COS-7 के फ्लोरोसेंट लेबलिंग लाइव सेल इमेजिंग के लिए तस्वीर टैग फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त

Summary

तस्वीर टैग और क्लिप टैग प्रोटीन लेबलिंग प्रणाली विशिष्ट, फ्लोरोसेंट रंजक सहित अणु, के सहसंयोजक लगाव सक्षम जीवित कोशिकाओं में ब्याज की एक प्रोटीन के लिए. एक बार क्लोन और व्यक्त की, टैग प्रोटीन फिर क्लोन करने के लिए बिना कई बहाव के अनुप्रयोगों के लिए substrates के एक किस्म के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

तस्वीर टैग और क्लिप टैग प्रोटीन लेबलिंग प्रणाली विशिष्ट, फ्लोरोसेंट रंजक सहित अणु, के सहसंयोजक लगाव सक्षम जीवित कोशिकाओं में ब्याज की एक प्रोटीन के लिए. इन प्रणालियों फ्लोरोसेंट इमेजिंग उपकरण एक श्रृंखला के लिए अनुकूलित substrates के एक व्यापक चयन की पेशकश करते हैं. एक बार क्लोन और व्यक्त की, टैग प्रोटीन फिर क्लोन करने के लिए बिना कई बहाव के अनुप्रयोगों के लिए substrates के एक किस्म के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रणाली का उपयोग करने के लिए दो कदम हैं: क्लोनिंग और ब्याज की एक संलयन तस्वीर टैग, और तस्वीर टैग पसंद के सब्सट्रेट के साथ विलय की लेबलिंग के रूप में प्रोटीन की अभिव्यक्ति. स्नैप – टैग एक छोटे से मानव हे पर आधारित प्रोटीन है<sup6></sup(HAGT)> alkylguanine – डीएनए alkyltransferase, एक डीएनए की मरम्मत प्रोटीन. स्नैप – टैग लेबल guanine संयुग्मित लोबान linker के माध्यम से या रंजक chloropyrimidine छोड़ने समूहों रहे हैं. लेबलिंग प्रतिक्रिया में, प्रतिस्थापित सब्सट्रेट के लोबान समूह covalently तस्वीर टैग से जुड़ी है. क्लिप टैग स्नैप टैग की एक संशोधित संस्करण है, बजाय benzylcytosine benzylguanine डेरिवेटिव के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए इंजीनियर है. जब तस्वीर टैग के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया, क्लिप टैग दो प्रोटीन की orthogonal और पूरक लेबलिंग के साथ सक्षम बनाता है एक ही कोशिकाओं में.

Protocol

चो – K1 कक्ष चढ़ाना: चो K1 कोशिकाओं है कि एफ 12K पूरा 6ml के लिए मानक प्रोटोकॉल के अनुसार trypsinized किया गया है के 50 100μl जोड़ें. ऊपर और नीचे pipetting कई बार सेल निलंबन मिक्स, तब विभाज्य trypsinized सेल निलंबन के 300 # borosilicate coverglass (कक्षों 1.5 के साथ एक बाँझ 8 कक्ष लैब टेक द्वितीय संभाग coverglass के प्रत्येक अच्छी तरह μl Nalgene Nunc Int, उत्पाद 155409 #; लूत: 100808-8-0). 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ रातोंरात 2 नमूने सेते हैं. PSNAP ADRB2 और pSNAP – H2B साथ चो K1 कक्ष के क्षणिक अभिकर्मक: पिछले दिन पर वरीयता प्राप्त सेल घनत्व और स्वास्थ्य के लिए देखने के लिए सेल संस्कृति कक्षों की जाँच करें. Microfuge ट्यूबों के उपयुक्त संख्या लेबल. एक लामिना का प्रवाह हुड में स्थापित अभिकर्मक जटिल मिश्रण निम्न नमूना चार्ट के अनुसार, या तो 0.3 μg pSNAP ADBR2 नियंत्रण डीएनए प्लाज्मिड या pSNAP – H2B नियंत्रण डीएनए प्लाज्मिड, TransPass डी 2 की 1 μl और TransPass वी के एक μl 0.3 μg का उपयोग प्रतिक्रिया प्रति. प्लाज्मिड प्रतिक्रियाओं की संख्या सीरम मुक्त माध्यम के μl TransPass D2 के μl TransPass वी के μl प्लाज्मिड डीएनए के μl TransPass D2/reaction के μl TransPass वी / प्रतिक्रिया की μl डीएनए / प्रतिक्रिया की एनजी सान्द्र डीएनए. (एनजी / μl) प्लास्मिड डीएनए / प्रतिक्रिया की μl स्नैप – ADRb2 5 236.5 5 5 3.5 1 1 300 472.34 0.7 H2B – तस्वीर 5 237 5 5 3 1 1 300 515.89 0.6 कृत्रिम 5 240 5 5 0 1 1 0 0 0 Untransfected 5 250 0 0 0 0 0 0 0 0 पहले मिश्रण उपयुक्त प्लास्मिड डीएनए के साथ सीरम एफ 12K मुक्त, तब TransPass D2 अभिकर्मक अभिकर्मक जोड़ते हैं, तो TransPass वी अभिकर्मक अभिकर्मक जोड़ें. घटकों pipetting और नीचे धीरे से प्रत्येक अभिकर्मक के अलावा के बाद कई बार अच्छी तरह से मिलाएं. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया सेते हैं. ऊष्मायन के दौरान, कोशिकाओं को एक बार और पूरा DMEM के 600 μl साथ धो प्रत्येक नमूना पूरा DMEM के 450 μl जोड़ने. प्रत्येक नमूने के अभिकर्मक जटिल मिश्रण के 50 μl जोड़ें, धीरे धीरे और ड्रॉप – वार एक फैशन में. 37 पर रातोंरात नमूनों डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 सेते हैं. तस्वीर सेल चो K1 transiently pSNAP ADRB2 और pSNAP – H2B साथ ट्रांसफ़ेक्ट कक्ष के TMR स्टार लेबल: ध्यान से प्रत्येक नमूने से वैक्यूम चूषण द्वारा अभिकर्मक जटिल मीडिया को हटा दें. कोशिकाओं को 600 एफ 12K पूरा μl के साथ दो बार धो लें और 600 एफ 12K पूरा μl के साथ प्रत्येक कुएं में मीडिया की जगह. पूरा एफ 12K और 51 μl 0.6 मिमी तस्वीर सेल सब्सट्रेट TMR-स्टार के 995 μl जोड़कर डाई लेबलिंग मीडिया मिक्स. तस्वीर सेल TMR-स्टार के अंतिम एकाग्रता 3mm होना चाहिए. ऊपर और नीचे कई बार पिपेट सब्सट्रेट के अलावा के बाद मिश्रण. ध्यान नमूनों से विकास मीडिया को हटाने और एक अच्छी तरह से डाई लेबलिंग मीडिया के 200 μl जोड़ने. 37 में नमूने सेते डिग्री सेल्सियस, 5% से 30 मिनट के लिए सीओ 2. पूरा एफ-12K के 10 मिलीलीटर में, जबकि नमूनों incubating हैं, नमूने के परमाणु धुंधला के लिए Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate (Invitrogen आण्विक जांच / 10 मिलीग्राम पानी में मिलीलीटर समाधान, 16.2 मिमी समाधान) 1 μl मिश्रण से 33342 Hoechst समाधान तैयार . सभी नमूनों से मीडिया निकालें और पतला Hoechst प्रत्येक नमूने के समाधान के 600 μl जोड़ें. 37 में नमूने सेते डिग्री सेल्सियस, 5% 5 मिनट के लिए सीओ 2. नमूने एफ 12K पूरा 600 μl के साथ तीन बार धोएं. 37 पर नमूने सेते डिग्री सेल्सियस, 5% एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए सीओ 2 अनिगमित fluorophore कोशिकाओं से बाहर फैलाना करने की अनुमति . 30 मिनट के बाद, तस्वीर सेल एक आखिरी बार के नमूने पर मीडिया को बदलने और इमेजिंग के लिए आगे बढ़ना. छवि Zeiss Apotome Axiovert 200M फ्लोरोसेंट खुर्दबीन का उपयोग कोशिकाओं. प्रतिनिधि परिणाम 1 चित्रा यहाँ हैं.फ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग रहते COS-7 कोशिकाओं कि स्नैप – टैग fusions व्यक्त कर रहे हैं के मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के कुछ प्रतिनिधि परिणाम है. यह पहली छवि रहते COS-7 (परमाणु histone) pSNAP H2B तस्वीर सेल TMR-स्टार के साथ लेबल व्यक्त कोशिकाओं से पता चलता है. pSNAP H2B निर्माण pSNAP टैग वेक्टर (एम) का उपयोग कर उत्पन्न किया गया. कोशिकाओं तस्वीर सेल 30 मिनट के लिए TMR-स्टार के साथ लेबल रहे थे और नाभिक के लिए 33342 Hoechst (नीला) के साथ counterstained. गुलाबी प्रतिदीप्ति लाल प्रतिदीप्ति के उपरिशायी जहां histone प्रोटीन नीले रंग प्रतिदीप्ति संकेत नाभिक के अलावा में मौजूद है दर्शाता है. H2B प्रोटीन की अभिव्यक्ति स्पष्ट रूप से और आसानी से पहचाना जाता है. 2 और 3 के आंकड़े ये अगले दो छवियों. रहते COS-7 कोशिकाओं transiently pSNAP ADRβ2 साथ ट्रांसफ़ेक्ट दिखा. कक्ष तस्वीर सेल TMR स्टार (लाल) के साथ लेबल रहे थे और 33342 Hoechst (नीला) के साथ counterstained. pSNAP ADRβ2 निर्माण pSNAP टैग वेक्टर (एम) का उपयोग कर उत्पन्न किया गया. कोशिकाओं तस्वीर सेल 30 मिनट के लिए TMR-स्टार के साथ लेबल रहे थे और नाभिक के लिए 33342 Hoechst (नीला) के साथ counterstained. लाल प्रतिदीप्ति कोशिका की सतह रिसेप्टर प्रोटीन ADRB2 की उपस्थिति इंगित करता है जबकि नीले रंग प्रतिदीप्ति नाभिक को पहचानती है.

Discussion

वहाँ कई चर रहे हैं ध्यान देते हैं, लेजर तीव्रता, उपकरण क्षमताओं लेंस का इस्तेमाल किया, आदि जैसे मनाया परिणाम की fluorophore photostability निर्धारित करता है कि कैसे जल्दी से प्रतिदीप्ति लुप्त होती पहले कब्जा कर लिया होना चाहिए प्रभावित.

प्रोटीन लेबलिंग की यह विधि बहुमुखी है और कई अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है. सिंथेटिक जांच के साथ संलयन प्रोटीन की विशिष्ट लेबलिंग के लिए तस्वीर टैग और क्लिप टैग प्रौद्योगिकी प्रोटीन समारोह के जीवित कोशिकाओं में और सेल lysates में गतिशील प्रक्रियाओं की एक किस्म सहित विभिन्न पहलुओं, सक्षम हैं. स्नैप, क्लिप, MCP-और एसीपी – टैग प्रौद्योगिकियों रहते हैं और तय कोशिकाओं में प्रोटीन की इमेजिंग के लिए और प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो में सादगी और असाधारण बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करते हैं. एक जीन का निर्माण के निर्माण के एक टैग संलयन fluorophores, बायोटिन, या मोती सहित कार्य समूहों की एक किस्म के लिए एक सहसंयोजक उठाना बनाने के सक्षम प्रोटीन पैदावार. ब्याज की प्रोटीन और क्लोन किया जाना चाहिए व्यक्त की केवल एक बार और फिर संलयन फ्लोरोसेंट substrates के एक किस्म के साथ जीवित कोशिकाओं के अंदर एक साथ प्रोटीन लेबलिंग, प्रोटीन स्थानीयकरण और स्थानान्तरण, नाड़ी – पीछा प्रयोगों, रिसेप्टर internalization अध्ययन जैसे कई बहाव के अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है चयनात्मक कोशिका की सतह लेबलिंग, प्रोटीन नीचे खींच assays, एसडीएस पृष्ठ, प्रवाह cytometry, microtiter प्लेट, biosensor बातचीत प्रयोगों में उच्च throughput बाध्यकारी assays में प्रोटीन का पता लगाने, और झल्लाहट आधारित बाध्यकारी assays.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
CHO-K1 Cells		ATCC	CCL-61
Serum free F-12K
Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers		Nalgene Nunc Int.	155409	Lot: 100808-8-0
DMEM
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution)		Invitrogen Molecular Probes	H3570	470519
Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope		Zeiss
Transpass V		New England Biolabs	M2561S	0030709
Transpass D2		New England Biolabs	M2554S	0060802
SNAP-Cell TMR Star		New England Biolabs	S9105S	0010811
pSNAP-ADBR2 Control Plasmid		New England Biolabs	N9178S	0010811
pSNAP-H2B Control Plasmid		New England Biolabs	N9179S	0010811