 μl
Add water to 9.95 ml in total.
Autoclave.
Add 50 μl 2-mercaptoethanol just before use. (5 μl of 2-mercaptoethanol per 1 ml Denaturing Solution) Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C.  Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use.

**Extraction Buffer
100 mM Sodium phosphate buffer [pH 7.0]
100 mM Tris-HCl [pH 7.0]
100 mM EDTA [pH 8.0]
1.5 M  NaCl
1% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB)
2% SDS

Extraction Buffer for 1 L in total
1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*	100 ml
1M Tris-HCl [pH 7.0]	100 ml
0.5M EDTA [pH 8.0]	200 ml
5 M NaCl	300 ml
Autoclave and keep it at room temperature.
Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C. * 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0 Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended.