Добыча высокомолекулярных ДНК Геномная Вес от почвы и осадков

Summary

Методология, чтобы изолировать высокой молекулярной массой и высокой геномной ДНК качества из почвы микробного сообщества описывается.

Abstract

Почвы микробиомом является обширной и относительно неисследованными резервуар геномного разнообразия и метаболических инноваций, которые тесно связаны с питательных веществ и поток энергии в наземных экосистемах. Выращивание-независимой экологической геномной, также известный как метагеномных, подходы обещания беспрецедентный доступ к этой генетической информации в отношении реконструкции пути и функциональные обследования на высокую терапевтическую ценность и процессов конверсии биомассы. Тем не менее, почва микробиомом все еще остается проблемой в значительной степени из-за трудностей в получении высокого молекулярного веса ДНК достаточного качества для крупносерийного производства библиотеке вставки. Здесь мы вводим протокол для извлечения высокой молекулярной массой, микробного сообщества геномной ДНК из почв и донных отложений. Качество изолированной геномной ДНК идеально подходит для создания больших вставить экологические геномных библиотек для последующих применений последовательности и скрининга.

Процедура начинается с лизиса клеток. Клеточные стенки и мембран микробов лизируются как механическое (измельчение) и химической силы (β-меркаптоэтанол). Геномная ДНК затем выделяли с использованием буфера для экстракции, хлороформ-изоамиловый спирт и изопропиловый спирт. Буферы используются для лизиса и добычи шаги включают в себя изотиоцианата гуанидина и hexadecyltrimethylammonium бромида (СТАВ), чтобы сохранить целостность высоким молекулярным весом геномной ДНК. В зависимости от вашего вниз по течению приложений, изолированных геномной ДНК может быть дополнительно очищают, используя хлорид цезия (CsCl) градиент ультрацентрифугирования, что снижает примесей в том числе гуминовых кислот. Первая процедура, добыча, занимает около 8 часов, за исключением ДНК шагом количественной оценке. CsCl ультрацентрифугирования градиент, является два дня процесса. Во время всей процедуры, геномной ДНК, следует относиться осторожно, чтобы предотвратить стрижки, избегайте тяжелой вортексе, и повторяющиеся суровые пипетки.

Protocol

Часть I: Добыча ДНК Процедура 1. 8 часов не требуется, для обработки 6 образцов, исключая количественную ДНК. Прежде чем приступить к добыче, вам необходимо предварительно холод раствор, пестик и шпатель в морозильной камере -20 ° C или ?…

Materials

Recipe

* Denaturing solution
4 M Guanidine isothiocyanate
10 mM Tris-HCl (pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% 2-mercaptoethanol

Denaturing solution: 10 ml in total
Guanidine isothiocyanate (MW 118.16)	4.73 g
1M Tris-HCl (pH 7.0)	100 μl
0.5M EDTA	20 μl
Add water to 9.95 ml in total.
Autoclave.
Add 50 μl 2-mercaptoethanol just before use. (5 μl of 2-mercaptoethanol per 1 ml Denaturing Solution) Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C.  Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use.

**Extraction Buffer
100 mM Sodium phosphate buffer [pH 7.0]
100 mM Tris-HCl [pH 7.0]
100 mM EDTA [pH 8.0]
1.5 M  NaCl
1% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB)
2% SDS

Extraction Buffer for 1 L in total
1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*	100 ml
1M Tris-HCl [pH 7.0]	100 ml
0.5M EDTA [pH 8.0]	200 ml
5 M NaCl	300 ml
Autoclave and keep it at room temperature.
Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C. * 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0 Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended.