Extraction d'ADN de haut poids moléculaire génomique par les sols et sédiments

Summary

Une méthodologie pour isoler de haut poids moléculaire et de haute qualité à partir de l'ADN génomique des communautés microbiennes du sol est décrite.

Abstract

Le microbiome sol est un réservoir vaste et relativement inexploré de la diversité génomique et l'innovation métabolique qui est intimement associé à des éléments nutritifs et flux d'énergie dans les écosystèmes terrestres. La culture indépendante génomique environnementale, aussi connu comme métagénomique, les approches promets un accès sans précédent à cette information génétique à l'égard de la reconstruction et la voie de criblage fonctionnel à des fins thérapeutiques de grande valeur et des processus de conversion de la biomasse. Toutefois, le microbiome sol reste encore un défi largement dû à la difficulté d'obtenir un ADN de haut poids moléculaire d'une qualité suffisante pour la production d'insérer grande bibliothèque. Ici, nous introduisons un protocole pour l'extraction de haut poids moléculaire, l'ADN génomique microbienne communauté de sols et les sédiments. La qualité de l'ADN génomique isolé est idéal pour la construction de grands insertion environnementale des banques génomiques pour des applications de séquençage et de dépistage en aval.

La procédure débute par la lyse cellulaire. Les parois cellulaires et les membranes des microbes sont lysées par les deux forces mécaniques (broyage) et chimiques (β-mercaptoéthanol). L'ADN génomique est ensuite isolé en utilisant un tampon d'extraction, le chloroforme-alcool isoamylique et d'alcool isopropylique. Les tampons utilisés pour la lyse et des étapes d'extraction comprennent isothiocyanate de guanidine et le bromure de hexadécyltriméthylammonium (CTAB) pour préserver l'intégrité de l'ADN génomique de haut poids moléculaire. Selon votre application en aval, l'ADN génomique isolé peut être davantage purifiée en utilisant du chlorure de césium (CsCl) ultracentrifugation en gradient, ce qui réduit les impuretés, notamment des acides humiques. La première procédure, l'extraction, il faut environ 8 heures, à l'exclusion étape quantification de l'ADN. L'ultracentrifugation en gradient de CsCl, est un processus en deux jours. Pendant toute la procédure, l'ADN génomique devrait être traitée en douceur pour éviter le cisaillement, éviter les vortex sévère et répétitif pipetage rudes.

Protocol

Partie I: Extraction d'ADN Procédure 1. 8 heures sont nécessaires, pour le traitement des 6 échantillons excluant la quantification de l'ADN. Avant de commencer l'extraction, vous aurez besoin de pré-froid de mortier, un pilon et une spatule dans un congélateur à -20 ° C ou en utilisant l'azote liquide. En outre, pré-froid des tubes de 50 ml contenant 20 ml de chloroforme alcool isoamylique (24:1…

Materials

Recipe

* Denaturing solution
4 M Guanidine isothiocyanate
10 mM Tris-HCl (pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% 2-mercaptoethanol

Denaturing solution: 10 ml in total
Guanidine isothiocyanate (MW 118.16)	4.73 g
1M Tris-HCl (pH 7.0)	100 μl
0.5M EDTA	20 μl
Add water to 9.95 ml in total.
Autoclave.
Add 50 μl 2-mercaptoethanol just before use. (5 μl of 2-mercaptoethanol per 1 ml Denaturing Solution) Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C.  Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use.

**Extraction Buffer
100 mM Sodium phosphate buffer [pH 7.0]
100 mM Tris-HCl [pH 7.0]
100 mM EDTA [pH 8.0]
1.5 M  NaCl
1% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB)
2% SDS

Extraction Buffer for 1 L in total
1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*	100 ml
1M Tris-HCl [pH 7.0]	100 ml
0.5M EDTA [pH 8.0]	200 ml
5 M NaCl	300 ml
Autoclave and keep it at room temperature.
Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C. * 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0 Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended.