Extraktion von High Molecular Weight genomischer DNA aus Böden und Sedimenten

Summary

Eine Methodik, um mit hohem Molekulargewicht und hoher Qualität genomischer DNA aus mikrobiellen Gemeinschaft zu isolieren beschrieben.

Abstract

Der Boden Mikrobiom ist ein riesiges und relativ unerforscht Reservoir von genomischer Diversität und metabolische Innovation, die eng mit Nährstoff-und Energieflüsse innerhalb terrestrische Ökosysteme verbunden ist. Anbau-unabhängigen Umweltgutachter genomische, auch als Metagenom bekannt, versprechen Ansätze beispiellosen Zugang zu diesen genetischen Informationen in Bezug auf Weg Wiederaufbau und funktionelles Screening für hochwertige therapeutische und Umwandlung von Biomasse-Prozesse. Doch der Boden Mikrobiom immer noch eine Herausforderung vor allem auf die Schwierigkeiten bei der Beschaffung hochmolekulare DNA von ausreichender Qualität für große einfügen Bibliothek Produktion. Hier stellen wir ein Protokoll für die Gewinnung von hohem Molekulargewicht, mikrobiellen Gemeinschaft genomischer DNA aus Böden und Sedimenten. Die Qualität der isolierten genomischen DNA ist ideal für den Bau großer einfügen Umwelt genomische Bibliotheken für Downstream-Sequenzierung und Screening-Anwendungen.

Das Verfahren beginnt mit Zell-Lyse. Zellwände und Membranen von Mikroben werden sowohl von mechanischen (Schleifen) und chemische Kräfte (β-Mercaptoethanol) lysiert. Genomic DNA wird dann isoliert mit Extraktionspuffer, Chloroform-Isoamylalkohol und Isopropylalkohol. Die Puffer für die Lyse und Extraktion Schritte eingesetzt werden, umfassen Guanidinisothiocyanat und Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB), um die Integrität der hochmolekularen genomische DNA zu erhalten. Abhängig von Ihrer nachgeschalteten Anwendung kann der isolierten genomischen DNA weiter aufgereinigt werden mit Cäsiumchlorid (CsCl)-Ultrazentrifugation, die Verunreinigungen einschließlich Huminsäuren reduziert. Das erste Verfahren, Extraktion, dauert ca. 8 Stunden, ohne DNA-Quantifizierung Schritt. Die CsCl Gradienten-Ultrazentrifugation, ist ein 2 Tage-Prozess. Während des gesamten Verfahrens, genomische DNA vorsichtig behandelt werden sollte, um Scherung zu verhindern, vermeiden Sie starke Verwirbelung und repetitive rauen Pipettieren.

Protocol

Teil I: Die Extraktion von DNA Verfahren 1. 8 Stunden benötigt werden, für die Verarbeitung von 6 Proben ohne Quantifizierung von DNA. Bevor Sie die Extraktion zu starten, werden Sie vor Kälte Mörtel, Pistill und Spatel in einem -20 ° C Gefrierschrank oder mit flüssigem Stickstoff benötigen. Auch vor Kälte 50 ml Röhrchen mit 20 ml Chloroform Isoamylalkohol (24:1) auf Eis. Stellen Sie die Hybridisierung Backofen…

Materials

Recipe

* Denaturing solution
4 M Guanidine isothiocyanate
10 mM Tris-HCl (pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% 2-mercaptoethanol

Denaturing solution: 10 ml in total
Guanidine isothiocyanate (MW 118.16)	4.73 g
1M Tris-HCl (pH 7.0)	100 μl
0.5M EDTA	20 μl
Add water to 9.95 ml in total.
Autoclave.
Add 50 μl 2-mercaptoethanol just before use. (5 μl of 2-mercaptoethanol per 1 ml Denaturing Solution) Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C.  Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use.

**Extraction Buffer
100 mM Sodium phosphate buffer [pH 7.0]
100 mM Tris-HCl [pH 7.0]
100 mM EDTA [pH 8.0]
1.5 M  NaCl
1% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB)
2% SDS

Extraction Buffer for 1 L in total
1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*	100 ml
1M Tris-HCl [pH 7.0]	100 ml
0.5M EDTA [pH 8.0]	200 ml
5 M NaCl	300 ml
Autoclave and keep it at room temperature.
Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C. * 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0 Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended.