超高分子量基因组DNA的提取土壤和沉积物
Summary
一个隔离土壤微生物群落的超高分子量和高品质的基因组DNA的方法来描述。
Abstract
土壤中微生物的基因组多样性和代谢创新是密切相关的陆地生态系统内的养分和能量流的庞大和相对未开发的的油藏。培养独立的环境基因组，也被称为宏基因组学，方针的前景前所未有的访问，这种遗传信息通路的重建和对高价值的治疗和生物转化过程中的功能筛选。然而，土壤中的微生物仍然是一个挑战，主要是由于在获得大量插入库生产质量足够高的分子量DNA的难度。在这里，我们介绍了从土壤和沉积物中提取的分子量高，微生物群落的基因组DNA的协议。分离出基因组DNA的质量是建设下游的测序和筛选应用环境大插入基因库的理想。
程序启动细胞裂解。微生物的细胞壁和膜机械（磨）和化学力（β-巯基乙醇）溶解。分离基因组DNA提取缓冲液，氯仿 – 异戊醇，异丙醇。受雇于裂解和提取步骤的缓冲区，包括异硫氰酸胍和十六烷基铵（CTAB），以保持超高分子量基因组DNA的完整性。根据您的下游应用，可进一步纯化分离出的基因组DNA，使用氯化铯（CSCL）梯度离心，从而减少杂质，包括腐殖酸。第一个程序，提取，大约需要8小时，不包括DNA定量的一步。 CsCl梯度超速离心法，是为期两天的过程。基因组DNA在整个过程中，应被视为轻轻地防止剪切，避免剧烈震荡，反复苛刻的吹打。
Protocol
Acknowledgements
我们要感谢为加拿大创新，基因组不列颠哥伦比亚省，不列颠哥伦比亚省知识发展基金和不列颠哥伦比亚省森林部和范围基金会，用于支持正在进行的研究森林的土壤生产力。 SL是由微生物多样性和进化图拉基金会资助中心的奖学金支持。
Materials
Recipe
* Denaturing solution
4 M Guanidine isothiocyanate
10 mM Tris-HCl (pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% 2-mercaptoethanol
| Denaturing solution: 10 ml in total | |
| Guanidine isothiocyanate (MW 118.16) | 4.73 g |
| 1M Tris-HCl (pH 7.0) | 100 μl |
| 0.5M EDTA | 20 μl |
| Add water to 9.95 ml in total. | |
| Autoclave. | |
| Add 50 μl 2-mercaptoethanol just before use. (5 μl of 2-mercaptoethanol per 1 ml Denaturing Solution) Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C. Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use. | |
**Extraction Buffer
100 mM Sodium phosphate buffer [pH 7.0]
100 mM Tris-HCl [pH 7.0]
100 mM EDTA [pH 8.0]
1.5 M NaCl
1% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB)
2% SDS
| Extraction Buffer for 1 L in total | |
| 1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]* | 100 ml |
| 1M Tris-HCl [pH 7.0] | 100 ml |
| 0.5M EDTA [pH 8.0] | 200 ml |
| 5 M NaCl | 300 ml |
| Autoclave and keep it at room temperature. | |
| Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C. * 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0 Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended. | |
References
- Hurt, R. A., Qiu, X., Wu, L., Roh, Y., Palumbo, A. V., Tiedje, J. M., Zhou, J. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments. AEM. 67 (10), 4495-4503 (2001).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA extraction from 0.22 μM Sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation. JoVE. , (2009).
- Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large insert environmental genomic library production. J Vis Exp. , (2009).
