Utvinning av hög molekylvikt Genomiskt DNA från mark och sediment

Summary

En metod för att isolera med hög molekylvikt och hög kvalitet genomisk DNA från mark mikrobiella beskrivs.

Abstract

Marken microbiome är en stor och relativt outforskad reservoar av genomiska mångfald och metabola innovation som är intimt förknippad med närings-och energiflödet i terrestra ekosystem. Odling-oberoende miljö genomisk, även känd som metagenomic närmar lovar oöverträffad tillgång till denna genetisk information med avseende på väg återuppbyggnad och funktionell screening för högt värde terapeutiskt och biomassa omvandlingsprocesser. Dock fortfarande jorden microbiome fortfarande en utmaning stor del beror på svårigheten att få hög molekylvikt DNA av tillräckligt hög kvalitet för stora in-biblioteket produktion. Här presenterar vi ett protokoll för att utvinna hög molekylvikt, mikrobiella genomisk DNA från mark och sediment. Kvaliteten på isolerade arvsmassans DNA är idealisk för att bygga stora sätter miljö-genomiska bibliotek för nedströms sekvensering och screening program.

Förfarandet inleds med cell-lys. Cellväggar och membran av mikrober lyseras av både mekanisk (slipning) och kemiska krafter (β-merkaptoetanol). Genomisk DNA är då isoleras med hjälp av extraktionsbuffert, kloroform-Isoamyl alkohol och isopropylalkohol. De buffertar som används för lys och steg utvinning inkluderar guanidin isothiocyanat och hexadecyltrimethylammonium bromid (CTAB) för att bevara integriteten i hög molekylvikt arvsmassans DNA. Beroende på din nedströms ansökan kan de isolerade genomiska DNA renas ytterligare med hjälp av cesiumklorid (CsCl) gradient ultracentrifugering, som minskar föroreningar, särskilt humus. Det första förfarandet, extraktion, tar ca 8 timmar, med undantag av DNA-kvantifiering steg. Den CsCl lutning ultracentrifugering, är en två dagars process. Under hela förfarandet bör genomisk DNA behandlas varsamt för att förhindra klippning, undvika allvarliga vortexa och repetitiva hårda pipettering.

Protocol

Del I: Extraktion av DNA Förfarande 1. 8 timmar behövs, för beredning 6 prover utom kvantifiering av DNA. Innan du börjar utvinning, måste du pre-chill murbruk, mortel och stekspade i -20 ° C frys eller med hjälp av flytande kväve. Även pre-chill 50 ml rör som innehåller 20 ml kloroform Isoamyl alkohol (24:1) på is. Sätt hybridisering ugnen till 65 ° C till förvärmning. Kontrollera CTAB lösning, om det …

Materials

Recipe

* Denaturing solution
4 M Guanidine isothiocyanate
10 mM Tris-HCl (pH 7.0)
1 mM EDTA
0.5% 2-mercaptoethanol

Denaturing solution: 10 ml in total
Guanidine isothiocyanate (MW 118.16)	4.73 g
1M Tris-HCl (pH 7.0)	100 μl
0.5M EDTA	20 μl
Add water to 9.95 ml in total.
Autoclave.
Add 50 μl 2-mercaptoethanol just before use. (5 μl of 2-mercaptoethanol per 1 ml Denaturing Solution) Note: Keep the Denaturing solution at 4 °C.  Do not use buffer older than one week. If possible, make fresh buffer to use.

**Extraction Buffer
100 mM Sodium phosphate buffer [pH 7.0]
100 mM Tris-HCl [pH 7.0]
100 mM EDTA [pH 8.0]
1.5 M  NaCl
1% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB)
2% SDS

Extraction Buffer for 1 L in total
1M Sodium phosphate buffer [pH 7.0]*	100 ml
1M Tris-HCl [pH 7.0]	100 ml
0.5M EDTA [pH 8.0]	200 ml
5 M NaCl	300 ml
Autoclave and keep it at room temperature.
Add 200ml, 5% Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB, autoclaved) and 100 ml, 20% SDS (autoclaved) just before use. If CTAB was crystallized, melt it at 60 °C. * 1M Sodium phosphate buffer: 57.7 ml, 1M Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) and 42.3 ml, 1M Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4). Adjust pH to 7.0 Note: Do not use 20 % SDS if it has precipitation. It is normal to see milky suspension when you add SDS to the solution. Once you add SDS, place the extraction buffer at 60 °C to ensure SDS is well suspended.