La extracción de ADN de alta molecular genómico de peso de los suelos y los sedimentos

Summary

Una metodología para aislar de alto peso molecular y ADN genómico de alta calidad de la comunidad microbiana del suelo se describe.

Abstract

El microbioma del suelo es un reservorio inmenso y relativamente inexplorado de la diversidad genómica y la innovación metabólica que está íntimamente asociado a los nutrientes y el flujo de energía dentro de los ecosistemas terrestres. Cultivo independiente de genómica ambiental, también se conoce como metagenómica, enfoques promesa de un acceso sin precedentes a esta información genética con respecto a la reconstrucción de la vía y el cribado funcional de alto valor terapéutico y los procesos de conversión de biomasa. Sin embargo, el microbioma de la tierra sigue siendo un reto en gran parte debido a la dificultad en la obtención de ADN de alto peso molecular de una calidad suficiente para la producción de grandes bibliotecas de inserción. Aquí presentamos un protocolo para la extracción de alto peso molecular, el ADN genómico de la comunidad microbiana de los suelos y sedimentos. La calidad del ADN genómico aislado es ideal para la construcción de grandes bibliotecas de insertar genómica ambiental para las aplicaciones posteriores de secuenciación y detección.

El procedimiento se inicia con la lisis celular. Paredes y membranas celulares de los microorganismos se lisan por fuerzas mecánicas (trituración) y químicos (β-mercaptoetanol). ADN genómico se aísla con tampón de extracción, el alcohol cloroformo-isoamílico y alcohol isopropílico. Los tampones utilizados para la lisis y etapas de extracción incluyen isotiocianato de guanidina y el bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) para preservar la integridad de la alta molecular del ADN genómico de peso. Dependiendo de su aplicación posterior, el ADN genómico aislado puede ser purificado con cloruro de cesio (CsCl) ultracentrifugación gradiente, lo que reduce las impurezas tales como los ácidos húmicos. El primer procedimiento, la extracción, dura aproximadamente 8 horas, sin incluir la cuantificación de ADN paso. El gradiente de CsCl ultracentrifugación, es un proceso de dos días. Durante todo el procedimiento, el ADN genómico debe ser tratada con cuidado para evitar la esquila, evitar la agitación grave y dura pipeteo repetitivo.

Protocol

Parte I: La extracción de ADN Procedimiento 1. 8 horas son necesarias, para el procesamiento de seis muestras de exclusión de la cuantificación de ADN. Antes de iniciar la extracción, tendrá que pre-chill mortero, mano de mortero y una espátula en un congelador a -20 ° C o el uso de nitrógeno líquido. Además, pre-frío tubos de 50 ml que contiene 20 ml de cloroformo alcohol isoamílico (24:1) en el hielo. Ajus…

Materials

Recipe

* Denaturing solution
4 M Guanidine isothiocyanate
10 mM Tris-HCl (pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% 2-mercaptoethanol

Denaturing solution: 10 ml in total
Guanidine isothiocyanate (MW 118.16)	4.73 g
1M Tris-HCl (pH 7.0)	100 μl
0.5M EDTA	20 μl
Add water to 9.95 ml in total.
Autoclave.
Add 50 μl 2-mercaptoethanol just before use. (5 μl of 2-mercaptoethanol per 1 ml Denaturing Solution) Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C.  Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use.

**Extraction Buffer
100 mM Sodium phosphate buffer [pH 7.0]
100 mM Tris-HCl [pH 7.0]
100 mM EDTA [pH 8.0]
1.5 M  NaCl
1% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB)
2% SDS

Extraction Buffer for 1 L in total
1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*	100 ml
1M Tris-HCl [pH 7.0]	100 ml
0.5M EDTA [pH 8.0]	200 ml
5 M NaCl	300 ml
Autoclave and keep it at room temperature.
Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C. * 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0 Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended.