उच्च आण्विक वजन जीनोमिक डीएनए के मृदा और निक्षेपों से निकालना

Summary

मिट्टी माइक्रोबियल समुदाय से उच्च आणविक भार और उच्च गुणवत्ता जीनोमिक डीएनए अलग पद्धति में वर्णित है.

Abstract

मिट्टी microbiome जीनोमिक विविधता और चयापचय नवीनता है कि परिचित पोषक तत्व और स्थलीय पारितंत्रों के भीतर ऊर्जा का प्रवाह के साथ जुड़ा हुआ है की एक विशाल और अपेक्षाकृत बेरोज़गार जलाशय है. खेती स्वतंत्र पर्यावरण जीनोमिक metagenomic रूप में भी जाना जाता है, दृष्टिकोण मार्ग और उच्च मूल्य चिकित्सीय और बायोमास रूपांतरण की प्रक्रिया के लिए कार्यात्मक स्क्रीनिंग पुनर्निर्माण करने के लिए सम्मान के साथ इस आनुवंशिक जानकारी के लिए अभूतपूर्व पहुँच वादा करता हूँ. हालांकि, मिट्टी microbiome अभी भी काफी हद तक बड़े डालने पुस्तकालय उत्पादन के लिए पर्याप्त गुणवत्ता की उच्च आणविक भार डीएनए प्राप्त करने में कठिनाई के कारण चुनौती बनी हुई है. यहाँ हम मिट्टी और अवसादों से उच्च आणविक भार है, माइक्रोबियल समुदाय जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए एक प्रोटोकॉल परिचय. अलग जीनोमिक डीएनए की गुणवत्ता बहाव के अनुक्रमण और स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों के लिए बड़े डालने पर्यावरण जीनोमिक पुस्तकालयों के निर्माण के लिए आदर्श है.

प्रक्रिया सेल lysis के साथ शुरू होता है. सेल दीवारों और रोगाणुओं की झिल्ली (पीस) यांत्रिक और रासायनिक दोनों बलों (β-mercaptoethanol) द्वारा lysed हैं. जीनोमिक डीएनए तो निष्कर्षण बफर, क्लोरोफॉर्म – isoamyl शराब और isopropyl शराब का उपयोग करने के लिए अलग है. lysis और निष्कर्षण कदम के लिए कार्यरत बफ़र्स guanidine आइसोथियोसाइनेट और hexadecyltrimethylammonium (CTAB) ब्रोमाइड उच्च आणविक भार जीनोमिक डीएनए की अखंडता की रक्षा शामिल हैं. अपने बहाव के आवेदन पर निर्भर करता है, अलग जीनोमिक डीएनए आगे सीज़ियम (CSCL) क्लोराइड ढाल ultracentrifugation है, जो कम कर देता है दोष humic एसिड सहित का उपयोग कर शुद्ध कर सकते हैं. पहली प्रक्रिया है, निकासी, डीएनए की मात्रा का ठहराव कदम को छोड़कर लगभग 8 घंटे लगते हैं. CSCL ढाल ultracentrifugation, एक दो दिन की प्रक्रिया है. पूरी प्रक्रिया के दौरान जीनोमिक डीएनए धीरे इलाज किया जाना चाहिए करने के लिए बाल काटना को रोकने के लिए, गंभीर vortexing बचने के लिए, और दोहराव कठोर pipetting.

Protocol

भाग मैं: डीएनए का निष्कर्षण प्रक्रिया 1. 8 घंटे, 6 डीएनए की मात्रा का ठहराव को छोड़कर नमूने के प्रसंस्करण के लिए आवश्यक हैं. इससे पहले कि आप निकासी शुरू, तुम पूर्व सर्?…

Materials

Recipe

* Denaturing solution
4 M Guanidine isothiocyanate
10 mM Tris-HCl (pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% 2-mercaptoethanol

Denaturing solution: 10 ml in total
Guanidine isothiocyanate (MW 118.16)	4.73 g
1M Tris-HCl (pH 7.0)	100 μl
0.5M EDTA	20 μl
Add water to 9.95 ml in total.
Autoclave.
Add 50 μl 2-mercaptoethanol just before use. (5 μl of 2-mercaptoethanol per 1 ml Denaturing Solution) Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C.  Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use.

**Extraction Buffer
100 mM Sodium phosphate buffer [pH 7.0]
100 mM Tris-HCl [pH 7.0]
100 mM EDTA [pH 8.0]
1.5 M  NaCl
1% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB)
2% SDS

Extraction Buffer for 1 L in total
1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*	100 ml
1M Tris-HCl [pH 7.0]	100 ml
0.5M EDTA [pH 8.0]	200 ml
5 M NaCl	300 ml
Autoclave and keep it at room temperature.
Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C. * 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0 Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended.