Extractie met een hoog molecuulgewicht Genomic DNA uit bodems en sedimenten

Summary

Een methodiek om hoog moleculair gewicht en de hoge kwaliteit van genomisch DNA te isoleren uit de bodem microbiële gemeenschap wordt beschreven.

Abstract

De bodem microbioom is een groot en relatief onontgonnen reservoir van genomische diversiteit en metabole innovatie die nauw is verbonden met voedingsstoffen en energie stromen binnen terrestrische ecosystemen. Teelt-onafhankelijke milieu-genoom, ook wel bekend als metagenomic, benaderingen beloven een ongekende toegang tot deze genetische informatie met betrekking tot de pad wederopbouw en functionele screening voor hoogwaardige therapeutische en biomassa conversie processen. Echter, de bodem microbioom blijft nog steeds een uitdaging grotendeels te wijten aan de moeilijkheid bij het verkrijgen van een hoog moleculair gewicht DNA van voldoende kwaliteit zijn voor grote insert bibliotheek productie. Hier introduceren we een protocol voor de extractie van een hoog moleculair gewicht, microbiële gemeenschap genomisch DNA uit bodems en sedimenten. De kwaliteit van de geïsoleerde genomisch DNA is ideaal voor de aanleg van grote insert milieu genome bibliotheken voor downstream-sequencing en screening toepassingen.

De procedure begint met cel lysis. Celwanden en membranen van micro-organismen worden gelyseerd door zowel mechanische (slijpen) en chemische krachten (β-mercapto-ethanol). Genomisch DNA wordt vervolgens geïsoleerd met behulp extractiebuffer, chloroform-isoamylalcohol en isopropyl alcohol. De buffers gebruikt voor de lysis en de winning stappen omvatten guanidine isothiocyanaat en hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) om de integriteit van het hoge moleculair gewicht genomisch DNA te behouden. Afhankelijk van uw downstream toepassing, kan het geïsoleerde genomisch DNA verder worden gezuiverd met behulp van cesium chloride (CSCL) gradiënt ultracentrifugatie, die verontreinigingen, zoals humuszuren vermindert. De eerste procedure, extractie, duurt ongeveer acht uur, met uitzondering van DNA kwantificering stap. De CsCl gradiënt ultracentrifugatie, is een proces van twee dagen. Gedurende de gehele procedure, genomisch DNA moet voorzichtig behandeld worden om afschuiven te voorkomen, te vermijden ernstige vortexen, en repetitieve hard pipetteren.

Protocol

Deel I: Extractie van DNA Procedure 1. 8 uur nodig zijn, voor de verwerking van zes monsters met uitzondering van de kwantificering van DNA. Voordat u begint met de winning, dan moet u vooraf-chill mortier, de stamper en spatel in een -20 ° C vriezer of met behulp van vloeibare stikstof. Ook pre-chill 50 ml buisjes met 20 ml chloroform isoamylalcohol (24:1) op ijs. Zet de hybridisatie oven voor op 65 ° C te verwarmen….

Materials

Recipe

* Denaturing solution
4 M Guanidine isothiocyanate
10 mM Tris-HCl (pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% 2-mercaptoethanol

Denaturing solution: 10 ml in total
Guanidine isothiocyanate (MW 118.16)	4.73 g
1M Tris-HCl (pH 7.0)	100 μl
0.5M EDTA	20 μl
Add water to 9.95 ml in total.
Autoclave.
Add 50 μl 2-mercaptoethanol just before use. (5 μl of 2-mercaptoethanol per 1 ml Denaturing Solution) Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C.  Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use.

**Extraction Buffer
100 mM Sodium phosphate buffer [pH 7.0]
100 mM Tris-HCl [pH 7.0]
100 mM EDTA [pH 8.0]
1.5 M  NaCl
1% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB)
2% SDS

Extraction Buffer for 1 L in total
1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*	100 ml
1M Tris-HCl [pH 7.0]	100 ml
0.5M EDTA [pH 8.0]	200 ml
5 M NaCl	300 ml
Autoclave and keep it at room temperature.
Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C. * 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0 Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended.